建立PCR實驗室的基本條件

建立PCR實驗室的基本條件臨床基因擴增實驗室采用PCR技術(shù)用于臨床基因診斷，由于PCR技術(shù)對所檢測的核酸模板進行大量擴增，容易出現(xiàn)實驗室污染導(dǎo)致臨床檢測標(biāo)本假陽性結(jié)果；另外由于PCR技術(shù)要求高、影響因素多（特別是RNA標(biāo)本），實驗過程處理不當(dāng)易導(dǎo)致核酸模板無擴增現(xiàn)象，導(dǎo)致臨床標(biāo)本假陰性結(jié)果。因此臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)驗收和規(guī)范化管理是PCR技術(shù)本身需要，也是在臨床上順利應(yīng)用該技術(shù)前提。二、PCR實驗室驗收準(zhǔn)備工作（一）硬件準(zhǔn)備——實驗室基本建設(shè)1.根據(jù)文件要求，臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)；擴增產(chǎn)物分析區(qū)，如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。2.各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。3.進入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一流向進行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。4.不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。5.工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)?試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)2～8℃和-15℃冰箱：混勻器；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。?標(biāo)本制備區(qū)2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速臺式冷凍離心機；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；超凈工作臺，消耗品；一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。?擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)核酸擴增儀；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。?擴增產(chǎn)物分析區(qū)視檢測方法不同而定?；緝x器設(shè)備如下：微量加樣器（覆蓋1～200μl）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（二）軟件建設(shè)——質(zhì)量手冊編寫與實施、人才資源（上崗證培訓(xùn)與相關(guān)知識學(xué)習(xí)）1.臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量手冊編寫質(zhì)量手冊是闡明臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量方針，并描述過其質(zhì)量體系的文件。質(zhì)量手冊規(guī)定了質(zhì)量體系的基本結(jié)構(gòu)，是實施和保持質(zhì)量體系應(yīng)長期遵循的文件。臨床基因擴增檢驗實驗室質(zhì)量手冊編寫應(yīng)依照衛(wèi)生部下發(fā)兩個文件，并結(jié)合本實驗室實際情況編寫適合本實驗室的切實可行的質(zhì)量手冊。質(zhì)量手冊的提綱應(yīng)包括三部分：質(zhì)量方針和宗旨；工作制度；標(biāo)準(zhǔn)操作文件（SOP）（1）質(zhì)量方針和宗旨制定臨床基因擴增檢驗實驗室的質(zhì)量管理目標(biāo)和質(zhì)量保證體系的結(jié)構(gòu)體系和總方針。（2）工作制度一般應(yīng)包括以下文件：實驗室的設(shè)置、布局及組織結(jié)構(gòu)；實驗室內(nèi)務(wù)管理制度；實驗室的人員配置及管理制度；生物的防護與安全制度；實驗室廢棄物處理制度；實驗室清潔消毒制度；儀器設(shè)備的管理制度；儀器、試劑、耗材購置程序及管理制度；臨床標(biāo)本的管理制度；實驗室記錄的管理制度；質(zhì)量控制工作管理制度；結(jié)果報告管理制度；抱怨的內(nèi)部處理制度；負責(zé)人及質(zhì)檢員職責(zé)；崗位設(shè)置和責(zé)任制等……（3）標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）一般包括：消毒液配制標(biāo)準(zhǔn)操作程序：消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序；超凈工作臺使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；超凈工作臺維護和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作文件；PCR儀使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；PCR儀維護和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；高速低溫離心機使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；移液器使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；冰箱維護和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；電熱恒溫水浴箱操作程序；電子天平使用和校正操作程序；可移動紫外消毒車使用操作程序；加樣器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；離心機維護保養(yǎng)操作程序；溫度計校準(zhǔn)程序；試劑的質(zhì)檢操作程序；標(biāo)本唯一標(biāo)識編號編制規(guī)則；臨床標(biāo)本的采集及處理操作程序；臨床標(biāo)本的保存程序；乙肝病毒核酸擴增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序；丙肝病毒核酸擴增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序；結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序；沙眼衣原體核酸擴增熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序等……（4）引用圖表：PCR擴增可接受標(biāo)本記錄表；PCR擴增拒收標(biāo)本記錄表；室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果記錄表；室間質(zhì)控記錄表；消耗性材料驗收記錄表；試劑驗收記錄表；故障處理表；臺階式高速離心機使用記錄表；臺式高速冷凍離心機使用記錄表；擴增儀維護保養(yǎng)記錄表；人員培訓(xùn)計劃及培訓(xùn)記錄表；實驗室工作人員一覽表；主要設(shè)備一覽表；實驗室清潔消毒記錄表；工作區(qū)溫度、濕度記錄表；抱怨記錄表；標(biāo)本超低溫保存記錄表；應(yīng)急處理記錄表；垃圾處理記錄表；冰箱溫度記錄表；水浴箱溫度記錄表；移動紫外消毒車記錄表；設(shè)備校正記錄表；檢測結(jié)果報告流程；報告單樣張；臨床送檢標(biāo)本流程圖；實驗室組織結(jié)構(gòu)圖。為了對以個特定序列進行PCR做重復(fù)檢測,需要三個不同的區(qū)域,每一個區(qū)域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細列出.1、樣品準(zhǔn)備區(qū)這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施：1）PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。2）組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。3）用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。4）DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。5）大體積樣品應(yīng)該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。6）管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。7）任何時候都應(yīng)該穿實驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCRRNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道。3、前PCR區(qū)必須有專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。4、PCR實驗室試劑的操作1）所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。2）所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。3）在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應(yīng)。4）所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。5）所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。6）新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗。7）樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。2）如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。3）作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。4）陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。5）當(dāng)做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。6）由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點應(yīng)該予以考慮。6、控制污染的方法已設(shè)計出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。7、PCR儀的位置8、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。?熒光定量PCR實驗室所需儀器設(shè)備清單（衛(wèi)生部推薦）序號儀器設(shè)備、輔助材料名稱放置地點1冰箱試劑準(zhǔn)備區(qū)2紫外線消毒燈試劑準(zhǔn)備區(qū)3混勻器試劑準(zhǔn)備區(qū)4可調(diào)式移液器（1-10μl），(5-40ul)，(20-200ul)一套三把試劑準(zhǔn)備區(qū)5高速臺式離心機試劑準(zhǔn)備區(qū)6專用工作服和衣柜試劑準(zhǔn)備區(qū)7冰箱樣品準(zhǔn)備區(qū)8紫外線消毒燈樣品準(zhǔn)備區(qū)9生物安全柜B2級樣品準(zhǔn)備區(qū)10冷凍高速離心機（丙肝專用）樣品準(zhǔn)備區(qū)11恒溫金屬浴樣品準(zhǔn)備區(qū)12混勻器樣品準(zhǔn)備區(qū)13可調(diào)式移液器(5-40ul)，(20-200ul)，(200-1000ul)一套樣品準(zhǔn)備區(qū)14專用工作服和衣柜樣品準(zhǔn)備區(qū)15紫外線消毒燈PCR擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)16可調(diào)式移液器（1-10μl），(5-40ul)，(20-200ul)一套PCR擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)17專用工作服和衣柜PCR擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)18熒光定量PCR檢測儀PCR擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)?所有四區(qū)均需準(zhǔn)備的儀器設(shè)備為：專用工作服和工作鞋專用辦公用品一次性手套、一次性吸水紙可移動紫外燈（近工作臺面）微量加樣器一套（覆蓋1~1000ul）以上物品各一套?！裨噭┵A存和準(zhǔn)備區(qū)2~8℃和-15℃冰箱混勻器（可加熱）耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭