飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

2DBS61/0007—2022食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜的檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3原理試樣中的4-甲基咪唑和2-甲基咪唑經(jīng)水溶解或稀釋?zhuān)袷幪崛『?，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。4試劑與材料除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。4.1試劑4.1.1甲醇（CH3OH,CAS:67-56-1）：色譜純。4.1.2乙腈（CH3CN,CAS:75-05-8）：色譜純。4.1.3甲酸（CH2O2,CAS:64-48-6）：色譜純。4.1.4甲酸銨（NH4CHO2,CAS:208-753-9）。4.1.5氨水（NH3·H2O,CAS:1336-21-6）。4.2溶液配制4.2.1甲酸水溶液（2%）：準(zhǔn)確量取2mL甲酸和98mL水，混合后備用。4.2.2氨水甲醇溶液（5%）：準(zhǔn)確量取5mL氨水和95mL甲醇，混合后備用。4.2.3甲酸銨溶液（5mmol/L）：稱(chēng)取0.0945g甲酸銨溶解于適量水中，用水定容至300mL。3DBS61/0007—20224.2.4乙腈-5mmol/L甲酸銨溶液（9+1，體積比）：準(zhǔn)確量取90mL乙腈和10mL5mmol/L甲酸銨溶液（4.2.3），混合。4.3標(biāo)準(zhǔn)品4.3.14-甲基咪唑（4-Methylimidazole,C4H6N2,CAS:822-36-6）、2-甲基咪唑（2-Methylimidazole,C4H6N2,CAS:693-98-1），純度均≥98.0%。4.3.2內(nèi)標(biāo)物:4-甲基咪唑-D6（4-Methylimidazole-D6,C4D6N2,CAS:1219804-79-1）：純度≥99.0%。4.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制4.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0mg/mL）：稱(chēng)取4-甲基咪唑和2-甲基咪唑各10.0mg（精確至0.01mg），于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0mg/mL的4-甲基咪唑、2-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃避光保存，可保存6個(gè)月。4.4.2內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（1.0mg/mL稱(chēng)取4-甲基咪唑-D610.0mg（精確至0.01mg于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0mg/mL的4-甲基咪唑-D6儲(chǔ)備液，-20℃避光保存，可保存6個(gè)月。4.4.3混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1.0μg/mL精密量取4-甲基咪唑和2-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.25mL，于25mL容量瓶中，用乙腈-5mmol/L甲酸銨溶液（4.2.4）稀釋至刻度，配制成濃度均為10.0μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液，再量取該中間液1.0mL于10mL容量瓶中，搖勻，得1.0μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，0℃~4℃避光保存，可保存3個(gè)月。4.4.4內(nèi)標(biāo)工作溶液（1.0μg/mL）：精密量取4-甲基咪唑-D6內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液0.25mL，于25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為10.0μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再量取該中間液1.0mL于10mL容量瓶中，搖勻，得1.0μg/mL內(nèi)標(biāo)工作溶液。0℃~4℃避光保存，可保存3個(gè)月。4.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用乙腈-5mmol/L甲酸銨以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分峰面積和4-甲基咪唑-D6峰面積的比值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注：在實(shí)際樣品測(cè)定中，可根據(jù)樣品濃度調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍和內(nèi)標(biāo)濃度。4.5材料MCX固相萃取柱：60mg/3mL，或相當(dāng)者，使用前依次用3mL甲醇和5mL水活化。5儀器與設(shè)備5.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。5.2分析天平：感量0.00001g和0.01g。5.3振蕩器。4DBS61/0007—20225.4渦旋混勻器：轉(zhuǎn)速3000r/min。5.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速5000r/min。5.6固相萃取裝置。5.7氮吹儀。5.8容量瓶：10mL。5.9移液槍?zhuān)?00μL、1.0mL和10.0mL。5.10有機(jī)系濾膜：0.22μm。6試樣制備與保存6.1透明液體樣品將試樣充分混勻后用于測(cè)定。6.2半粘稠制品將試樣充分混勻，用四層紗布擠出濾液，棄去最初幾滴，收集濾液用于測(cè)定。6.3含懸浮物制品將待測(cè)樣品至于搗碎機(jī)中搗碎，用四層紗布擠出濾液，棄去最初幾滴，收集濾液用于測(cè)定。6.4固體飲料制品將試樣按說(shuō)明書(shū)中沖調(diào)方式?jīng)_調(diào)，充分混勻后用于測(cè)定。7測(cè)定步驟7.1提取稱(chēng)取試樣3g（精確至0.01g）于10mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液（4.4.4）100μL，用水定容至10.0mL，振蕩10min，4500r/min下離心5min，取上層清液備用。7.2凈化取提取液（7.1）以1.5mL的速度上樣于活化過(guò)的MCX固相萃取柱（4.5）過(guò)，待樣液全部過(guò)柱后，依次用2%甲酸水溶液（4.2.1）和甲醇各5mL淋洗，再用5%氨水甲醇溶液（4.2.2）9mL洗脫，洗脫液于40℃氮?dú)獯到伞Ｓ靡译?5mmol/L甲酸銨溶液（4.2.4）1.0mL溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，濾膜（4.5.2）過(guò)濾，待測(cè)定。7.3測(cè)定7.3.1液相色譜參考條件a）色譜柱：HILIC（2.1×100mm，1.7μm）,或相當(dāng)者；b）柱溫：40℃;5DBS61/0007—2022c）流速：0.3mL/min；d）進(jìn)樣量：5.0μL；e）流動(dòng)相：乙腈+5mmol/L甲酸銨溶液（9+1，V/V），等度洗脫；7.4.2質(zhì)譜參考條件a）離子源：電噴霧離子源;b）掃描方式：正離子掃描；c）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；d）噴霧電壓：3.5kV；e）離子傳輸管溫度：320℃;f）噴霧氣溫度：300℃;g）鞘氣：35.0Arb；h）輔助氣：5Arb；i）定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓見(jiàn)表1。表14-甲基咪唑和2-甲基咪唑的質(zhì)譜參考參數(shù)參考質(zhì)譜參數(shù)7.4.3測(cè)定方法7.4.3.1定性測(cè)定在同樣測(cè)試條件下，試樣中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間相比，偏差在±5%以?xún)?nèi)，且檢測(cè)到的離子相對(duì)豐度，應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)豐度一致。其允許偏差應(yīng)符合表2要求。表2定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的允許偏差>50±20>20～50±25>10～20±30±507.4.3.2定量測(cè)定6DBS61/0007—2022取試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計(jì)算。對(duì)照溶液及試樣溶液中4-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑-d6的響應(yīng)值均在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)，定量離子采用豐度最大的二級(jí)特征離子碎片，4-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑-d6多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)附錄A。7.5空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按上述測(cè)定步驟進(jìn)行。8結(jié)果計(jì)算和表達(dá)試樣中待測(cè)物的殘留量按式（1）計(jì)算：V式中：X—試樣中待分析物的殘留量，單位為微克每千克(μg/kgA—試樣溶液中被測(cè)物質(zhì)的峰面積；AiS—試樣溶液中內(nèi)標(biāo)的峰面積；Ai'S—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)的峰面積；AS—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中待測(cè)物的峰面積；CS—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中待測(cè)物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mLCi'S-標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；CiS—試樣溶液中內(nèi)標(biāo)的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V—試樣溶液定容體積，單位為毫升（mLm—試樣質(zhì)量，單位為克（g）。計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，9方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度4-甲基咪唑檢出限為3.0μg/kg，2-甲基咪唑的檢出限為5.0μg/kg；4-甲基咪唑和2-甲基咪唑定量限均為10.0μg/kg。9.2準(zhǔn)確度7DBS61/0007—20224-甲基咪唑在3.0~50.0μg/kg添加水平上的回收率范圍為80.0%~113.3%；2-甲基咪唑在5.0~50.0μg/kg添加濃度水平上的回收率范圍為82.8%~120.0%。9.3精密度本方法批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。8DBS61/0007—2022附錄A（資料性附錄）標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖A.1圖A.14-甲基咪唑（4-Mel）、2-甲基咪唑（2-Mel）和氘代4-甲基咪唑（4-Mel-D6）的特征離子質(zhì)量色譜（10μg/kg）9DBS61/0007—2022（資料性附錄）4-甲基咪唑和2-甲基咪唑殘留檢測(cè)的添加回收率及精密度數(shù)據(jù)表B.1碳酸飲料、特殊用途飲料、茶飲料、咖啡飲料及果蔬汁飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑添加濃度及回收率（n=5）樣品化合物添加水平(μg/kg）回收率（%）RSD（%）碳酸飲料4-甲基咪唑89.0~95.00.52598.4~119.92.150105.2~111.77595.0~112.42.72-甲基咪唑92.5~96.12588.4~104.47.05099.4~104.44.275109.7~118.72.9特殊用途飲料4-甲基咪唑96.6~100.12597.6~103.62.6502-甲基咪唑96.7~98.70.82599.3~100.90.8502.0茶飲料4-甲基咪唑88.9~92.32599.2~104.42.25097.8~102.82-甲基咪唑98.8~100.40.82596.9~98.80.85097.8~102.22.0咖啡飲料4-甲基咪唑94.0~99.02.02598.5~110.44.15091