液相色譜分析儀法課件

高效液相色譜分析法一、高效液相色譜儀HPLC二、高效液相色譜法的特點featureofHPLC三、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC四。固定相和流動相主講:王慶俐highperformanceliquidchromatographfeatureandinstrumentofHPLC2025/2/211精選課件一、液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph

目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。2025/2/212精選課件液相色譜儀（1）

highperformanceliquidchromatograph

2025/2/213精選課件液相色譜儀（2）2025/2/214精選課件液相色譜儀（3）2025/2/215精選課件液相色譜儀（4）2025/2/216精選課件二.概論：

㈠定義：以液體為流動相的色譜法稱為液相色法。用常壓輸送流動相的方法為經(jīng)典液相色譜法，這種色譜法的柱效能低、分離周長。高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，簡稱HPLC）是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種色譜方法。與經(jīng)典的液相色譜法相比，高效液相色譜法具有下列主要優(yōu)點：2025/2/217精選課件1.應(yīng)用了顆粒極細（一般為10μm以下）規(guī)則均勻的固定相，柱效高，分離效率高；2.采用高壓輸液泵輸送流動相，流速快，一般試樣的分析需數(shù)分鐘，復(fù)雜試樣分析在數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成；3.廣泛使用了高靈敏檢測器，大大提高了靈敏度。目前，已發(fā)展了多種固定相，有多種不同的分離模式，使高效液相色譜法的應(yīng)用范圍不斷擴大。2025/2/218精選課件㈡.色譜法分類

按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC):適用于分離揮發(fā)性化合物。有機物質(zhì)中分子量小于400的采用氣相色譜法分析，此范圍的物質(zhì)約占有機物質(zhì)總數(shù)15%~20%.液相色譜法(LC):適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。分子量為400~2000的有機物質(zhì)可采用液相色譜法分析，而分子量大于2000的則須用凝膠色譜法。2025/2/219精選課件按固定相性質(zhì)及外形分類柱色譜:固定相裝在柱管內(nèi)的色譜分析法紙色譜:固定相為濾紙的色譜分析法薄層色譜:固定相壓成或涂成薄膜的色譜分析法2025/2/2110精選課件（三）HPLC的主要分離類型和原理：

高效液相色譜法按分離機理的不同主要分為四類：1.

液-固吸附色譜（liquid-solidadsorptionchromatography）固定相：固體吸附劑。如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動相：主要是非極性的烴類（如己烷、庚烷）并加入少量極性溶劑作緩和劑（如水、甲醇）?；驹恚航M分在固定相吸附劑表面對不同物質(zhì)吸附能力不同使混合物分離的；吸附力越強,保留時間越長,反之,保留時間短,。適用于分離分子質(zhì)量中等（200~1000）的油溶性試樣或極性較小的植物色素等組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，。常用于分離同分異構(gòu)體不適宜于分離強極性的離子型化和物和同系物。

缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾（離子型化合物易產(chǎn)生拖尾）；2025/2/2111精選課件2.液-液分配色譜

（liquid-liquidpartition

chromatography）

固定相與流動相均為液體，流動相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進行分配。達到平衡時，服從于下式：

K=式中，Cs—溶質(zhì)在固定相中濃度；Cm--溶質(zhì)在流動相中的濃度；分離的順序取決于K值，在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分保留值大；后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。

2025/2/2112精選課件基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。固定相：將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面，或化學(xué)鍵合于擔體表面而形成的

液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC);

流動相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反。2025/2/2113精選課件正相色譜法：由極性固定相(如氨基與腈基鍵合相)和非極性（或弱極性）流動相(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷）所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱、氨基柱等，代表性的流動相是正己烷。用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。吸附色譜也屬于正相色譜反相色譜法；由非極性固定相和極性流動相所組成的HPLC體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱、C18、C8），代表性的流動相是甲醇-水和乙腈-水或水的緩沖液。是當今液相色譜的最主要分離模式。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。

2025/2/2114精選課件液-液分配色譜固定相的液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現(xiàn)性很差，后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展了一種新型固定相---化學(xué)鍵合固定相?；瘜W(xué)鍵合固定相：通過化學(xué)反應(yīng)將固定液（各種不同基團）鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。在HPLC整個應(yīng)用中占80%以上。鍵合固定相的載體主要是硅膠，根據(jù)在硅膠表面（具有--≡Si--OH基團）化學(xué)反應(yīng)不同可制成四種鍵合相：（1）硅氧碳型（≡Si—O—C=，硅膠與醇類發(fā)生酯化反應(yīng)）。（2）硅碳型（≡Si—C=，硅膠與鹵代烷反應(yīng)）。（3）硅氮型（≡Si—N=，硅膠與胺類反應(yīng)）。（4）硅氧烷型（≡Si

—O—Si—C=，硅膠與有機硅烷反應(yīng)）。穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣2025/2/2115精選課件化學(xué)鍵合色譜與液液分配色譜一樣，也可分為正相和反相色譜。反相鍵合色譜采用非極性固定相，鍵合的基團有C2、C4、C6、C8、C18、C22烷基和苯基。其中最常用的是C18，又稱ODS一十八烷基硅烷鍵合相。所用的流動相為極性溶劑，以水為底溶劑,再加入有機溶劑,最常用的是甲醇-水、乙腈-水和四腈呋喃-水。正相鍵合色譜采用極性固定相，如氨基、腈基等極性基團；非極性或弱極性流動相，一般為烴類溶劑，如己烷、庚烷等。2025/2/2116精選課件（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；（3）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（4）有利于梯度洗脫；化學(xué)鍵合固定相的特點2025/2/2117精選課件正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動相極性低～中中～高組分洗脫次序

極性小的先洗出極性大的先洗出從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）2025/2/2118精選課件3.離子交換色譜

（ion-exchange

chromatography）固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：堿金屬、堿土金屬等離子混合物的分離；食品中添加劑和污染物的分離；生物大分子如氨基酸、核酸等。2025/2/2119精選課件4.體積排阻色譜

（size-exclusionchromatography）

凝膠(具有一定大小孔隙分布)

固定相：化學(xué)惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、親水凝膠、無機多孔材料,是有一定孔徑的多孔性填料。流動相：在凝膠色譜中，流動相的作用不是為了控制分離，而是為了溶解樣品或減小流動相粘度。凝膠過濾色譜（gelfiltrationchromatography,GFC）：以水或緩沖溶液作流動相的凝膠色譜法。主要適合于水溶性高分子的分離。凝膠滲透色譜（gelpermeationchromatography,GPC）：以有機溶劑作流動相的凝膠色譜法。主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的測定。

2025/2/2120精選課件基本原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。常用的流動相為水、四腈呋喃等可對相對分子質(zhì)量在2000以上范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離,如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。2025/2/2121精選課件分離類型選擇

choiceofseparationtypes2025/2/2122精選課件基本概念和術(shù)語：

色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見

色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)。

基線(baseline)——經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時間軸。2025/2/2123精選課件

噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。

漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。

拖尾因子(tailingfactor，T)—T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)?！吨袊幍洹芬?guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。2025/2/2124精選課件

保留時間(retentiontime，tR)——從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。

分配系數(shù)(distributioncoefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。

K＝

式中Cs、Cm分別是組分在固定相和流動相中溶質(zhì)的濃度。2025/2/2125精選課件分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)；離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))；凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。

理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumberN)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。2025/2/2126精選課件三.高效液相色譜法的特點

featureofHPLC

特點：高壓、高效、高速高靈敏度流動相選擇范圍廣。是高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2025/2/2127精選課件高壓——壓力可達150~420Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速——流速為0.1~10.0ml/min。高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。流動相選擇范圍廣-------大部分的有機溶劑以及水和有機溶劑的混合物均可用。2025/2/2128精選課件四.HPLC的系統(tǒng)組成和工作原理：（一）系統(tǒng)組成：高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)五大部分組成。

1.高壓輸液系統(tǒng)：由溶劑貯存器、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。

2.進樣系統(tǒng)：包括進樣口、注射器和進樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進行分離。

3.分離系統(tǒng)：包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。

4.檢測系統(tǒng)：檢測器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。

5.記錄系統(tǒng)；紀錄儀、積分儀、色譜工作站2025/2/2129精選課件（二）工作原理儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),

在兩相中作相對運動時,經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別,

被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。2025/2/2130精選課件五.流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.工作流程：高壓泵將樣品由流動相帶入色譜柱分離后，經(jīng)檢測器將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒎糯?，最后以圖譜的形式顯示在工作站熒屏上。2025/2/2131精選課件2.主要部件(1)高壓輸液泵：有恒流泵和恒壓泵兩種。主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），當液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性（動畫）2025/2/2132精選課件泵的使用和維護注意事項

①防止任何固體微粒進入泵體

:過濾流動相②流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)過夜或更長時間。否則由于溶液的靜置，可能析出鹽的微細晶體，損壞密封環(huán)和柱塞等③泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運轉(zhuǎn)會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。⑤流動相必須先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性2025/2/2133精選課件(2)梯度淋洗裝置梯度洗脫就是在分離過程中使用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應(yīng)地變化，達到提高分離效果，縮短分析時間的目的。梯度洗脫裝置分為兩類：一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度）。一類是內(nèi)梯度裝置（又稱高壓梯度）。相當于氣相色譜中的程序升溫。2025/2/2134精選課件內(nèi)梯度（高壓）:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。外梯度（低壓）:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2025/2/2135精選課件梯度洗脫裝置是通過兩個輸液泵流速的變化，改變流動相的洗脫能力，其作用與氣相色譜的程序升溫類似。ABABCC2025/2/2136精選課件(3)進樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)。包括進樣口、注射器和進樣閥等，其作用是將試樣有效地送入色譜柱上進行分離。通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置和自動進樣器，其結(jié)構(gòu)如圖所示：

2025/2/2137精選課件六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45μm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥。

2025/2/2138精選課件(4)高效分離柱色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。

1.構(gòu)造：色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1~6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

2.分類：色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類

①常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑常用4.6mm，柱長15或25cm；②毛細管柱（又稱微柱，內(nèi)徑0.2~0.5mm；③實驗室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm2025/2/2139精選課件柱的使用和維護注意事項

1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械動

2.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，3.色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖，除去留在柱頭的雜質(zhì)。4.選擇適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落

5.避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)

6.經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)

7.保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。

通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料如C18柱，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。2025/2/2140精選課件(5)液相色譜檢測器它是色譜儀的的“眼睛”，是測量色譜柱流出組分濃度變化的裝置。分為兩類；1.通用型檢測器，它是連續(xù)測定柱后流出液（流動相加溶質(zhì)）總的物理性質(zhì)的變化，如示差折光檢測器和電導(dǎo)檢測器；近年來出現(xiàn)了新興的通用型檢測器----蒸發(fā)散射光檢測器。適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。2.選擇性檢測器（溶質(zhì)性檢測器），它是測定流出液中溶質(zhì)（待測組分）的物理性質(zhì)的變化，對流動相無信號，如紫外檢測器和熒光檢測器。目前最常用的主要有紫外--可見光光度檢測器，熒光光度檢測器和示差折光檢測器。2025/2/2141精選課件檢測器的性能指標:1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內(nèi)的變化為漂移。

2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時所給出的信號大小。3）檢測限(detectionlimit)

：指恰好產(chǎn)生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進入檢測器的某組分的量。檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數(shù)值越小，檢測器性能越好4）線性范圍(linearrange)：指檢測器的響應(yīng)信號與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。。5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10μl。

2025/2/2142精選課件a.紫外-可見光檢測器是應(yīng)用最廣的一種選擇性檢測器，對大部分有機化合物有響應(yīng)。作用原理：是待測組分對特定波長的紫外或可見光有選擇性吸收，適合于紫外或可見光區(qū)有吸收的物質(zhì)的測定。檢測器輸出信號的大小即吸光度與待測組分的濃度之間服從郎伯-比爾定律。按波長可分為固定波長和可變波長兩類。固定波長中用的最多的是UV-254，其次是UV-280，采用低壓汞燈為光源，可檢測許多有機化合物?？勺儾ㄩL檢測器多采用氘燈或鎢燈為光源，提供200~800nm范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)的紫外、可見光，可按樣品的吸收特征任意選擇工作波長。其靈敏度小于固定波長檢測器2025/2/2143精選課件

紫外檢測器的特點：

①靈敏度高（10-9g)；②線性范圍寬(105)；③流通池很?。?mm×10mm容積5--8μL）④對流動相的流速和溫度變化不敏感；⑤波長可選，易于操作；⑥可用于梯度洗脫。

2025/2/2144精選課件b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2025/2/2145精選課件2025/2/2146精選課件光電二極管陣列檢測器2025/2/2147精選課件c.示差折光檢測器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；2025/2/2148精選課件示差折光檢測器2025/2/2149精選課件d.熒光檢測器（fluorescencedetector）高靈敏度(10-11g)、高選擇性；線性范圍不如UV檢測器，僅為103。適合于有л-л共軛體系的大分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜并能產(chǎn)生強熒光的化合物。對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。其結(jié)構(gòu)和原理與一般的熒光光度儀基本相似，不同處在于其樣品池是一種體積極小和無液體擾動的在線樣品池。2025/2/2150精選課件六.固定相和流動相㈠固定相：固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。⒈

表面多孔型固定相(薄殼型填料)

它的基體是實心玻璃球，在球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、氧化鋁等。這類固定相出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，梯度淋洗時能迅速達到平衡，較適合做常規(guī)分析。2025/2/2151精選課件⒉全多孔型固定相

由直徑為3~10nm的全孔硅膠、氧化鋁、硅藻土微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細（5~10um），傳質(zhì)速率快，特點是柱效高，分離能力強，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。

⒊化學(xué)鍵和相固定相它是近幾年發(fā)展起來的一種新型固定相，是用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機分子結(jié)合到載體表面。如烷基（C18、C8）、氨基、氰基等。2025/2/2152精選課件㈡流動相

由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親合力，并參與固定相對組分的競爭，因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。⒈對流動相溶劑的基本要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑與檢測器匹配。（3）高純度:有機溶劑一般為色譜純試劑，水為高純水。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好（5）低粘度溶劑，如甲醇、乙腈等。（6）配好的流動相必須超濾（0.45um）

（7）使用前還需脫氣（真空、通N2、超聲波）

2025/2/2153精選課件2.流動相類別按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水。若采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2025/2/2154精選課件3.流動相選擇在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2025/2/2155精選課件七.最常用的色譜定性定量分析方法

㈠

定性分析在色譜分析中最常用的簡便可靠的定性方法是用已知物（標準樣）定性法（即保留時間定性法）。這個方法的依據(jù)是：在一定的固定相和一定的操作條件下（如柱長、柱填料、流速），任何物質(zhì)都有確定的保留值（保留時間）。測定時只要在相同的操作條件下，分別進樣，測定已知物和未知組分的保留值。如果保留值相同，可認為是同一化合物。

2025/2/2156精選課件㈡

定量方法：

⒈歸一化法：指將所有出峰組分的含量之和按100%計算的定量方法。如果樣品中所有組分都能流出并有響應(yīng)信號可用此法。

歸一化法的優(yōu)點:簡便、準確，不必準確稱量和進樣操作條件對結(jié)果影響較小。此法不適用于痕量分析。2025/2/2157精選課件2.內(nèi)標法：⑴內(nèi)標物要滿足以下要求：a.試樣中不含有該物質(zhì)；b.與被測組分性質(zhì)比較接近；c.不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；d.出峰位置應(yīng)位于被測組分附近，且無組分峰影響。2025/2/2158精選課件⑵內(nèi)標法特點(a)內(nèi)標法的準確性較高，操作條件和進樣量的稍許變動對定量結(jié)果的影響不大。(b)每個試樣的分析，都要進行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析。2025/2/2159精選課件3.外標法：以與待測組分同質(zhì)的物質(zhì)作為參比物（標準物），根據(jù)樣品量和標準物的量，以及待測組分和標準物的響應(yīng)信號進行定量的方法。外標法又稱標準曲線法和單點校正法等。⑴標準曲線法：用標準物配成濃度遞增的標準溶液系列，在一定操