線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時(shí)輔基FAD還原為FADH2，后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q，這是呼吸電子傳遞鏈的支路。CheKine?線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ活性檢測試劑盒（微量法）可檢測生物體內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ活性，其原理是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計(jì)算該酶活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)（能測605nm處的吸光度）·恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器或研缽試劑準(zhǔn)備ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。ReagentVI：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。工作液的配制：臨用前，將ReagentIV和ReagentV以50:1充分混勻，根據(jù)用量，現(xiàn)用現(xiàn)配。如果檢測樣本是哺乳動(dòng)物來源，請置于37℃孵育，5min；如果樣本是其他物種，則置于25℃孵育，5min。注意：ReagentV有毒且有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，以保證酶的活力。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ的提取：1.準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬個(gè)細(xì)胞，加入1mLReagentⅠ和10μLReagentIII，用勻漿器或研缽冰浴勻漿。2.離心勻漿液，600g，5min，4℃，收集上清液至另一新的離心管中，舍棄沉淀。3.再次離心上清，11,000g，10min，4℃，沉淀即為提取的線粒體，用作第5步操作。4.（選做）上清液即為胞漿提取物，可作為樣本用于測定從線粒體泄漏的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ（此步可選做，可用于判斷線粒體提取效果）。5.在沉淀中加入200μLReagentII和2μLReagentIII，充分重懸沉淀，用于下一步線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ酶活性檢測。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至605nm，可見分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10μL樣本、25μLReagentⅥ和200μL工作液，輕敲板，充分混勻后，立即讀取605nm處0min的初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。注意：1.為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測定的吸光值過高（大于1.5）或ΔA大于0.4，可用ReagentII稀釋樣本后再測定，計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高檢測數(shù)值，若ΔA出現(xiàn)負(fù)值，則說明樣本中不含復(fù)合體Ⅱ或已降解。2.線粒體呼吸鏈試劑盒是酶動(dòng)力學(xué)原理的試劑盒，反應(yīng)比較快，且反應(yīng)趨于平衡之后，該可逆反應(yīng)可能會出現(xiàn)負(fù)反應(yīng)，建議如下：（1）樣本組數(shù)：2-3個(gè)左右，該酶促反應(yīng)速度快，且為酶促反應(yīng)，需要把握好起始時(shí)間點(diǎn)和反應(yīng)后的時(shí)間點(diǎn)；（2）儀器提前預(yù)熱，且加樣可安排在酶標(biāo)儀旁邊進(jìn)行，加樣混勻后直接放入；（3）如果ΔA偏小，可增加樣本量（組織克重或者細(xì)胞數(shù)量），或者減少提取液用量；（4）樣本盡量新鮮提取，如果不能馬上使用，則把完整細(xì)胞或者分裝的組織保存在-80℃，一個(gè)月內(nèi)使用；（5）工作液臨用前配制。3.該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1850、KTB1870、KTB1880、KTB1890的測定。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。使用96孔板測定的計(jì)算公式按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。上清中復(fù)合體Ⅱ活力的計(jì)算：復(fù)合體Ⅱ上清活力(U/g鮮重)=[ΔA上清×V反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1,130×ΔA上清÷W沉淀中復(fù)合體Ⅱ活力的計(jì)算:復(fù)合體Ⅱ沉淀活力(U/g鮮重)=[ΔA沉淀×V反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V重懸×V樣)÷T=226×ΔA沉淀÷W樣本復(fù)合體Ⅱ總活力的計(jì)算：樣本復(fù)合體Ⅱ總活力即為上清中復(fù)合體Ⅱ活力與沉淀中復(fù)合體Ⅱ活力之和。復(fù)合體Ⅱ總活力(U/g鮮重)=1,130×ΔA上清÷W+226×ΔA沉淀÷W按細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1nmol2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。復(fù)合體Ⅱ活力(U/104cells)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V重懸×500)÷T=0.452×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，21×103mol/L/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；109：單位換算系數(shù)，1mol=109nmol；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；ΔA上清：上清測定值；W：樣本重量，g；V提?。禾崛◇w系體積，1.01mL；ΔA沉淀：沉淀測定值；V重懸：重懸沉淀體積，0.202mL；500：細(xì)胞總數(shù)，500萬。使用微量玻璃比色皿進(jìn)行測定的計(jì)算公式將上述計(jì)算公式中光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進(jìn)行計(jì)算即可。結(jié)果展示實(shí)驗(yàn)實(shí)例：取0.1g小鼠腦組織進(jìn)行樣本處理，按照測定步驟操作，用96孔板測得：ΔA上清=A1-A2=0.4268-0.394=0.0328，ΔA沉淀=A1-A2=0.6438-0.56045=0.08335按樣本質(zhì)量計(jì)算得：復(fù)合體Ⅱ上清活力(U/g鮮重)=1,130×ΔA上清÷W=1,130×0.0328÷0.1=370.64U/g復(fù)合體Ⅱ沉淀活力(U/g鮮重)=226×ΔA沉淀÷W=226×0.08335÷0.1=188.371U/g則復(fù)合體Ⅱ(U/g鮮重)=1,130×ΔA上清÷W+226×ΔA沉淀÷W=370.64+188.371=559.011U/g相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1850CheKin