《HPLC基本原理》課件

HPLC基本原理高效液相色譜(HPLC)是一種強(qiáng)大的分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。HPLC利用流動(dòng)相通過固定相分離混合物中的不同組分，通過檢測器測量每個(gè)組分的濃度。HPLC是什么?高效液相色譜一種現(xiàn)代分析化學(xué)技術(shù)。用于分離、識(shí)別和定量樣品中的不同組分。廣泛應(yīng)用醫(yī)藥、化工、食品、環(huán)境等領(lǐng)域。進(jìn)行成分分析、純化、質(zhì)量控制等。分離原理利用樣品組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)差異。實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中不同組分的有效分離。HPLC的發(fā)展歷程120世紀(jì)60年代高效液相色譜(HPLC)的雛形誕生。220世紀(jì)70年代HPLC技術(shù)迅速發(fā)展。320世紀(jì)80年代HPLC成為一種成熟的分析技術(shù)。421世紀(jì)HPLC廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。HPLC的發(fā)展歷程可以追溯到20世紀(jì)60年代，當(dāng)時(shí)人們開始使用高壓泵和高效色譜柱進(jìn)行分離分析。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，HPLC逐漸成為一種成熟的分析技術(shù)，并在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。HPLC的基本組成泵系統(tǒng)高壓輸送流動(dòng)相，確保恒定流速，為色譜分離提供動(dòng)力。樣品注入系統(tǒng)將樣品精確、快速地注入色譜柱，確保樣品溶液的快速轉(zhuǎn)移。色譜柱根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同物質(zhì)的分離。檢測器監(jiān)測流出液中各組分的濃度，并將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。泵系統(tǒng)HPLC泵是系統(tǒng)的心臟，負(fù)責(zé)將流動(dòng)相輸送到色譜柱。泵需要提供恒定、可控的流動(dòng)相流速，確保分離過程的穩(wěn)定性。HPLC泵通常使用高壓，可達(dá)數(shù)千磅/平方英寸，以克服色譜柱的阻力。樣品注入系統(tǒng)樣品注入系統(tǒng)是將樣品引入色譜柱的裝置。常用的注入方式有手動(dòng)注射器注入和自動(dòng)進(jìn)樣器注入。手動(dòng)注射器注入操作簡單，但精度較低。自動(dòng)進(jìn)樣器注入精度高，可重復(fù)性好，適用于高通量分析。樣品注入系統(tǒng)應(yīng)能精確控制樣品體積和注入速度，保證樣品快速、完全地進(jìn)入色譜柱。此外，樣品注入系統(tǒng)還應(yīng)具有良好的密封性，避免樣品泄漏或污染。色譜柱色譜柱類型色譜柱類型多種多樣，根據(jù)填料類型、尺寸、長度等特點(diǎn)，分為反相色譜柱、正相色譜柱、離子交換色譜柱等。填料色譜柱的核心是填料，不同的填料具有不同的極性、粒徑、孔徑等，影響著分離效果和效率。色譜柱安裝色譜柱需要正確安裝，連接管道要緊密，防止泄漏，延長色譜柱使用壽命。淋洗液和淋洗梯度淋洗液淋洗液是HPLC系統(tǒng)中的流動(dòng)相，它負(fù)責(zé)將樣品中的組分帶入色譜柱，并通過柱子的分離作用進(jìn)行分離。淋洗強(qiáng)度淋洗強(qiáng)度是指淋洗液將組分從色譜柱上洗脫下來的能力，它主要取決于淋洗液的極性和溶解能力。淋洗梯度淋洗梯度是指在HPLC分析過程中，改變淋洗液的組成或強(qiáng)度，以優(yōu)化分離效果。檢測器檢測器概述檢測器是HPLC系統(tǒng)中的關(guān)鍵組成部分，負(fù)責(zé)檢測流出液中組分的含量并將其轉(zhuǎn)換為信號(hào)。檢測器的工作原理是根據(jù)組分的物理化學(xué)性質(zhì)，例如紫外吸收、熒光、電化學(xué)性質(zhì)等，來識(shí)別并量化組分。檢測器的作用檢測器可以提供有關(guān)樣品組分的信息，例如濃度、含量、保留時(shí)間等。這些信息可以用于定量分析和定性分析，以及識(shí)別樣品中的未知組分。檢測器的種類11.紫外檢測器最常用的HPLC檢測器，適用于具有紫外吸收的化合物。22.熒光檢測器靈敏度高，適用于具有熒光性質(zhì)的化合物。33.電化學(xué)檢測器對(duì)氧化還原活性物質(zhì)敏感，適合分析電化學(xué)活性物質(zhì)。44.質(zhì)譜檢測器提供化合物分子量信息，用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。紫外檢測器紫外檢測器是HPLC中最常用的檢測器之一。它基于物質(zhì)對(duì)紫外光的吸收特性，檢測樣品中組分的濃度。紫外檢測器靈敏度高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用廣泛。熒光檢測器熒光檢測器是一種靈敏度很高的檢測器，它利用物質(zhì)的熒光特性來檢測分析物。當(dāng)分析物通過激發(fā)光束照射后，激發(fā)態(tài)分子會(huì)發(fā)射出熒光，檢測器可以測量熒光的強(qiáng)度，從而確定分析物的濃度。熒光檢測器適用于檢測具有熒光特性的物質(zhì)，如多環(huán)芳烴、維生素、蛋白質(zhì)等。電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器通過測量被分析物在電極上的氧化還原反應(yīng)電流來進(jìn)行檢測。電化學(xué)檢測器靈敏度高，適用于電活性物質(zhì)的檢測，例如兒茶酚胺、維生素、藥物等。質(zhì)譜檢測器質(zhì)譜檢測器是一種非常靈敏的檢測器，可用于HPLC分析。該檢測器通過測量離子的質(zhì)量與電荷比來識(shí)別和定量樣品中的化合物。質(zhì)譜檢測器可以提供有關(guān)樣品中化合物結(jié)構(gòu)的信息。HPLC分析的步驟1樣品制備首先，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，例如過濾、提取、濃縮等，以去除雜質(zhì)，使樣品適合HPLC分析。2樣品注入將處理后的樣品注入到HPLC系統(tǒng)中，通過高壓泵將其送入色譜柱。3分離樣品中的不同組分在色譜柱中被分離，根據(jù)組分在固定相和流動(dòng)相之間的親和力不同，分離速度也不同。4檢測分離后的組分通過檢測器，檢測器會(huì)根據(jù)組分的物理化學(xué)性質(zhì)，如紫外吸收、熒光發(fā)射等，產(chǎn)生信號(hào)。5數(shù)據(jù)分析檢測器產(chǎn)生的信號(hào)被記錄并轉(zhuǎn)換為色譜圖，通過分析色譜圖可以得到樣品中各組分的含量、保留時(shí)間等信息。色譜圖分析保留時(shí)間保留時(shí)間是樣品組分從進(jìn)樣到檢測器的時(shí)間，用于定性分析。峰的高度和面積峰的高度和面積反映了組分的濃度，用于定量分析。峰的分離度峰的分離度是指相鄰峰之間的距離，表示分離效果的好壞。保留時(shí)間保留時(shí)間是指樣品從進(jìn)樣器進(jìn)入色譜柱到在檢測器中被檢測到的時(shí)間，是HPLC分析中重要的參數(shù)之一。保留時(shí)間可以反映樣品在色譜柱中的保留程度，以及樣品與流動(dòng)相之間的相互作用力。峰的高度和面積峰的高度和面積是HPLC分析中重要的參數(shù)，它們反映了樣品中分析物的含量。峰高指的是色譜峰的最高點(diǎn)與基線的垂直距離，峰面積則是色譜峰與基線所圍成的面積。1峰高與進(jìn)樣量和檢測器靈敏度有關(guān)。2峰面積與分析物在色譜柱上的保留時(shí)間和濃度成正比。色譜峰的理論塔板數(shù)塔板數(shù)是衡量色譜柱分離效率的重要指標(biāo)。塔板數(shù)越高，峰越窄，分離效果越好。塔板數(shù)色譜峰的形狀分離效果高窄好低寬差分離度定義相鄰兩個(gè)色譜峰之間的分離程度公式Rs=2(tR2-tR1)/(W1+W2)含義分離度越大，峰形越尖銳，分離效果越好選擇性因子選擇性因子是指在色譜分離中，不同組分在固定相上的保留能力差異，它反映了色譜柱對(duì)不同組分的分離能力。選擇性因子越大，說明色譜柱對(duì)不同組分的分離能力越強(qiáng)，分離效果越好。選擇性因子可以通過計(jì)算兩個(gè)組分在色譜柱上的保留時(shí)間比值來獲得。選擇性因子與流動(dòng)相的組成、色譜柱的性質(zhì)、溫度等因素有關(guān)，可以通過調(diào)整這些因素來改變選擇性因子，進(jìn)而優(yōu)化色譜分離效果。分析方法的優(yōu)化方法開發(fā)根據(jù)待測樣品特點(diǎn)，選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相和檢測器，建立初步分析方法。方法驗(yàn)證驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性、精密度、線性范圍、檢測限等參數(shù)，確保方法的可靠性和可重復(fù)性。方法優(yōu)化通過調(diào)整流動(dòng)相組成、流速、柱溫等參數(shù)，改善分離效果，提高分析效率。方法轉(zhuǎn)移將優(yōu)化后的分析方法轉(zhuǎn)移到其他儀器或?qū)嶒?yàn)室，確保方法的通用性和可移植性。影響HPLC分離的因素色譜柱色譜柱的類型、尺寸和填料對(duì)分離效果影響很大。例如，不同填料的孔徑、粒徑和表面化學(xué)性質(zhì)會(huì)影響樣品與填料的相互作用。流動(dòng)相流動(dòng)相的組成、pH值、極性、粘度和流速都會(huì)影響樣品在色譜柱中的遷移速度和分離效果。溫度溫度影響樣品和流動(dòng)相的擴(kuò)散系數(shù)，從而影響分離效果。溫度過高會(huì)導(dǎo)致峰展寬，而溫度過低會(huì)導(dǎo)致分離時(shí)間延長。樣品注入量樣品注入量過大會(huì)導(dǎo)致峰展寬，影響分離效果。樣品注入量過小則會(huì)導(dǎo)致峰面積過低，難以檢測。色譜柱的選擇1固定相選擇固定相類型，根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)選擇正相或反相色譜柱。2填料粒徑小粒徑填料提高分離效率，但會(huì)增加阻力，需根據(jù)具體情況選擇。3柱長柱長影響分離時(shí)間，一般較長柱可以提高分離度，但延長分析時(shí)間。4柱內(nèi)徑內(nèi)徑?jīng)Q定進(jìn)樣量，需根據(jù)分析目標(biāo)選擇合適的柱內(nèi)徑。流動(dòng)相的選擇極性匹配流動(dòng)相的極性應(yīng)與固定相的極性相匹配，以實(shí)現(xiàn)最佳分離效果。如果流動(dòng)相的極性與固定相的極性太相似，則樣品組分將不會(huì)被有效地分離。溶解度流動(dòng)相應(yīng)能夠溶解樣品組分，使其能夠進(jìn)入色譜柱。如果樣品組分在流動(dòng)相中不溶解，則無法進(jìn)行有效分離。流速的選擇流速的影響流速會(huì)影響樣品在色譜柱中的遷移速度，進(jìn)而影響分離效果。流速的選擇流速過快會(huì)導(dǎo)致分離度降低，過慢則會(huì)延長分析時(shí)間。優(yōu)化流速需要根據(jù)樣品性質(zhì)、色譜柱類型和流動(dòng)相選擇合適的流速。柱溫的選擇11.影響分離度柱溫影響溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)，進(jìn)而影響分離度。22.降低峰擴(kuò)散升高柱溫可以降低溶質(zhì)在色譜柱中的擴(kuò)散，使峰形更尖銳。33.縮短分析時(shí)間升高柱溫可以加快溶質(zhì)的遷移速度，縮短分析時(shí)間。44.優(yōu)化流動(dòng)相根據(jù)實(shí)際情況，需要選擇合適的柱溫以達(dá)到最佳分離效果。HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域藥物分析HPLC用于藥物開發(fā)和質(zhì)量控制，包括藥物成分分析、雜質(zhì)鑒定、藥物穩(wěn)定性研究等。食品安全