食品微生物檢驗(yàn)之紙片法

食品微生物檢驗(yàn)之紙片法摘要：紙片法在食品檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、速度快等特點(diǎn)，為食品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持。本文主要介紹了紙片法的原理和紙片法在食品中微生物檢測(cè)中的方法應(yīng)用以及與平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行了對(duì)比研究。

關(guān)鍵詞：食品檢驗(yàn)紙片法平板計(jì)數(shù)法微生物檢測(cè)

前言：

食品安全問題越來越受到人們的重視，微生物對(duì)食品的污染問題也相應(yīng)地備受關(guān)注。在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物將大量繁殖而引起食品腐敗變質(zhì)，或?qū)е率吃葱愿腥竞褪澄镏卸?，食品的檢測(cè)與分析工作已經(jīng)提高到一個(gè)極其重要的地位。特別是為了保證食品的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)，開展食品科學(xué)技術(shù)研究，尋找食品污染的根源，人們更需要對(duì)食品進(jìn)行各種有效營養(yǎng)物質(zhì)和對(duì)人體有害、有毒物質(zhì)的檢驗(yàn)和分析。自20世紀(jì)70年代起，各種食品檢測(cè)不斷出現(xiàn)，主要包生物化學(xué)技術(shù)、紙片法等，目前這些技術(shù)在食品檢測(cè)和分析等方面已經(jīng)得到了較好的應(yīng)用，特別是紙片法。紙片法以其操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、速度快等優(yōu)勢(shì)在食品檢測(cè)領(lǐng)域得到愈來愈廣泛的應(yīng)用[1，2]。

一、紙片法的原理

紙片法，即以紙片、紙膜、膠片等作為培養(yǎng)基載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測(cè)定微生物的方法[3]?？焖贉y(cè)試片法有以濾紙為載體的測(cè)試片，這種測(cè)試片是一種水合物干膜，由上下兩層薄膜組成，上層是聚丙烯薄膜，下層是上印有網(wǎng)格的聚乙烯薄膜，通過一種冷水可溶性的凝膠劑附著在培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基上有微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、特異性顯色物質(zhì)和抗生素。

紙片擴(kuò)散法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成一種濃度梯度。在藥物擴(kuò)散的同時(shí)，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的測(cè)試菌不能生長，而抑菌濃度范圍外的菌株則繼續(xù)生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈。不同抗菌藥物抑菌圈的直徑因受藥物在瓊脂中的擴(kuò)散速率的影響而可能不同，抑菌圈的大小可反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度（mic）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈越大，mic越小。

二、紙片法的優(yōu)、缺點(diǎn)及改進(jìn)

本文介紹的是北京陸橋公司研制的easytesttm紙片（簡(jiǎn)稱et），et微生物測(cè)試紙片是一種將脫水培養(yǎng)基附著于無紡布棉墊上的即用型檢測(cè)產(chǎn)品，利用了特異性酶與特異性顯色底物反應(yīng)的原理，使目標(biāo)菌與非目標(biāo)菌呈現(xiàn)可明顯區(qū)別的不同特異性顏色，et測(cè)試紙片的培養(yǎng)載體采用了無紡布和水溶性營養(yǎng)底物的設(shè)計(jì)，具有良好的吸水性，可快速吸收測(cè)試液，使微生物自動(dòng)均勻分布于無紡布上，為測(cè)試液和營養(yǎng)底物創(chuàng)造了一個(gè)固定的混合區(qū)域。這種紙片法排除了濾紙測(cè)試片不易計(jì)數(shù)、營養(yǎng)物質(zhì)分布不均、顯色指示劑單一和保水性差的缺點(diǎn)，待測(cè)樣品不需滅菌、本身帶有培養(yǎng)基，樣品可直接加入。其特點(diǎn)可歸納為：可應(yīng)用于現(xiàn)行g(shù)b/t4789-2008和sn標(biāo)準(zhǔn)中；使用方便，即用型產(chǎn)品，省去配制步驟，減少工作量；大量縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率；降低對(duì)操作人員的技術(shù)要求；準(zhǔn)確：靈敏度高、特異性強(qiáng)；可用于食品微生物檢測(cè)和環(huán)境衛(wèi)生檢測(cè)，可分別檢測(cè)菌落總數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)、金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)。如用大腸菌群快檢紙片檢測(cè)餐具的表面，操作簡(jiǎn)便、快速、省料，特異性和敏感性與發(fā)酵法符合率高，使用時(shí)應(yīng)正確掌握操作技術(shù)和判斷標(biāo)準(zhǔn)，從而達(dá)到理想的檢測(cè)效果[4]。

從實(shí)用性來說，et紙片省卻了大量的玻璃器皿的麻煩，操作簡(jiǎn)便，攜帶方便，污染??；可在野外迅速檢測(cè)所采集樣本，避免常規(guī)方法因運(yùn)輸時(shí)間長而造成的菌落環(huán)境變化，更能反映采集樣本真實(shí)菌落情況；培養(yǎng)后所長的為有色菌落，便于計(jì)數(shù)。

紙片法也有其弊端，測(cè)試片較小，菌量數(shù)較大時(shí)計(jì)數(shù)困難；只研制出了少數(shù)幾種類型的測(cè)試片，只能局限于幾個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)上。

目前，對(duì)紙片法分改進(jìn)主要是擴(kuò)大被檢測(cè)目標(biāo)菌種種類；研制具有檢測(cè)較大菌量的紙片，并且提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。神保勝彥[5]（1991）對(duì)紙片法作了進(jìn)一步研究和改進(jìn)，改進(jìn)后的紙片法不僅能夠確定抗生素的種類，而且提高了檢出率和準(zhǔn)確性，氯霉素最低檢出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，鏈霉素1mg/kg，紅霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。

三、紙片法在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用[6]

1.菌落總數(shù)測(cè)試片，揭起覆蓋的膠片，將1ml樣品懸液滴于紙片中央后蓋回，用壓板輕輕壓下，將樣品均勻地覆蓋于培養(yǎng)基上。靜置約1min使培養(yǎng)基中的凝膠固化。測(cè)試片水平放于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片培養(yǎng)48±3h后計(jì)數(shù)紅色菌落數(shù)作為細(xì)菌總數(shù)，亦可用作乳酸菌測(cè)定。

2.霉菌、酵母菌測(cè)試片，該測(cè)試片含霉菌酵母生長的營養(yǎng)物質(zhì)、菌落生長的指示劑，并添加抗生素以抑制細(xì)菌生長。接種后，21℃～25℃培養(yǎng)3～5d，計(jì)數(shù)。酵母菌菌落特征：小型菌落，邊緣清晰，顏色均一，灰白色至藍(lán)綠色，菌落隆起。霉菌菌落特征：大型菌落，邊緣模糊，中間顏色深暗，顏色不均一，菌落扁平。

3.大腸菌群、大腸桿菌檢測(cè)紙片，該測(cè)試片含有改良的vrb（violetredbile）培養(yǎng)基及葡萄糖苷酸酶指示劑。絕大多數(shù)大腸桿菌能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酸酶，與培養(yǎng)基中的指示劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀環(huán)繞在大腸桿菌菌落周圍，表面覆蓋的膠膜，可留住發(fā)酵乳糖產(chǎn)生的氣體，形成藍(lán)色和深藍(lán)色的菌落并有氣泡相連。大腸菌群菌落在測(cè)試片上產(chǎn)酸，ph指示劑使培養(yǎng)基變?yōu)榘导t色，在紅色菌落周圍有氣泡者為大腸菌群。所以，一次測(cè)試即可測(cè)出大腸桿菌和大腸菌群數(shù)：帶氣泡的藍(lán)色和紅色菌落為大腸菌群，帶氣泡的藍(lán)色菌落為大腸桿菌。

4.金黃色葡萄球菌測(cè)試片，該測(cè)試片含有改良的bairdparker培養(yǎng)基，對(duì)于金黃色葡萄球菌的生長有很強(qiáng)的選擇性，并能將其鑒定出來，與3個(gè)bairdparker平板加一個(gè)血漿凝固酶試管的方法等效。其可形成暗紫色菌落，如果在測(cè)試片上有其它可疑菌落出現(xiàn)，可以使用金黃色葡萄球菌確認(rèn)反應(yīng)片。其含有顯色劑及脫氧核糖核酸，由于金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶，具有耐高溫特性，高溫處理后仍能將dna降解而與反應(yīng)片上的顯色劑反應(yīng)形成粉紅色環(huán)。

5.沙門氏菌測(cè)試片，將選擇性培養(yǎng)基中加入沙門氏菌特有辛酯酶的顯色指示劑，并將其加載在紙片上，通過培養(yǎng)，如果樣品中含有沙門氏菌，即可在紙片上呈紫紅色的菌落。

四、分別用紙片法和平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)食品中的大腸菌群

1.檢驗(yàn)之前的準(zhǔn)備，檢驗(yàn)之前的準(zhǔn)備是保證檢驗(yàn)高質(zhì)量的前提，應(yīng)做好以下幾點(diǎn)：

1.1為了保證微生物檢驗(yàn)的高質(zhì)量，要求檢驗(yàn)人員的要有專業(yè)知識(shí)和熟練的技術(shù)，而且還必須具備對(duì)工作的高度責(zé)任感和實(shí)事求是的科學(xué)工作作風(fēng)。確保實(shí)驗(yàn)室人員得到及時(shí)培訓(xùn)及不斷更新知識(shí)，學(xué)習(xí)和掌握新理論、新技術(shù)和新方法。

1.2環(huán)境，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有進(jìn)行微生物檢驗(yàn)適宜充分的設(shè)施條件，包括檢測(cè)設(shè)施（專用于微生物檢測(cè)和相關(guān)活動(dòng)）及輔助設(shè)施（大門、走廊、管理區(qū)、樣品區(qū)、清潔間）特殊的設(shè)備要在特殊的環(huán)境下放置和操作。所用無菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合gb19489[7]的規(guī)定。

1.3操作，操作人員必須嚴(yán)格按照gb/t

4789[8]食品微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中的操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，做好滅菌處理，為防止二次污染采取必要措施，原始記錄要真實(shí)準(zhǔn)確，不得隨意填寫。按照gb/t4789標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定。

以嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)態(tài)度，做好上述幾個(gè)環(huán)節(jié)準(zhǔn)備工作，就能使我們微生物檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性得以保證，為食品衛(wèi)生和安全提供可靠技術(shù)保障。

2.材料與試劑

2.1材料：培養(yǎng)箱、移液器、水浴鍋等。

2.2試劑與培養(yǎng)基：北京陸橋大腸菌群et測(cè)試紙片，培養(yǎng)基。

2.3茵株：大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株一株，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株一株，實(shí)驗(yàn)室分離保存菌株兩株（沙門氏菌和酵母菌）。

2.4樣品：瓶裝啤酒、冰點(diǎn)、休閑小食品、糕點(diǎn)、速凍食品、水產(chǎn)品、乳制品、熟肉制品等為本實(shí)驗(yàn)室日常抽檢樣品和委托檢驗(yàn)樣品，生肉類、熟制品、涼拌菜共十二類產(chǎn)品，每類10份樣品，共120份樣品。

3.比較與實(shí)驗(yàn)方法

3.1方法比較：根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)操作情況，將gb方法（平板計(jì)數(shù)法）[9]同et測(cè)試紙片法進(jìn)行對(duì)比，主要列舉和分析計(jì)數(shù)原理、操作步驟、培養(yǎng)時(shí)間等。

3.2檢測(cè)結(jié)果比較實(shí)驗(yàn)

3.2.1菌株加標(biāo)實(shí)驗(yàn)：將大腸桿菌、沙門氏菌和酵母菌分別和干擾菌金黃色葡萄球菌一起加入各類食品樣品中，每類加入3份，共36份樣品。每份樣品目標(biāo)污染值約為1*10cfu/ml，每份樣品均采用gb平板計(jì)數(shù)法vrba法和北京陸橋大腸菌群測(cè)試紙片et法同時(shí)檢驗(yàn)。

3.2.2普通樣品檢測(cè)：將120份樣品按照gb4789.3—2010處理，用平板計(jì)數(shù)法vrba法和et測(cè)試紙片法同時(shí)檢驗(yàn)。

3.2.3結(jié)果分析：將加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的36個(gè)結(jié)果和普通樣品檢測(cè)中的陽性結(jié)果取對(duì)數(shù)，進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)算p值，研究兩種方法間是否存在顯著性差異[10]。

4.結(jié)果與分析

4.1方法比較，針對(duì)gb4789.3—平板計(jì)數(shù)vrba法與et測(cè)試法的比較見表1。

4.2菌株加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：加標(biāo)的36個(gè)樣品結(jié)果見表2。

4.3普通樣品檢測(cè)結(jié)果：十二類120個(gè)樣品中，共檢出59對(duì)陽性結(jié)果，具體結(jié)果見表3。

4.4通過配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算可知p值為0.16>0.05，可見兩種方法檢測(cè)結(jié)果無差異。

4.5紙片法與平板計(jì)數(shù)法相比較，具有快速、簡(jiǎn)便、易于操作等特點(diǎn)[11]，平板計(jì)數(shù)法需要72h出結(jié)果，而紙片法只需24h就能報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)速度得到了很大的提高，更能滿足現(xiàn)代食品進(jìn)出口業(yè)務(wù)快進(jìn)快出的要求，而且紙片法操作簡(jiǎn)便，省去了培養(yǎng)基配制、殺菌消毒、器皿洗滌等繁瑣的勞作，有效提高了實(shí)驗(yàn)室的工作效率，但是測(cè)試片價(jià)格較貴，可先在專業(yè)食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和經(jīng)濟(jì)效益較好的食品生產(chǎn)企業(yè)推廣使用。

五、結(jié)論

盡管食品微生物的檢測(cè)方法有很多種，但紙片法在食品檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、速度快等特點(diǎn)，已在食品領(lǐng)域的微生物檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。隨著紙片法食品微生物檢測(cè)技術(shù)的不但發(fā)展，相信紙片法會(huì)在食品微生物檢測(cè)、監(jiān)控等方面發(fā)揮愈來愈大的作用。

參考文獻(xiàn)：

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