松材線蟲病檢驗(yàn)鑒定技術(shù)規(guī)程

1松材線蟲病檢驗(yàn)鑒定技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了松材線蟲病取樣、檢驗(yàn)鑒定、樣品監(jiān)管、檢驗(yàn)鑒定結(jié)果反饋及疫情上報(bào)的相關(guān)技術(shù)和流程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于松材線蟲寄主植物及其制品檢驗(yàn)鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T23476GB/T23478GB/T35342松材線蟲病檢疫技術(shù)規(guī)程松材線蟲普查監(jiān)測技術(shù)規(guī)程松材線蟲分子檢測鑒定技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)3.1松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus（SteinererBuhrer）Nickle屬于線蟲門（Nematoda側(cè)尾腺綱（Secernentea滑刃目（Aphelenchida滑刃總科（Aphelenchoidoidea），滑刃科（Aphelenchoidoidae），傘滑亞科（Bursaphelenchinae），傘滑刃屬（Bursaphelenchus）。其形態(tài)特征參見附錄A。3.2松材線蟲病由松材線蟲寄生在松樹體內(nèi)引起松樹迅速死亡的一種毀滅性林木病害，又稱松樹萎蔫病、松材線蟲萎蔫病、松樹枯萎病。3.3松木及其制品松科原木、鋸材和用于承載、包裝、鋪墊、支撐、加固貨物的木質(zhì)材料。如電纜盤、光纜盤、木板箱、木托盤、墊木、枕木、襯木等。經(jīng)人工合成或經(jīng)加熱、加壓等深度加工的包裝木質(zhì)材料除外，如膠合板、纖維板等。3.42檢驗(yàn)鑒定對松科植物及其制品，通過形態(tài)學(xué)特征或分子省物學(xué)特性檢驗(yàn)判定是否含有松材線蟲的過程。3.5樣品從表現(xiàn)出異常癥狀的松科植物或松木制品上選取的，用于松材線蟲病檢驗(yàn)鑒定的材料。4取樣4.1感病松樹現(xiàn)地取樣方法適用于春秋季普查和日常監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)的異常松樹。春季普查在4月-6月份，秋季普查在8月-11月份。具體取樣方法參見附錄B.2。4.1.1感病松樹典型癥狀感病松樹在新發(fā)生林分內(nèi)呈零星點(diǎn)狀分布，多為林分中的優(yōu)勢木，后發(fā)展為以定居點(diǎn)為中心，隨機(jī)向外擴(kuò)散。遠(yuǎn)看松針顏色為褐色或亮紅褐色，枯死枝條從樹冠向下逐漸增多，針葉不脫落。4.1.2感病松樹病癥表現(xiàn)時(shí)間當(dāng)年染病的松樹一般在8月下旬至11月上旬表現(xiàn)病癥，越年死亡的一般在4月-6月表現(xiàn)病癥。4.2松木及其制品取樣方法直接觀察或借助鋸、斧等工具檢查松木及制品是否干枯；重量是否明顯減輕；木質(zhì)部是否有藍(lán)變；松脂味是否消失；有無媒介昆蟲危害、補(bǔ)充營養(yǎng)取食的痕跡，如侵入孔、蛀道、蛹室等。取樣對象、取樣部位和數(shù)量參見附錄B.3。5形態(tài)學(xué)鑒定5.1分離采用貝爾曼漏斗法、淺盤法進(jìn)行（參見附錄C）。分離時(shí)間一般需要4h-12h。將分離液體收集到試管或者燒杯中，通過自然沉淀或使用離心機(jī)處理后得到線蟲分離液。5.2鏡檢將盛有線蟲分離液的培養(yǎng)皿置于解剖鏡下觀察，先確認(rèn)有無線蟲。對有線蟲的樣品進(jìn)行活體檢驗(yàn)，觀察它的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)，選出特征明顯的成蟲，用膠頭吸管或移液槍移至載玻片上熱殺死并制作臨時(shí)玻片，再根據(jù)形態(tài)特征予以鑒別。（參見附錄D）5.3培養(yǎng)當(dāng)分離的線蟲為幼蟲或雌、雄成蟲數(shù)量極少時(shí)，可以采用疫木保溫保濕或真菌活體培養(yǎng)法快速培養(yǎng)松材線蟲。（參見附錄D）5.4形態(tài)特征3根據(jù)松材線蟲的形態(tài)特征、松材線蟲和擬松材線蟲形態(tài)特征主要區(qū)別（參見附錄E）進(jìn)行鑒定，一般先觀察線蟲中的食道球形狀、口針有無及口針的形狀，再對其典型形態(tài)特征觀察和測計(jì)后才能確定。5.5檢驗(yàn)記錄檢驗(yàn)鑒定結(jié)果填入《松材線蟲形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)鑒定記錄表》（參見附錄F）。6分子生物學(xué)鑒定常用的分子生物學(xué)鑒定方法有松材線蟲PCR檢測、松材線蟲自動化分子檢測和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。（參見附錄G）7樣品監(jiān)管7.1樣品保存送檢樣品應(yīng)及時(shí)做分離檢測，分別保存，避免交叉污染。將樣品裝入塑料袋內(nèi)，在袋上扎少量小孔（木段或圓盤可直接保存），保持樣品濕潤。標(biāo)明樣品信息（送檢單位、樣品編號、送檢時(shí)間等）放入4℃恒溫箱，一般在1個(gè)月內(nèi)完成分離檢驗(yàn)。檢驗(yàn)鑒定的樣品保存不少于6個(gè)月，以備復(fù)檢。7.2分子生物學(xué)檢驗(yàn)樣品送檢樣品送檢時(shí)有條件的要先經(jīng)過初步鏡檢，鏡檢后出具初步檢驗(yàn)鑒定報(bào)告和松材線蟲形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)鑒定記錄表，并填寫松材線蟲分子生物學(xué)檢驗(yàn)送檢表（附錄H），報(bào)送省級檢驗(yàn)鑒定機(jī)構(gòu)登記檢驗(yàn)。送檢要有專人負(fù)責(zé)，保證樣品送檢安全，不能通過郵寄方式。7.3樣品銷毀分離檢驗(yàn)后的樣品要采用高壓滅菌、焚燒、粉碎的方式及時(shí)銷毀處理。8檢驗(yàn)鑒定結(jié)果反饋及疫情上報(bào)8.1檢驗(yàn)鑒定結(jié)果反饋省級檢驗(yàn)鑒定機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)在收到送檢樣品10個(gè)工作日內(nèi)出具檢驗(yàn)鑒定報(bào)告報(bào)告樣式參見附錄I）并留檔備查。8.2檢驗(yàn)鑒定結(jié)果確認(rèn)檢驗(yàn)鑒定結(jié)果可能為新增松材線蟲病疫區(qū)和疫點(diǎn)時(shí)，省級檢驗(yàn)鑒定機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)在檢驗(yàn)鑒定后3個(gè)工作日內(nèi)，將結(jié)果報(bào)送至省林業(yè)和草原行政主管部門所屬的防治檢疫機(jī)構(gòu)，由其組織相關(guān)檢驗(yàn)鑒定機(jī)構(gòu)進(jìn)行二次確認(rèn)，確認(rèn)后反饋至送檢單位。8.3檢驗(yàn)鑒定備案省級檢驗(yàn)鑒定機(jī)構(gòu)每半年需將檢驗(yàn)鑒定開展情況上報(bào)省林業(yè)和草原行政主管部門所屬的防治檢疫機(jī)構(gòu)備案。市、縣送檢的檢驗(yàn)鑒定記錄、報(bào)告等檔案要保存3年以上。48.4疫情上報(bào)松材線蟲病疫情一經(jīng)確認(rèn)，市、縣林業(yè)和草原行政主管部門應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)同時(shí)報(bào)告上級林業(yè)和草原行政主管部門及當(dāng)?shù)厝嗣裾?.5疫情信息發(fā)布國家和省級林業(yè)和草原行政主管部門按照有關(guān)規(guī)定發(fā)布疫情信息。5松材線蟲形態(tài)特征松材線蟲的雌、雄蟲都呈蠕蟲形，蟲體細(xì)長。唇區(qū)高，縊縮明顯，前緣圓。口針細(xì)長，中食道球卵圓形，占體寬的2/3以上。雌蟲陰門寬，上陰唇長，向下覆蓋。尾部末端近圓柱形，尾端橢圓或尾尖突，尾尖突長1μm左右，不超過2μm。雄蟲交合刺大，呈弓形，成對，交合刺末端膨大尖突。尾部末端尖，側(cè)面向腹彎曲呈爪狀，端部包裹卵形交合傘。雌蟲：A.整體；F.體前部；G.陰門區(qū)；H-J.尾部雄蟲：B.整體；C.尾部；D.尾端；E.交合刺6松材線蟲病取樣B.1取樣工具電鋸或手鋸、砍刀或斧頭、手搖鉆、標(biāo)簽、塑封袋。B.2現(xiàn)地取樣方法B.2.1取樣對象優(yōu)先抽取尚未完全枯死或剛枯死的松樹。可參照以下特征選擇取樣松樹：（1）對發(fā)現(xiàn)的枯死、瀕死松樹首先排除其它死亡原因（干旱、人畜破壞、森林火災(zāi)、凍害、水漬、其它病蟲危害）；（2）針葉呈現(xiàn)紅褐色、黃褐色；（3）整株或部分枝條萎蔫、枯死，但針葉下垂、不脫落；（4）樹干部有媒介昆蟲的產(chǎn)卵刻槽或侵入孔；（5）樹干部松脂滲出少或無松脂滲出。B.2.2取樣數(shù)量以小班為單位，表現(xiàn)有取樣特征的松樹在10株以下全部取樣；10株以上的先抽取10株進(jìn)行取樣檢驗(yàn)，如果檢驗(yàn)有則不需要繼續(xù)取樣，如果沒有要繼續(xù)取樣檢驗(yàn)，直至全部取樣檢驗(yàn)為止。B.2.3取樣部位優(yōu)先在表現(xiàn)癥狀明顯的枝條上取樣。對樹干取樣時(shí)，一般在樹干下部（胸高部位）、中部（上、下部之間）、上部（主干與主側(cè)枝交界處）3個(gè)部位取樣。對于僅部分枝條表現(xiàn)癥狀的，在其表現(xiàn)癥狀的枝條上取樣。對于樹干內(nèi)發(fā)現(xiàn)媒介昆蟲蛹的，優(yōu)先在蛹室周圍取樣。B.2.4取樣方法在取樣部位剝凈樹皮，用砍刀或斧頭直接砍取100g-200g木片；或剝凈樹皮，用手搖鉆從木質(zhì)部表面至髓心鉆取100g-200g木屑；或者將枯死松樹伐倒，在取樣部位分別截取2cm厚的圓盤等。B.2.5樣品標(biāo)記所取樣品要及時(shí)貼上標(biāo)簽，標(biāo)明樣品編號、取樣地點(diǎn)、林班、小班、樹種、樹齡、取樣部位、取樣時(shí)間和取樣人等信息。B.3松木及其制品取樣方法B.3.1取樣對象7選擇截面無松脂痕跡、密度明顯減輕或木質(zhì)部有藍(lán)變現(xiàn)象及有天牛危害的蛀道、蛹室的松木及其制品進(jìn)行取樣。B.3.2取樣部位和數(shù)量原木取樣時(shí)在取樣部位剝凈樹皮，直接砍取100g-200g木片；或用手搖鉆從木質(zhì)部至髓心鉆取100g-200g木屑；或分別截取2cm厚的圓盤。松木制品進(jìn)行取樣時(shí)可直接砍取100g-200g木片；或直接帶回部分松木制品。B.3.3樣品標(biāo)記所取樣品要及時(shí)貼上標(biāo)簽，標(biāo)明樣品編號、取樣地點(diǎn)、松木制品名稱、取樣時(shí)間和取樣人等信息。8常用的松材線蟲分離方法C.1貝爾曼漏斗法貝爾曼漏斗法是分離線蟲的經(jīng)典方法之一。分離器由漏斗、橡皮管、止水夾、厚面巾紙組成。(圖在口徑為10cm-20cm的漏斗末端接一段10cm長橡皮管，在橡皮管后端用止水夾夾緊，在漏斗內(nèi)鋪兩層大小適中的面巾紙。將樣品去皮后劈成長約1cm-4cm，直徑1cm-3cm的細(xì)條或直接取木屑約10g置于漏斗中的面巾紙，用面巾紙包好，加水至浸沒樣品。注入水后要注意使水充滿漏斗和下面的橡皮管，橡皮管內(nèi)不得有氣泡，如果有氣泡可以松開止水夾放出一些水，沖掉氣泡。室溫不低于20℃,分離浸泡用的水溫在20℃-30℃之間，線蟲游離出一定數(shù)量后可鏡檢，一般需要3h-12h。要輕輕打開止水夾，用培養(yǎng)皿或燒杯在橡皮管下接取分離液約10ml；或用離心沉淀管接取分離液5ml，自然沉淀30min或1500/min離心2min。C.2淺盤法淺盤分離器主要由淺盤和篩盤組成，其中口徑略小的底部為網(wǎng)篩狀，放在另一個(gè)淺盤里面。將兩層濕紗布鋪于篩盤上，把樣品劈碎（或木屑）置于篩盤的紗布上，慢慢注入清水，沒過樣品。12h-24h后，將下面淺盤的分離液收集到小燒杯中，自然沉淀30min或1500r/min離心2min。(圖C.2)圖C.1貝爾曼漏斗法裝置圖圖C.2淺盤法裝置圖臨時(shí)玻片制作和線蟲快速培養(yǎng)D.1臨時(shí)玻片制作D.1.1殺死線蟲將線蟲分離液取一滴放在載玻片上，將載玻片在酒精燈火焰上來回移動5s-6s，加熱過度會破壞線蟲體內(nèi)器官或使其表皮熟化變白，影響觀察。也可以將線蟲分離液放在試管中，把試管放在60℃-65℃的水浴箱中2min-3min，即可殺死線蟲。D.1.2玻片制作在載玻片上滴一滴水，用挑針或吸管吸一滴線蟲懸液在載玻片上，用挑針將線蟲輕輕按到水滴底部，以免蓋蓋玻片時(shí)線蟲會隨水流到蓋玻片的邊緣，影響觀察。在蓋蓋玻片時(shí)，要從側(cè)面慢放，盡量不產(chǎn)生氣泡。D.2線蟲快速培養(yǎng)D.2.1疫木保溫保濕培養(yǎng)將樣品鋸成小段，置于燒杯中，加少量清水使木段下端浸在水中，木段上端用濕紗布覆蓋，在26℃-30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天，倒取杯中水液，可獲得較多成蟲。D.2.2單異活體培養(yǎng)制備馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板。通常用于培養(yǎng)松材線蟲的真菌為灰葡萄孢（Botrytiscinerea)或盤多毛孢（Pestalotiaspp.)，此外用鐮刀孢（Fusariμmspp.)培養(yǎng)松材線蟲效果亦佳。無菌條件下將盤多毛孢、鐮刀孢或灰葡萄孢接種在PDA平板上，盤多毛孢或鐮刀孢28℃恒溫培養(yǎng)4d-5d，灰葡萄孢25℃恒溫培養(yǎng)4-5天，待菌絲長滿平板，培養(yǎng)完成后可長期置于4℃冰箱冷藏備用。培養(yǎng)基放置室溫后將線蟲接到菌絲上，盤多毛孢、鐮刀孢在30℃條件下保濕培養(yǎng)線蟲，2天即可分離鑒定?；移咸焰咴?5℃恒溫培養(yǎng)線蟲需要1d-3d。松材線蟲與擬松材線蟲形態(tài)特征的主要區(qū)別E.1松材線蟲典型形態(tài)特征圖E.1松材線蟲典型形態(tài)特征前體部特征雄蟲尾部弓形雄蟲尾部交合傘雌蟲尾部指形雌蟲尾部短尾尖突雌蟲陰門E.2松材線蟲與擬松材線蟲形態(tài)特征的主要區(qū)別擬松材線蟲B.muctonatus（MamiyaetEnda）在形態(tài)學(xué)和生物學(xué)方面都與松材線蟲相似，但分布較松材線蟲廣泛，在松材線蟲病的檢驗(yàn)中常?？梢?，二者在形態(tài)上的主要區(qū)別在于：(表E.1)表E.1松材線蟲和擬松材線蟲形態(tài)特征主要區(qū)別類別松材線蟲擬松材線蟲雌蟲尾部亞圓錐形末端鈍圓，少數(shù)可見微小的尾尖突，不超過2μm，一般為1μm圓錐形，末端有明顯的尾尖突，長度在3.5μm-5μm雄蟲尾部交合刺遠(yuǎn)端有盤狀突，交合傘為卵形交合刺遠(yuǎn)端無盤狀突，交合傘為近方形松材線蟲形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)鑒定記錄表表F.1松材線蟲形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)鑒定記錄表檢驗(yàn)單位：日期：樣號采樣地點(diǎn)天牛棲居痕跡線蟲松材線蟲檢驗(yàn)日期檢驗(yàn)人分子生物學(xué)鑒定G.1松材線蟲PCR檢測G.1.1線蟲基因組DNA的提取制作線蟲裂解液(200mmol/LTris-HC1、200mmol/LNaC1、100mmol/LEDTA、2%SDS、2%β-mercaptoethanol、200μg/mL蛋白酶K)，預(yù)冷線蟲裂解液，按照10μL線蟲裂解液：1條線蟲比例，將線蟲與裂解液置于離心管中。置于PCR儀，70℃條件下保溫處理35min，在95℃條件下保溫處理10min后，12000/min離心2min，取上清液。G.1.2反應(yīng)體系每反應(yīng)的混合液總體積為20μL，其中：（1）2.0μL10×快速TaqPCR緩沖液；（2）2μL2.5mmol/L的dNTP；（3）0.3μL快速擴(kuò)增Taq酶；（4）1.5μL10mmol/L的引物組合B；（5）2.0μL的模板DNA；（6）補(bǔ)充高壓滅菌重蒸水至20μL。G.1.3反應(yīng)程序反應(yīng)混合液在98℃預(yù)變性5s，進(jìn)入循環(huán)98℃變性3s，52℃退火3s，72℃延伸40s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸2min。G.1.4結(jié)果檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE或1×TBE，電壓為5V/cm，電泳時(shí)間為30min。置凝膠于302nm透射紫外燈上觀察，拍照。結(jié)果參見圖G.1。圖G.1松材線蟲電泳檢測圖譜注：泳道M-標(biāo)準(zhǔn)DNA；47-49松材線蟲G.2松材線蟲自動化分子檢測G.2.1松材線蟲病試劑盒組成成分名稱數(shù)量DNA提取試劑A液2ml/管×1管松材線蟲裂解緩沖液DNA提取試劑B液200μl/管×1管松材線蟲消化酶pCR擴(kuò)增混合K液500μl/管×1管含TaqDNA聚合酶，dNTP的溶液PCR擴(kuò)增混合P液150μl/管×1管特異性引物、探針線蟲DNA陽性質(zhì)控Y液75μl/管×1管松材線蟲DNA片段陰性質(zhì)控C液1ml/管×1管無酶水G.2.2適用設(shè)備松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)48，松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)48A，松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)mini等松材線蟲熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。G.2.3檢測方法將分離的線蟲置于1.5mL懸浮液離心濃縮，取底部40min，95℃,10min；12000r/min離心3min，取上清液（線蟲DNA溶液）。G.2.4反應(yīng)體系樣品：線蟲DNA溶液3.5μL，加入K液5μL，P液1.5μL。陽性對照：線蟲DNA陽性質(zhì)控Y液3.5μL，加入K液5μL，P液1.5μL。陰性對照：陰性質(zhì)控C液3.5μL，加入K液5μL，P液1.5μL。G.2.5反應(yīng)程序?qū)悠?、陽性對照及陰性對照放入機(jī)器，選擇儀器中松材線蟲自動檢測程序。G.2.6反應(yīng)結(jié)果松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)采用自動程序判讀檢測結(jié)果，如表G.1、G.2。表G.1松材線蟲自動化分子檢測結(jié)果序號顏色組別樣品來源Ct值判定結(jié)果11A125.83含松材線蟲21A220.23含松材線蟲31A328.47含松材線蟲41A423.19含松材線蟲51A527.38含松材線蟲61A621.28含松材線蟲71陽