線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ，又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。CheKine?線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒（微量法）可檢測生物體內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性，其原理是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性?？蓽y動、植物組織和細(xì)胞樣本。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計（能測660nm處的吸光度）·恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器或研缽試劑準(zhǔn)備ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。ReagentⅣ：臨用前配制，48T加入1mL去離子水充分溶解，96T加入2mL去離子水充分溶解。未用完的試劑需分裝后-20℃避光保存1個月，避免反復(fù)凍融。ReagentⅤ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentⅥ：臨用前配制，48T加入2.4mL去離子水充分溶解，96T加入4.8mL去離子水充分溶解后使用。未用完的試劑需分裝后-20℃避光保存1個月，避免反復(fù)凍融。ReagentⅦ：臨用前配制，48T加入7mL去離子水充分溶解，96T加入14mL去離子水充分溶解后使用。未用完的試劑需分裝后-20℃避光保存1個月，避免反復(fù)凍融。ReagentⅧ：臨用前配制，48T加入7mL去離子水充分溶解，96T加入14mL去離子水充分溶解后使用。未用完的試劑需分裝后-20℃避光保存1個月，避免反復(fù)凍融。ReagentⅨ：即用型；室溫保存。定磷試劑的配制：配制比例按照去離子水:ReagentⅦ:ReagentⅧ:ReagentⅨ=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請根據(jù)需要，現(xiàn)用現(xiàn)配）。注意：配試劑最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：按下表所示用去離子水將10mM標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156mM的標(biāo)準(zhǔn)溶液。序號標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL）去離子水體積（μL）標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mM）Std.1100μL10mM9001Std.2100μLofStd.1(1mM)1000.5Std.3100μLofStd.2(0.5mM)1000.25Std.4100μLofStd.3(0.25mM)1000.125Std.5100μLofStd.4(0.125mM)1000.0625Std.6100μLofStd.5(0.0625mM)1000.0313Std.7100μLofStd.6(0.0313mM)1000.0156樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，以保證酶的活力。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ的提?。簻?zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬個細(xì)胞，加入1mLReagentⅠ和10μLReagentⅢ，用勻漿器或研缽冰浴勻漿；離心勻漿液，600g，5min，4℃，收集上清液至另一新的離心管中，舍棄沉淀；再次離心上清，11,000g，10min，4℃，沉淀即為提取的線粒體，用作第5步操作；(選做)上清液即為胞漿提取物，可作為樣本用于測定從線粒體泄漏的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ（此步可選做，可用于判斷線粒體提取效果）；在沉淀中加入800μLReagentⅡ和8μLReagentⅢ，充分重懸沉淀，用于下一步線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ酶活性檢測。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到660nm，可見分光光度計用去離子水調(diào)零。酶促反應(yīng)（在EP管中依次加入下列試劑）：試劑空白管（μL）標(biāo)準(zhǔn)管（μL）測定管（μL）對照管（μL）ReagentIV001010ReagentV004040樣本00500混勻后蓋緊，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確孵育30minReagentVI002020樣本00050混勻后，室溫（25℃左右），4,000g，離心10min，取上清液。定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列試劑）試劑空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測定孔（μL）對照孔（μL）上清004040Standards04000去離子水40000定磷試劑200200200200混勻，室溫靜置10min后，測定660nm吸光值。計算ΔA測=A測定-A對照，ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。（空白管只需做1管）注意：1.為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測定的吸光值過高（高于1.5）可用ReagentⅡ稀釋樣本后再測定，計算結(jié)果時注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA測偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高檢測數(shù)值，若ΔA測出現(xiàn)負(fù)值，則說明樣本中不含復(fù)合體Ⅴ或已降解。2.ReagentⅢ具有一定的毒性，ReagentⅨ具有腐蝕性，請操作時做好防護(hù)措施。3.該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1880的測定。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為y軸，ΔA標(biāo)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度為y軸更方便計算結(jié)果）。無機(jī)磷(Pi)含量的計算將?A測帶入方程得到y(tǒng)值(mM)。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性計算(1)按樣本鮮重計算單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個酶活性單位。上清中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性的計算：上清中復(fù)合體Ⅴ活性(U/g鮮重)=(y上清×V酶促×106)÷(V樣÷V提取×W)÷T=80.8×y上清÷W沉淀中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性的計算：沉淀中復(fù)合體Ⅴ活性(U/g鮮重)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V樣÷V重懸×W)÷T=64.64×y沉淀÷W樣本線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ總活性的計算：樣本線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ總活性即為上清中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性與沉淀中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性之和。按樣本質(zhì)量計算：線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ總活性(U/g鮮重)=80.8×y上清÷W+64.64×y沉淀÷W(2)按細(xì)胞密度計算單位的定義：每1萬個細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個酶活性單位線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性(U/104cells)=(y×V酶促×106)÷(V樣÷V重懸×500)÷T=0.129×yV酶促：酶促反應(yīng)體系總體積，1.2×10-4L；106：單位換算系數(shù)，1mmol=106nmol；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時間，30min；V提取：提取體系體積，1.01mL；W：樣本重量，g；V重懸：重懸沉淀體積，0.808mL；500：細(xì)胞總數(shù)，500萬。結(jié)果展示典型標(biāo)準(zhǔn)曲線：[Pi](mM)ΔA[Pi](mM)ΔA標(biāo)Figure1.96孔板分析的線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)實(shí)例：取0.1g綠蘿組織進(jìn)行樣本處理，按照測定步驟操作，用96孔板測得：ΔA上清=A測定-A對照=0.404-0.267=0.137，ΔA沉淀=A測定-A對照=0.355-0.142=0.213將?A上清及ΔA沉淀帶入方程，得到y(tǒng)上清=0.1518，y沉淀=0.2358按樣本質(zhì)量計算得：上清中復(fù)合體Ⅴ活性(U/g鮮重)=80.8×y上清÷W=80.8×0.1518÷0.1=122.654U/g沉淀中復(fù)合體Ⅴ活性(U/g鮮重)=64.64×y沉淀÷W=64.64×0.2358÷0.1=152.421U/g則總復(fù)合體Ⅴ(U/g鮮重)=80.8×y上清÷W+64.64×y沉淀÷W=122.654+152.421=275.075U/g相