05核酸化學(xué)2省公開課一等獎(jiǎng)全國示范課微課金獎(jiǎng)?wù)n件

第五章核酸化學(xué)NucleicAcidNA第1頁四DNA結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列次序。二級(jí)結(jié)構(gòu)：DNA兩條多聚核苷酸鏈間經(jīng)過氫鍵形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)：DNA雙鏈深入折疊卷曲形成構(gòu)象。第2頁（一）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸★DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP經(jīng)過3’、5’-磷酸二酯鍵連接起來線形或環(huán)形多聚體。

第3頁核苷酸之間連接方式：3’,5’-磷酸二酯鍵第4頁書寫方式pTpGpCpApTpTGCAT5’→3’，不可顛倒第5頁(二)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)1953年，Watson&CrickDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型第6頁★Chargaff規(guī)律1950年a.全部生物DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T;b.DNA堿基組成含有種特異性;c.DNA堿基組成沒有組織和器官特異性;d.年紀(jì)、營養(yǎng)情況、環(huán)境等原因不影響DNA堿基組成。第7頁★DNANa鹽纖維和DNA晶體X光衍射分析Franklin第8頁1兩條多核苷酸鏈繞同一個(gè)軸形成右手雙螺旋，螺旋直徑2.0nm。而且兩條多核苷酸鏈?zhǔn)欠聪蚱叫?。?頁2糖-磷酸骨架位于雙螺旋外側(cè)，堿基位于鏈內(nèi)部。糖平面與螺旋中心軸平行，堿基平面與軸垂直。雙螺旋表面有兩個(gè)寬度不一樣溝槽，稱大溝和小溝。第10頁3相鄰堿基對(duì)間軸向距離0.34nm，螺旋軸距3.4nm，10個(gè)核苷酸形成一圈螺旋。第11頁4雙螺旋兩條鏈之間按照A與T，C與G堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)互補(bǔ)配對(duì)(稱Watson-Crick配對(duì))，而且AT之間形成兩個(gè)氫鍵，CG之間形成三個(gè)氫鍵第12頁5維持雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用力

堿基堆積力(最主要)，包含堿基對(duì)芳香環(huán)堆積所產(chǎn)生疏水作用力和堆積堿基對(duì)間范德華力兩條多核苷酸鏈互補(bǔ)堿基對(duì)間氫鍵磷酸基團(tuán)上負(fù)電荷與溶液中陽離子間鹽鍵第13頁（1）

B—DNA：經(jīng)典Watson-Crick雙螺旋DNA右手雙螺旋每圈螺旋10.4個(gè)堿基對(duì)螺距：3.32nm（2）

A-DNA右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子含有這種結(jié)構(gòu)。（3）Z-DNA左手螺旋，外形細(xì)長。天然B-DNA局部區(qū)域能夠形成Z-DNA。DNA雙螺旋其它形式第14頁第15頁第16頁（4）

三股螺旋DNAK.Hoogsteen1963通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋大溝結(jié)合：Oligo(Py):Oligo(Pu)—Oligo(Py/Pu)第17頁★第一股是寡嘧啶，中間是寡嘌呤，第三股能夠是寡嘧啶或寡嘌呤第18頁T=A:A,C≡G：C+T=A:TC≡G：G三股螺旋DNA中Hoogsteen-bonding★第三股與寡嘌呤之間同向平行，并按Hoogsteen配對(duì)第19頁★當(dāng)DNA一段寡嘧啶（寡嘌呤）組成鏡像重復(fù)時(shí)能夠形成三股螺旋（鉸鏈DNA，hingedDNA,H-DNA)H-DNA結(jié)構(gòu)第20頁★DNA三股螺旋結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組起始位點(diǎn)或調(diào)整位點(diǎn)，如開啟子區(qū)。第三股鏈存在可能使一些調(diào)控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏相關(guān)遺傳信息表示。第21頁(三)DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)（1）松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化（2）解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化（3）正超螺旋與負(fù)超螺旋DNA第22頁第23頁第24頁共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，超螺旋DNA超螺旋是指螺旋軸本身扭曲，假如DNA雙螺旋軸沒有扭曲，則為松弛型(relaxedform)。若松弛型環(huán)狀DNA分子一條鏈斷裂，繞另一條完整鏈以解鏈方向(左手)旋轉(zhuǎn)幾圈，當(dāng)末端重新連接起來時(shí)，因?yàn)镈NA雙螺旋旋轉(zhuǎn)不足而會(huì)造成局部解鏈結(jié)構(gòu)，或者經(jīng)過增加每個(gè)螺旋堿基數(shù)來解除它旋轉(zhuǎn)不足。這種因欠旋而產(chǎn)生張力將驅(qū)使DNA形成超螺旋(負(fù)超螺旋)。一樣，若DNA雙螺旋旋轉(zhuǎn)過分會(huì)造成正超螺旋。全部天然DNA超螺旋都是負(fù)超螺旋。第25頁DNA拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)L：連環(huán)數(shù)(linkingnumber)，指兩條鏈相互纏繞次數(shù)。共價(jià)閉合環(huán)狀DNA兩條鏈都不停裂，則不會(huì)改變。T：盤繞數(shù)(twistnumber)，指螺旋圈數(shù)。W：超螺旋數(shù)(writhingnumber)，指DNA超螺旋繞螺旋軸次數(shù)。

L＝T＋W一給定環(huán)狀DNA分子(L不變)因拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)而產(chǎn)生不一樣形式，如松弛型和超螺旋型，稱拓?fù)洚悩?gòu)體。結(jié)構(gòu)相同、L值不一樣DNA分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體。第26頁真核生物染色體DNA(線形雙螺旋結(jié)構(gòu))在核小體中扭曲也是一個(gè)超螺旋DNA負(fù)超螺旋有利于DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄時(shí)雙螺旋打開第27頁真核細(xì)胞染色體DNA特點(diǎn)重復(fù)序列高度重復(fù)序列在基因組中出現(xiàn)幾千～幾百萬次，如衛(wèi)星DNA。人染色體中約占20％。不被轉(zhuǎn)錄中度重復(fù)序列十幾～幾百次。人約占12％。有些作為基因，如rRNA與tRNA基因，組蛋白基因，免疫球蛋白基因。有些是非轉(zhuǎn)錄區(qū)，與基因表示調(diào)控相關(guān)。輕度重復(fù)序列與單一序列絕大多數(shù)蛋白質(zhì)基因原核生物中重復(fù)序列極少存在第28頁回文結(jié)構(gòu)，反向重復(fù)，180度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱第29頁基因中插入序列真核生物基因中存在非編碼序列，稱插入序列?；蚓幋a區(qū)稱外顯子(exon)，其間插入序列稱內(nèi)含子(intron)第30頁五RNA結(jié)構(gòu)tRNA結(jié)構(gòu)分子量約25000，4S。60～95個(gè)核苷酸，多數(shù)為76個(gè)。約有15個(gè)位置堿基是不變，約8個(gè)位置半不變。3’端CCA，為接收氨基酸位置。反密碼子能識(shí)別mRNA密碼子含有較多修飾成份。第31頁tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)：

三葉草形第32頁tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)：

倒L形第33頁真核生物mRNA結(jié)構(gòu)5’-帽子

m7G經(jīng)過特殊5’,5’-三磷酸連接。與翻譯起始相關(guān)，并可預(yù)防5’-核酸外切酶水解原核生物無帽子結(jié)構(gòu)5’-帽子5’-非編碼區(qū)編碼區(qū)3’-非編碼區(qū)polyA第34頁P(yáng)oly(A)尾巴真核生物成熟mRNA3’-端有一段長100～200個(gè)腺苷酸Poly(A)尾巴，Poly(A)可提升mRNA穩(wěn)定性。可用Oligo(dT)接在纖維素上，作成親和層析柱來純化真核生物mRNA。第35頁六核酸性質(zhì)和慣用研究方法普通性質(zhì)DNA分子量106～1010白色纖維狀晶體RNA分子量104～106白色粉末或晶體第36頁DNA在堿中穩(wěn)定RNA在堿中易分解酸性溶液中糖苷鍵易斷裂第37頁核酸紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm紫外波段有強(qiáng)烈光吸收λmax=260nm第38頁1、判定純度純DNAA260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85）純RNAA260/A280應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值顯著降低。2、含量計(jì)算1ABS值相當(dāng)于：50μg/mL雙螺旋DNA或：40g/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判斷DNA是否變性在DNA變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大（增色效應(yīng)）在DNA復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減?。p色效應(yīng)）第39頁紫外吸收(260nm)E(p)克原子磷消光系數(shù)每升含1摩爾磷核酸溶液在一定pH(pH=7)，一定波長(260nm)，光徑為1cm時(shí)光吸收值DNA：E(p)6000～8000RNA：E(p)7000～10000第40頁增色效應(yīng)：核酸變性或降解后，其堿基暴露使E(p)值增高減色效應(yīng)：變性核酸復(fù)性后其紫外吸收強(qiáng)度或E(p)值下降第41頁沉降不一樣介質(zhì)密度梯度超離心DNA氯化銫RNA蔗糖可得到浮力密度，G＋C含量以及分離核酸第42頁浮力密度測定密度梯度沉降平衡測出核酸密度用已知密度DNA作參考，離心測rρ＝ρo＋4.2ω2(r2-ro2)×10-10(g/cm3)第43頁DNA中G-C含量測定ρ∝(G+C)%ρ=0.100(G+C)%+1.658(g/cm3)第44頁第45頁核酸分離和核酸構(gòu)象測定浮力密度RNA＞環(huán)狀DNA環(huán)狀DNA＞線狀DNA＞蛋白質(zhì)單鏈DNA＞雙鏈DNA石蠟油蛋白質(zhì)開環(huán)及線性DNA質(zhì)粒DNARNA染料-CsCl密度梯度超離心分離質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)第46頁核酸變性、復(fù)性和雜交變性(denaturation)指核酸雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，變成單鏈紫外吸收增高、粘度降低、浮力密度升高、生物活性降低或消失第47頁變性DNA變性過程★核酸雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，變成單鏈，不包括共價(jià)鍵斷裂。第48頁

★變性原因：熱變性酸堿變性（pH小于4或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）

★變性后理化性質(zhì)：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。第49頁★

增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)：在DNA變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應(yīng)：在DNA復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。★DNA變性是暴發(fā)式，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄溫度范圍內(nèi)。第50頁Tm(meltingtemperature)熔點(diǎn)或熔解溫度E(p)最大改變值1/2時(shí)溫度，或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去二分之一時(shí)溫度影響原因DNA均一性均一性越高，熔點(diǎn)越高G-C含量：成正比Tm=69.3+0.41×G-C%介質(zhì)中離子強(qiáng)度越高熔點(diǎn)越高第51頁1、

熔解溫度（Tm）：★DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去二分之一時(shí)對(duì)應(yīng)溫度。濃度50μg/mL時(shí)，雙鏈DNAA260=1.00，完全變性（單鏈）A260=1.37當(dāng)A260增加到最大增大值二分之一時(shí)，即1.185時(shí)，對(duì)應(yīng)溫度即為Tm。DNATm普通在82—95℃之間第52頁2、

影響DNATm值原因①DNA均一性。均一性高，變性溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA均一性。第53頁②G-C含量與Tm值成正比。測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44Tm值與GC含量關(guān)系第54頁③介質(zhì)中離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度高，Tm高。第55頁復(fù)性(renaturation)變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)

物化性質(zhì)、生物活性恢復(fù)影響原因DNA濃度和均一性濃度越高，越均一，復(fù)性越快溫度維持在比Tm低25℃最正確。驟然冷卻，不能復(fù)性DNA分子量和DNA復(fù)雜程度分子量越大，越復(fù)雜，復(fù)性越慢離子強(qiáng)度增加鹽濃度，復(fù)性加緊第56頁★復(fù)性機(jī)制：10-20bp成拉鏈★熱變性DNA在遲緩冷卻時(shí)能夠復(fù)性，快速冷卻不能復(fù)性?！顳NA片段越大，復(fù)性越慢；★DNA濃度越大，復(fù)性越快?！飶?fù)性速度可用Co·t衡量。Co為變性DNA原始濃度mol·L-1，t為時(shí)間，以秒表示。第57頁不一樣DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)曲線第58頁●1個(gè)核苷酸對(duì)（A.U），若濃度為Co=1.0mmol/L，則50%復(fù)性時(shí)，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部復(fù)性，Cot=10-4，t=0.1秒●E.coli4.2×106堿基對(duì)，若濃度Co=1.0umol/L，則復(fù)性50%，Cot1/2=10mol.s/L，t=107秒，約115天。復(fù)性100%，Cot=500mol.s/L，t=5×108秒，5758天?！褚罁?jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)能夠測定基因組大小和重復(fù)序列拷貝數(shù)第59頁雜交(hybridization)兩種起源不一樣含有互補(bǔ)堿基序列多核苷酸在溶液冷卻時(shí)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)SouthernblottingDNA-DNANorthernblottingDNA-RNA第60頁1、

SouthernBlottingDNA樣品→酶切→電泳→堿變性→轉(zhuǎn)膜→固定→雜交→洗滌→放射自顯影變性（NaOH0.5mol/L）轉(zhuǎn)膜（NC膜，尼龍膜）固定（80℃，4-6h）雜交（高鹽濃度，68℃，幾小時(shí)）SouthernBlotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列大小和定位。第61頁第62頁第63頁SouthernblottingDNA瓊脂糖電泳，堿變性印跡轉(zhuǎn)移與探針雜交

探針為同位素標(biāo)識(shí)