保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法 高效液相色譜法 征求意見(jiàn)稿

1GB/TXXXXX—XXXX保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定本文件描述了保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法。本文件適用于片劑、硬膠囊、軟膠囊、口服液、酒劑等劑型形態(tài)保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1大豆異黃酮soybeanisoflavone大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素6種黃酮類物質(zhì)的總稱。4原理試樣經(jīng)80%甲醇溶液提取、過(guò)濾后，經(jīng)高效液相色譜(烷基鍵合的表面多孔型反向色譜柱）分離、紫外檢測(cè)器檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。5試劑和材料除非另有規(guī)定，僅使用色譜純?cè)噭?.1試劑5.1.1水，按GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1.2乙腈（CH3CN）。5.1.3甲醇（CH3OH）。5.1.4二甲基亞砜（C2H6OS）。5.2試劑配制5.2.180%甲醇溶液：量取800mL甲醇（5.1.3），加水稀釋至1000mL，混勻。5.2.20.01%磷酸水溶液：吸取0.1mL磷酸，加水稀釋至1000mL，混勻。2GB/TXXXXX—XXXX5.2.350%甲醇溶液：量取50mL甲醇（5.1.3），加水稀釋至100mL，混勻。5.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品5.3.1大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品（C21H20O9,CAS:552-66-9）標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品。5.3.2黃豆黃苷標(biāo)準(zhǔn)品（C22H22O10,CAS:40246-10-4）標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品。5.3.3染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品（C21H20O10,CAS:529-59-9）標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品。5.3.4大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品（C15H10O4,CAS:486-66-8）標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品。5.3.5黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)品（C16H12O5,CAS:40957-83-3）標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品。5.3.6染料木素標(biāo)準(zhǔn)品（C15H10O5,CAS:446-72-0）標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000μg/mL）精密稱取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素各約25mg，分別置于25mL棕色容量瓶中，加入5mL~15mL二甲基亞砜（5.1.4）超聲至充分溶解，用甲醇定容至刻度，混勻，使?jié)舛燃s為1000μg/mL。在4℃冰箱中貯存，有效期3個(gè)月。5.4.2大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別精密移取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷三種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.4.1）各2.5mL，精密移取大豆苷元、黃豆黃素、染料木素三種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.4.1）各0.5mL于10mL容量瓶中混合，用甲醇定容至刻度，混勻。該大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷濃度分別約為250μg/mL，大豆苷元、黃豆黃素、染料木素濃度分別約為50μg/mL。在4℃冰箱中貯存，有效期3個(gè)月。5.4.3大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.4.2）0.2mL、2.0mL、4.0mL、10.0mL、20.0mL，用50%甲醇溶2.0μg/mL、4.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL。5.5材料5.5.1微孔濾膜：0.45μm，有機(jī)相。6儀器和設(shè)備6.1高效液相色譜儀：帶紫外檢測(cè)器或相當(dāng)者。6.2超聲波清洗器。6.3分析天平：感量0.1mg。6.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。3GB/TXXXXX—XXXX6.5高速粉碎機(jī)。7分析步驟7.1試樣制備a）固體（硬膠囊、片劑等）：取不少于20粒或不少于10g樣品，硬膠囊取內(nèi)容物，必要時(shí)經(jīng)高速粉碎機(jī)或研缽磨成粉狀，封存?zhèn)溆?；b）半固體（軟膠囊）：取不少于20?；虿簧儆?0g樣品，剪開(kāi)，擠出內(nèi)容物，研細(xì)（必要時(shí)）混勻；c）液體（口服液、酒劑）：取5支獨(dú)立包裝樣品（如有），混合均勻，試樣測(cè)定前振搖混勻。7.2試樣處理7.2.1固體樣品、半固體樣品精密稱取樣品0.1g～0.5g(精確至0.1mg)，置于50mL具塞離心管中，加入80%甲醇溶液（5.2.1）40mL，混合均勻后震蕩10min，超聲提取20min，冷卻至室溫，將試樣溶液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中。用80%甲醇溶液（5.2.1）沖洗離心管，將全部洗滌液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，并用80%甲醇溶液（5.2.1）定容。取適量溶液置于離心管中，8000r/min離心5min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾（建議棄初濾液1mL以上），備用。7.2.2液體樣品精密移取混勻的液體樣品1.0mL~5.0mL于50mL具塞離心管中，加入80%甲醇溶液（5.2.1）40mL，混合均勻后震蕩10min，超聲提取20min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中。用80%甲醇溶液（5.2.1）沖洗離心管，全部洗滌液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，并用80%甲醇溶液（5.2.1）定容。取適量溶液置于離心管中，8000r/min離心5min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾（建議棄初濾液1mL以上備用。注：酒劑等能與80%甲醇溶液(5.2.1)完全混溶的樣品，可不經(jīng)過(guò)震蕩、超聲提取和離心操作。7.3色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：烷基鍵合的表面多孔型反向色譜柱（4.6×250mm×5μm），或等效色譜柱；b)流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.01%磷酸水溶液(5.2.2)，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；c)流速：1.0mL/min；d)波長(zhǎng)：260nm；e)進(jìn)樣量：10μL；f)柱溫：30℃。表1梯度洗脫條件時(shí)間/min02360流動(dòng)相A/%24流動(dòng)相B/%207.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作4GB/TXXXXX—XXXX將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液由低濃度到高濃度依次注入液相色譜儀中，測(cè)定各組分相應(yīng)的峰面積（標(biāo)品色譜圖見(jiàn)附錄A圖A.1以標(biāo)準(zhǔn)工作液中各異黃酮濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。必要時(shí)，可適當(dāng)增加或減少稀釋倍數(shù)f，使試樣中待測(cè)物質(zhì)量濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。7.5試樣溶液的測(cè)定將試樣溶液注入液相色譜儀中，以保留時(shí)間定性，得到各目標(biāo)化合物相應(yīng)的峰面積（樣品色譜圖見(jiàn)圖A.2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中各物質(zhì)濃度。8結(jié)果計(jì)算8.1試樣中大豆異黃酮各組分[大豆苷（X1）、黃豆黃苷（X2）、染料木苷（X3）、大豆苷元（X4）、黃豆黃素（X5）、和染料木素（X6）]的含量分別按式（1）計(jì)算：×100…………………Xi——樣品中大豆異黃酮單一組分的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；Ci——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的大豆異黃酮單一組分的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL）；V——試樣溶液體積，單位為毫升(mL)；f——樣品稀釋倍數(shù)；m——試樣取樣量，單位為克或毫升（g或mL）；1000、1000、100——單位換算系數(shù)。8.2試樣中大豆異黃酮總含量，按式（2）計(jì)算：X=X1+X2+X3+X4+X5+X6………………（2）式中：X——試樣中大豆異黃酮總含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X1——試樣大豆苷元的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X2——試樣黃豆黃素的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X3——試樣染料木素的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X4——試樣大豆苷的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X5——試樣黃豆黃苷的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)；X6——試樣染料木苷的含量，單位為克每百克(g/100g)或克每百毫升(g/100mL)。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。9精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。固體和半固體試樣：當(dāng)稱樣量為0.10g，定容體積為50mL時(shí)，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的檢出限為0.001g/100g，定量限為0.003g/100g。5GB/TXXXXX—XXXX液體試樣：當(dāng)取樣量為1.0mL，定容體積為50mL時(shí)，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的檢出限為0.0001g/100mL，定量限為0.0003g/100mL。GB/TXXXXX—XX