TFDSA-中成藥中大米源性成分檢測-PCR法

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h\t"標(biāo)準(zhǔn)文件_一級條標(biāo)題,2,標(biāo)準(zhǔn)文件_附錄一級條標(biāo)題,2,"前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14原理 15試劑與材料 16儀器設(shè)備 37試樣選取與制備 38檢測方法 310檢測過程中防止交叉污染的措施 511廢棄物處理 5前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中國食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會并歸口。本文件起草單位：南京江北新區(qū)生物醫(yī)藥公共服務(wù)平臺。本文件主要起草人：。本文件為首次發(fā)布。中成藥中大米源性成分定性檢測方法PCR法范圍本文件規(guī)定了中成藥中大米源性成分檢測的PCR方法。本文件適用于中成藥中大米源性成分的檢測。本方法的檢出限為0.1%。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。PCR法（PolymeraseChainReactionMethod）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，指在PCR體系中加入擴(kuò)增預(yù)混液，利用核酸電泳技術(shù)檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。核酸電泳技術(shù)（NucleicAcidElectrophoresisTechnology）利用核酸電泳技術(shù)鑒定PCR結(jié)果。基因克隆及測序技術(shù)（GeneCloningandSequencingTechnology）利用基因測序儀確定DNA序列。原理利用裂解液提取中成藥中大米源性DNA，以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR陽性產(chǎn)物采用克隆測序進(jìn)行確證。試劑與材料除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水符合GB6682的要求。DNA提取用試劑5.1.1大米源性鑒別引物：5'TTAGCCTCCCGCTGCAGA3'和5'AGAGTCCACAAGTGCTCCCG3'；5.1.2陽性對照：用市售大米樣品做陽性對照；5.1.3超純水；5.1.4瓊脂糖：電泳純；5.1.5乙醇；5.1.6溴化乙錠；5.1.7異丙醇；5.1.8氯仿；5.1.9Tris-HCl；5.1.10EDTA.2Na·2H2O；5.1.11十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）；5.1.12氯化鈉（NaCl）；5.1.13硼酸；5.1.14氯化鎂（MgCl2）；5.1.15濃鹽酸；5.1.16氫氧化鈉；5.1.17溴酚藍(lán)。溶液配制：5.2.170%乙醇：取70ml乙醇（5.1.5）與30ml超純水混勻（5.1.3）；5.2.2氯仿/異戊醇（24：1）抽提液：取24ml氯仿（5.1.8）和1ml異丙醇（5.1.7），混勻；5.2.31mol/LTris-HCl（pH8.0）：稱取Tris-HCl（5.1.9）121.1g溶解于約800ml超純水（5.1.3）中，加濃鹽酸（5.1.15）或氫氧化鈉（5.1.16）調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，用超純水（5.1.3）定容至1L，溶液經(jīng)高溫高壓滅菌后，于室溫下保存；5.2.410mmol/LTris-HCl（pH8.0）：稱取Tris-HCl（5.1.9）1.21g溶解于約800ml超純水（5.1.3）中，加濃鹽酸（5.1.15）或氫氧化鈉（5.1.16）調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，用超純水（5.1.3）定容至1L，溶液經(jīng)高溫高壓滅菌后，于室溫下保存；5.2.50.5mol/LEDTA（pH8.0）：稱取EDTA.2Na·2H2O（5.1.10）186.1g溶解于約800ml超純水（5.1.3）中，加氫氧化鈉（5.1.16）調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，用超純水（5.1.3）定容至1L，溶液經(jīng)高溫高壓滅菌后，于室溫下保存；5.2.61mmol/LEDTA（pH8.0）：稱取EDTA.2Na·2H2O（5.1.10）0.37g溶解于約800ml超純水（5.1.3）中，加氫氧化鈉（5.1.16）調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，用超純水（5.1.3）定容至1L，溶液經(jīng)高溫高壓滅菌后，于室溫下保存；5.2.7TE緩沖溶液(Tris-HCl、EDTA緩沖液)：10mmol/LTris-HCl（5.2.4），1mmol/LEDTA（5.2.6）；5.2.8CTAB提取緩沖液：CTAB（5.1.11）10g、NaCl（5.1.12）40.91g、1mol/LTris-HCl（5.2.3）50ml、0.5mol/LEDTA（5.2.5）20ml，用200ml超純水（5.1.3）溶解，超純水（5.1.3）定容至500ml，滅菌；5.2.9溴化乙錠貯存液：取溴化乙錠（5.1.6），用超純水（5.1.3）配制成10mg/ml；5.2.10電解緩沖液：Tris-HCl（5.1.9）54g，硼酸（5.1.13）27.5g，0.5mol/LTE緩沖溶液（5.2.7）20ml，加超純水（5.1.3）至1000ml，稀釋10倍后使用；5.2.11dNTPs：脫氧腺苷三磷酸（dAMP），脫氧鳥苷三磷酸（dGMP）、脫氧胞苷三磷酸（dCMP）和脫氧胸苷三磷酸（dTMP）；5.2.12PCR預(yù)混液（2×）：TaqDNA聚合酶(0.05U/μL)、反應(yīng)緩沖液、4mMMgCl2和0.4mMdNTPs；5.2.13溴酚藍(lán)指示劑（0.25%）：加1g溴酚藍(lán)（5.1.17）于100ml超純水（5.1.3）中，攪拌至其完全溶解，另取2.5ml上述溶液稀釋至10ml，混勻。儀器設(shè)備6.1常規(guī)PCR檢測系統(tǒng)；6.2核酸電泳儀；6.3電子天平：感量0.01g；6.4高速離心機(jī)：離心力12000g；6.5微量移液器；6.6PCR反應(yīng)管；6.7恒溫水浴鍋；6.8核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)；6.9凝膠成像儀；6.10高速粉碎機(jī)；6.11篩網(wǎng)：100目、60目和20目；6.12離心管：1.5ml；6.13量筒：100ml；6.14微波爐；6.15DNA測序儀。試樣選取與制備選取出具有代表性的樣品適量，用高速粉碎機(jī)粉碎至全部過篩網(wǎng)，使其粒徑小于2mm，充分混合均勻，儲存于潔凈的樣品袋中密封保存，供檢測用。檢測方法樣品中DNA提取稱取粉碎后的樣品（粒度為100目稱取50mg，60目稱取100mg，20目稱取200mg），于1.5ml離心管中，加入600μl~800μlCTAB提取緩沖液（5.2.8），65℃30min，期間不時(shí)振蕩，混勻；12000g離心5min，轉(zhuǎn)移上清液400μl至潔凈離心管中，加入400μl氯仿/異戊醇抽提液（5.2.2），混勻，12000g離心5min，取上清液；加0.8倍體積異丙醇（5.1.7），沉淀，12000g離心5min，棄上清液，70%乙醇（5.2.1）洗滌一次，晾干；加入50μlTE緩沖溶液（5.2.7），溶解沉淀，得模板DNA溶液。備注：也可用等效的DNA提取試劑盒提取模板DNA溶液。DNA純度和濃度的測定取5μl模板DNA溶液加超純水（5.1.3）稀釋至1ml，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA的濃度按式（1）計(jì)算：C=A×N×50/1000(1)式中：C——DNA濃度，單位為微克每微升（μg/μl）；A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)A260/A280比值在1.7~1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增25μl反應(yīng)體系：取PCR預(yù)混液（5.2.12）12.5μl，鑒別引物（50μmol/L）（5.1.1）各0.2μl，模板DNA溶液2.1μl，超純水（5.1.3）10μl于0.2ml的PCR反應(yīng)管；每個(gè)樣品平行制備2份。PCR反應(yīng)條件隨儀器不同略有改變，一般的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min。95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。72℃延伸10min，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。檢測過程分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。用已知米粉樣品作陽性對照，用已知不含大米源性成分的樣品作陰性對照，用等體積的超純水代替模板DNA作空白對照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測取2g瓊脂糖（5.1.4），于100ml電泳緩沖液（5.2.10）中加熱，充分熔化，加入溴化乙錠貯存液（5.2.9）至終濃度為0.5μg/ml，制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液（5.2.10），使液面剛剛沒過凝膠。將5μl-8μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣。9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑（5.2.13）遷移至凝膠中部。紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果并記錄?；蚩寺∨c測序如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果陽性，采用DNA測序儀進(jìn)行克隆測序確證。使用商業(yè)化PCR產(chǎn)物克隆試劑盒，將PCR特征條帶克隆到T載體上，用Sanger法進(jìn)行序列測定，與大米參考序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果判斷與表述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果陽性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為100bp左右?？寺y序結(jié)果陽性樣品克隆測序結(jié)果與給定大米參考序列一致。若出現(xiàn)個(gè)別堿基差異，將克隆測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他大米序列進(jìn)行比對，應(yīng)100%匹配。結(jié)果表述PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果及克隆測序確證都為陽性