基因治療(生物化學(xué))省公開課一等獎全國示范課微課金獎

基因治療基因治療（genetherapy）是向靶細(xì)胞導(dǎo)入外源基因，以糾正或賠償基因缺點，到達(dá)治療遺傳病目標(biāo)。人類遺傳疾病5000各種，基本上不可能用常規(guī)方法治療。個別病例只能對癥療法，減輕癥狀，不能治愈。基因治療可能是唯一方法。1990年美國重組DNA咨詢委員會同意治療腺苷脫氨酶（ADA）臨床治療方案，2個病例癥狀改進(jìn)。1991年復(fù)旦大學(xué)與二軍大學(xué)合作用基因療法治療血友病B，患者癥狀有所改進(jìn)1第1頁一、基因治療類型

1.基因調(diào)控治療從基因水平調(diào)控缺點基因表示，改進(jìn)癥狀鐮型細(xì)胞貧血癥---用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而關(guān)閉γ基因重新開放，產(chǎn)生HbF代替HbA用反義RNA抑制基因表示核酶（ribozyme）切割RNA阻斷基因表示腫瘤治療，在基因水平抑制腫瘤細(xì)胞基因惡性表示和引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)。2第2頁基因治療類型（續(xù)）2.基因矯正治療

基因增補—正?；?qū)牖颊唧w內(nèi)賠償缺點基因功效基因替換—以正?；蛉〈儺惢蚧蛐Ｕw外對異?；蜻M(jìn)行糾正。3第3頁基因治療類型（續(xù)）按矯正基因類型分為兩種基因治療：

·生殖細(xì)胞基因治療—對生殖細(xì)胞或早期胚胎細(xì)胞進(jìn)行基因矯正。

·體細(xì)胞基因治療—以體細(xì)胞為受體細(xì)胞，不影響下一代慣用細(xì)胞介導(dǎo)法：選擇靶細(xì)胞在體外進(jìn)行基因修飾，再將其輸入體內(nèi)。4第4頁基因置換（genereplacement）

定義：將特定目標(biāo)基因?qū)胩囟?xì)胞，經(jīng)過定位重組，導(dǎo)入正?；?，以置換基因組內(nèi)原有缺點基因。

目標(biāo)：將缺點基因異常序列進(jìn)行橋正。對缺點基因缺點部位進(jìn)行準(zhǔn)確原位修復(fù)，不包括基因組任何改變。5第5頁定向整合條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因載體與基因組DNA含有相同序列。帶有目標(biāo)基因載體就能找到同源重組位點，進(jìn)行部分基因序列交換。基因同源重組技術(shù)又稱為基因打靶(genetargeting）細(xì)胞內(nèi)基因同源重組發(fā)生率很低。基因同源重組技術(shù)6第6頁基因增補（geneaugmentation）

定義:經(jīng)過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表示其本身不表示基因。類型:有缺點基因細(xì)胞中導(dǎo)入正?；?，而細(xì)胞內(nèi)缺點基因并未除去，經(jīng)過導(dǎo)入正常基因表示產(chǎn)物，賠償缺點基因功效；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞原來不表示基因，利用其表示產(chǎn)物到達(dá)治療疾病目標(biāo)。7第7頁基因干預(yù)（geneinterference）基因失活

定義：采取特定方式抑制某個基因表示，或者經(jīng)過破壞某個基因結(jié)構(gòu)而使之不能表示，以到達(dá)治療疾病目標(biāo)。8第8頁（一）反義RNA（antisenseRNA）

1.反義RNA與基因表示調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行基因表示調(diào)控，通常采取方法有兩種：

（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義RNA重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。9第9頁反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù)①受體介導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；②被轉(zhuǎn)移RNA是被保護(hù)，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸保護(hù)層,能夠抵抗環(huán)境中核酸酶降解作用。借助前述受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法，能夠?qū)崿F(xiàn)受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移。10第10頁反義RNA優(yōu)點

受體介導(dǎo)反義RNA基因治療有其本身優(yōu)點，而在一定程度上補充了轉(zhuǎn)基因治療不足。

（l）安全性高（2）反義RNA設(shè)計和制備方便

（3）含有劑量調(diào)整效應(yīng)

（4）能直接作用于一些RNA病毒11第11頁核酶(ribozyme)

天然核酶多為單一RNA分子，含有自我剪切作用。但核酶也能夠由兩個RNA分子組成。在基因治療時，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)部位，形成錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，經(jīng)過破壞靶RNA分子而到達(dá)治療疾病目標(biāo)。

12第12頁核酶錘頭狀二級、三級結(jié)構(gòu)只要兩個RNA分子經(jīng)過互補序列相結(jié)合，形成錘頭狀二級結(jié)構(gòu)（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶關(guān)鍵序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。目錄13第13頁1.核酶設(shè)計核酶是經(jīng)過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設(shè)計核酶。

（1）選擇適當(dāng)靶部位，該部位含有核酶切割位點，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。（2）核酶基本組成：用于基因治療核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。14第14頁干擾RNA

1.RNA干擾現(xiàn)象RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一個由雙鏈RNA誘發(fā)基因緘默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因表示。有義RNA（senseRNA）或反義RNA（antisenseRNA）均能抑制線蟲基因表示，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)解釋恰好相反。而且其抑制基因表示效率比反義RNA最少高2個數(shù)量級。

15第15頁2.RNA干擾機制

RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)一些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)緘默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。16第16頁研究基因功效新工具

因為RNA干擾技術(shù)含有高度序列專一性和有效干擾能力，能夠使特定基因緘默或功效喪失，所以能夠作為功效基因組學(xué)一個強有力研究工具。

RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動物中抑制特定基因表示，建立各種表型；抑制基因表示時間能夠控制在發(fā)育任何階段。

17第17頁1.體外化學(xué)合成;2.用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA產(chǎn)生18第18頁定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼酶能使無毒性藥品前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而到達(dá)去除腫瘤細(xì)胞目標(biāo)。應(yīng)用：是惡性腫瘤基因治療主要方法。（四）自殺基因治療(SuicideGeneTherapy)19第19頁

（五）基因免疫調(diào)整經(jīng)過將抗癌免疫增強細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中抗癌免疫反應(yīng)。20第20頁二、基因治療條件

·對導(dǎo)入基因及其產(chǎn)物有詳盡了解；

·外源基因有效導(dǎo)入受體細(xì)胞、穩(wěn)定整合、適量表示；

·不影響受治細(xì)胞基因組及表示調(diào)控；

導(dǎo)入基因方法安全，載體對靶細(xì)胞無害；21第21頁三、基因治療標(biāo)準(zhǔn)對象是病情嚴(yán)重、預(yù)后差、別無他法患者轉(zhuǎn)移基因被克隆無需高水平表示和準(zhǔn)確定量控制就有治療效果靶細(xì)胞獲取或回輸安全轉(zhuǎn)移基因表示對細(xì)胞微環(huán)境無嚴(yán)格特異性要求22第22頁四、基因療法步驟

目標(biāo)（治療）基因選擇依據(jù)基因治療類型選擇對應(yīng)目標(biāo)基因（增補、替換、添加）基因載體構(gòu)建使目標(biāo)基因在受體細(xì)胞內(nèi)高效、可控、穩(wěn)定地表示

受體細(xì)胞選擇易分離獲取，體外增殖存活，大量擴增。如成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞23第23頁

基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)方法

1.病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移2.非病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移24第24頁

1.病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移效率較高據(jù)統(tǒng)計，有72%臨床試驗計劃和71%病例使用了病毒載體，其中用得最多是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。25第25頁反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)及生活周期（1）反轉(zhuǎn)錄病毒

26第26頁

（2）腺病毒(adenovirus)載體

經(jīng)過受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。腺病毒是人類呼吸道感染病原體，還未發(fā)覺與腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)。27第27頁慣用基因治療載體

整合致病性感染細(xì)胞克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機整合，效率高可能致病分裂細(xì)胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞

腺相關(guān)病毒載體定點整合(19號染色體特定區(qū)域)不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞<5kb<7.5kb28第28頁2.非病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。基本原理:

利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可形成包埋外源DNA脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目標(biāo)基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表示。

29第29頁（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)

將DNA與細(xì)胞或組織親和性配體偶聯(lián)，可使DNA含有靶向性。這種偶聯(lián)通常經(jīng)過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又經(jīng)過電荷相互作用與帶負(fù)電荷DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這么形成復(fù)合物可被帶有特異性受體靶細(xì)胞吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。30第30頁

（3）基因直接注射技術(shù)

不需要進(jìn)行基因工程繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動物肌肉或一些器官組織內(nèi)。動物試驗表明：接收注射外源DNA小鼠能夠按其基因編碼合成對應(yīng)蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。

將促進(jìn)心臟血管生長基因直接注入試驗鼠心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺乏胰島素；肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需凝血因子Ⅸ。31第31頁

基因直接注射法優(yōu)點制備含有調(diào)控部件質(zhì)粒DNA重組體技術(shù)較輕易；排除病毒載體可能潛在致癌性或其它副作用；導(dǎo)入基因不需整合即可表示，防止了反轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)缺點；基因直接注射法可重復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使重復(fù)治療效果下降。

32第32頁五、基因治療應(yīng)用治療惡性腫瘤

治療黑色素瘤--將已導(dǎo)入IL2基因TIL細(xì)胞回輸給病人，開啟本身免疫治療艾滋病--用射線照射已導(dǎo)入HIV基因成纖維細(xì)胞，細(xì)胞停頓分化，但能產(chǎn)生gp160，將細(xì)胞回輸給病人，能激活免疫系統(tǒng)，殺傷HIV感染細(xì)胞。治療家族性高膽固醇血癥（FH）

肝細(xì)胞低密度脂蛋白（LDL）受體基因混亂造成，將LDL基因?qū)氩∪穗x體培養(yǎng)肝細(xì)