第四章蛋白類酶的分離純化課件

第四章酶的分離純化1、酶分離純化的原因（3條）2、酶分離純化鑒定的依據(jù)－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性（9條）內(nèi)容1、酶的提取與分離純化技術(shù)路線2、細(xì)胞破碎3、酶的提取4、酶的分離方法5、酶的組合分離純化策略6、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布3.1酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心，過濾、沉淀、層析分離、電泳、萃取、結(jié)晶等分離方法酶的純化過程，約可分為三個(gè)階段：(1)粗蛋白質(zhì)

(crudeprotein):采樣

→均質(zhì)打破細(xì)胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。(2)部分純化(partiallypurified):初步的純化，使用各鐘柱層析法。(3)均質(zhì)酶

(homogeneous):目標(biāo)酶的進(jìn)一步精制純化，可用制備式電泳或HPLC。酶分離純化不同階段3.2細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法

物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法

化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。

3.3酶的提取

提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。為了使蛋白質(zhì)充分溶解并保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性，蛋白質(zhì)提取緩沖液常包含的成分控制溶液pH值的緩沖對(duì)；控制溶液離子強(qiáng)度的無機(jī)鹽；控制溶液氧化還原狀態(tài)的還原劑；蛋白酶抑制劑離子螯合劑標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白去污劑水和防腐劑甘油酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。3.4

酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離5、電泳分離6、萃取分離1、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原理

鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。鹽析的主要原理在于高濃度鹽離子與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化膜，同時(shí)由于反離子作用，也影響蛋白質(zhì)分子所帶電荷

在一定的溫度和pH值條件下（β為常數(shù)），通過改變離子強(qiáng)度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為β分段鹽析公式logS=logS0-KsI=β-KsI在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。在鹽析時(shí)，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示（指溶液中加入的飽和硫酸銨的體積與混合溶液總體積的比值）解讀蛋白質(zhì)工程p204頁表7－3

有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時(shí)水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。

溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對(duì)于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。

常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等2、離心分離

離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。

常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī),其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min，相對(duì)離心力達(dá)到1×104～1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機(jī)超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)(2.5～12)×104r/min，相對(duì)離心力可以高達(dá)5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。超速離心有三種：差速離心：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法密度梯度離心：使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。必須預(yù)先配制好適宜的密度梯度系統(tǒng)離心前將樣品小心地鋪放在預(yù)先制備好的密度梯度溶液的表面。（密度相近，分子量不同）梯度較淺，密度較低等密度梯度離心：分離密度不同的顆粒，欲分離顆粒處于密度梯度中的等密度點(diǎn)（平衡）才可停止離心，操作時(shí)先把一定濃度的介質(zhì)溶液與樣品液混合均勻。（密度不同，分子量相近）梯度陡峭，密度較高密度梯度離心前用密度梯度混合器預(yù)先配制密度梯度系統(tǒng)，貯液室與混合室的截面積關(guān)系決定梯度類型。配制中，將稀溶液置于貯液室B，濃溶液置于混合室A,如圖4-2(郭勇酶工程p96）流出的梯度液經(jīng)過導(dǎo)管小心收集于離心管，如果濃溶液置于貯液室B，稀溶液置于A室，梯度液的導(dǎo)液管必須直插到離心管的管底，讓后來流入的濃度高的混合液將先流入的濃度較低的混合液頂浮起來形成由管口到管底逐步升高的密度梯度超速離心機(jī)按照其用途可以分為制備用超速離心機(jī)、分析用超速離心機(jī)和分析-制備兩用超速離心機(jī)3種蛋白質(zhì)分子在離心時(shí)，其分子量、分子密度、組成、形狀

等，均會(huì)影響其沉降速率，沉降系數(shù)即用來描述此沉降性質(zhì)；其單位為

S

(Svedbergunit)。

每一種的沉降系數(shù)與其分子密度或分子量成正比。不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)，可利用超高速離心法，在密度梯度中作分離。3、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)

膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)

過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同

)

類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜

借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時(shí)選擇。膜分離加壓膜分離

微濾超濾反滲透電場(chǎng)膜分離

電滲析離子交換膜電滲析

擴(kuò)散膜分離透析根據(jù)膜材料和不同進(jìn)料液的特性，商品應(yīng)用的膜產(chǎn)品通常采取如下幾種結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。膜技術(shù)

截留物尺寸nm（分子量）

推動(dòng)力

分離機(jī)理

微濾MF

>20(>40,000)

壓力差，>100kPa

篩分

超濾UF

1～20(10,000--40,000)

壓力差>100kPa

篩分

納濾NF

>1(100～1000)

壓力差，<1000kPa優(yōu)先吸附、表面電位

反滲透RO

(>100)

壓力差，>1000kPa

優(yōu)先吸附、溶解擴(kuò)散

四種常用膜分離技術(shù)的基本特征

四種常用膜分離過程的截留特性4、層析分離層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的(稱為固定相)，另一個(gè)相則流過此固定相(稱為流動(dòng)相)并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離（分子表面特性）分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離（溶解度）離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的（帶電性質(zhì)）凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離（分子大小）親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化（分子形狀）層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離吸附層析

吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。

溶劑洗脫法－采用單一或混合的溶劑進(jìn)行洗脫，各組分按照由弱到強(qiáng)的順序先后流出，以洗脫液對(duì)組分濃度作圖呈峰狀，兩組分之間有一空白。若兩峰重疊或拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)，可采用按一定規(guī)律變化的pH梯度或濃度梯度洗脫置換洗脫法－置換洗脫液中有一吸附力比被吸附組分更強(qiáng)的物質(zhì)取代被吸附成分，后者按照吸附力由弱到強(qiáng)的順序流出，以洗脫液對(duì)組分濃度作圖，可得到階梯式的洗脫曲線前緣洗脫法－用含有各組分的混合溶液本身作洗脫液，連續(xù)加入吸附層析柱，吸附劑飽和時(shí)吸附力最弱的組分開始最先流出。其洗脫曲線雖然也呈階梯型，但只有吸附力最弱的組分得以和其它組分分離，僅用于分析前緣組分分析分配層析定義：分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法分配系數(shù)：是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)

在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動(dòng)，稱為流動(dòng)相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動(dòng)相的帶動(dòng)下流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分配按固定相的介質(zhì)分

紙上層析分配薄層層析分配氣相層析分配層析按固定相的極性不同分為

正相分配層析（極性溶劑為固定相）

反相分配層析（非極性有機(jī)溶劑為固定相）離子層析離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。離子交換層析介質(zhì)由三部分組成：惰性支持物；帶電基團(tuán)；（帶電基團(tuán)的）平衡離子通常所說的離子交換實(shí)際上是蛋白質(zhì)分子與平衡離子間相互交換，他們共同競(jìng)爭(zhēng)離子交換層析介質(zhì)中的帶電基團(tuán)陽離子交換層析－平衡離子為陽離子，層析介質(zhì)的帶電基團(tuán)帶有負(fù)電陰離子交換層析－平衡離子為陰離子，層析介質(zhì)的帶電基團(tuán)帶有正電1、離子交換劑的選擇應(yīng)根據(jù)欲分離組分的特性和要求，過強(qiáng)的吸附以及極端的洗脫條件都可能造成活性分子的變性失活；另外溶液的pH直接決定離子交換劑活性基團(tuán)及組分離子的解離程度，從而影響了離子交換劑的交換容量和交換的選擇性選擇離子交換劑時(shí)考慮因素：

1）離子交換劑和組分離子的物理化學(xué)性質(zhì)；

2）組分離子所帶電荷種類；

3）溶液中組分離子的濃度高低；

4）組分離子的質(zhì)量大?。?/p>

5）組分離子與離子交換劑的親和力大小2、離子交換劑的處理

1）溶脹、洗滌至澄清；

2)4V2mol/LHCl進(jìn)行酸處理，洗滌；

3)4V2mol/LNaOH進(jìn)行堿處理，洗滌；

4）裝柱

5）用適當(dāng)?shù)脑噭┻M(jìn)行轉(zhuǎn)型處理，使離子交換劑上所帶的可交換離子轉(zhuǎn)變?yōu)樗桦x子例如，陽離子交換劑（如）用NaOH處理，轉(zhuǎn)變?yōu)镹a+型，用HCl處理，轉(zhuǎn)變?yōu)镠+型；陰離子交換劑用NaOH處理，轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型，用HCl處理轉(zhuǎn)變?yōu)镃l-型離子交換劑有離子交換樹脂、纖維素、凝膠，某些大孔徑的離子交換樹脂、纖維素、凝膠可用于酶的分離純化。離子交換層析介質(zhì)吸附蛋白的量很大，相比于分子篩層析，所用層析柱短而粗處理好的離子交換劑可以在交換槽中進(jìn)行分批離子交換，也可以將離子交換劑裝進(jìn)離子交換柱進(jìn)行連續(xù)離子交換離子層析分離過程包括1、裝柱：干法裝柱和濕法裝柱，裝填成均勻、無氣泡、無裂縫的離子交換柱2、上柱:轉(zhuǎn)型后，用溶劑或緩沖液進(jìn)行平衡，然后將欲分離的混合液加入離子交換柱中。上柱時(shí)混合液中鹽離子濃度不能過高、還要注意混合液的溫度和pH值上柱時(shí)要控制合適的流速3、洗脫：洗脫液應(yīng)當(dāng)含有與離子交換劑的親和力較大的離子，要通過試驗(yàn)確定洗脫流速。洗脫過程中，組分離子按照與交換劑親和力由大到小的順序先后洗出。對(duì)多組分為達(dá)到良好的分離效果，常用濃度梯度或pH梯度洗脫法，每一種又可選用階段梯度洗脫或連續(xù)梯度洗脫，后者分辨率更高。離子層析分離過程包括4、收集：與離子層析柱親和力最小的組分先流出，通過紫外檢測(cè)器檢測(cè)從層析柱中流出液體在280nm的光吸收值，同時(shí)用部分收集器收集。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，以280nm的光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫峰的位置，確定不同大小的蛋白質(zhì)所在試管，進(jìn)一步用電泳手段鑒定目標(biāo)蛋白5、交換劑再生：酸－堿－酸處理堿－酸－堿處理凝膠層析

凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)凝膠層析的基本原理凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的為了定量地衡量混合液中各組分的流出順序，常常采用分配系數(shù)Ka來量度

Ve洗脫體積，表示某一組分從加進(jìn)層析柱到最高峰出現(xiàn)時(shí)，所需的洗脫液體積；Vo

外體積，即為層析柱內(nèi)凝膠顆?？障吨g的體積VI

內(nèi)體積，即為層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔的體積Ka＝Ve-V0VI如果某組分的分配系數(shù)Ka=0，即Ve=Vo，說明該組分完全不能進(jìn)入凝膠微孔，洗脫是最先流出；如果某組分的分配系數(shù)Ka=1，即Ve=Vo+VI，說明該組分可以自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入到凝膠顆粒內(nèi)部的所有微孔，洗脫是最后流出；如果某組分的分配系數(shù)Ka在0～1，說明該組分分子大小介乎大分子和小分子之間，可以進(jìn)入凝膠的微孔，但是擴(kuò)散速度較慢，洗脫時(shí)按照Ka值由小到大的順序先后流出。

在凝膠對(duì)組分沒有吸附作用情況下，且Ve=Vo+VI，所有組分都應(yīng)該被洗脫出來，Ka最大值為1當(dāng)Ka大于1時(shí)，說明此層析不是單純的凝膠層析，還存在吸附層析或離子交換層析對(duì)同一類型的化合物，凝膠層析的洗脫特性與組分的相對(duì)分子量呈函數(shù)關(guān)系，洗脫時(shí)組分按相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出。Ve=K1-K2lgM在實(shí)際應(yīng)用中，常以相對(duì)洗脫體積Kav對(duì)lgM作曲線，稱為選擇曲線相對(duì)洗脫體積是指組分洗脫體積與層析柱內(nèi)凝膠床總體積之比值Kav＝Ve/VtlgMKav3.54.04.55.05.56.001.00.5選擇曲線的斜率說明凝膠的特性。每一類型化合物都有其各自特定的選擇曲線。如此圖所示，可以通過凝膠層析測(cè)定物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量凝膠的選擇與處理常用的凝膠材料主要有葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠，層析用的微孔凝膠是由凝膠材料與交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而成，交聯(lián)劑有環(huán)氧氯丙烷選擇凝膠主要是依據(jù)欲分離組分的分子質(zhì)量大小。凝膠顆粒直徑大小對(duì)層析柱內(nèi)溶液的流速有一定影響，應(yīng)選擇大小比較均勻的商品凝膠，使用前需將凝膠于洗脫液中充分溶脹。溶脹通常采用熱水溶脹（2－3小時(shí)），這樣也達(dá)到消毒和排出凝膠內(nèi)氣泡的目的溶脹后凝膠用傾瀉法除去小顆粒，經(jīng)減壓排氣即可裝柱凝膠層析操作過程凝膠層析的操作一般包括裝柱、上柱、洗脫等過程裝柱：柱內(nèi)先充滿洗脫劑，然后一邊攪拌一邊緩慢而連續(xù)地加入濃稠的凝膠懸浮液，讓其自然沉降，分布均勻無氣泡和裂縫，直至所需高度。裝好后洗脫液浸沒凝膠表面。上柱：在洗脫液的液面恰好與凝膠床的表面相平時(shí)加入混合液?；旌弦后w積通常為凝膠床體積的10%左右，濃度可高些，黏度應(yīng)低。洗脫：洗脫液應(yīng)與干燥凝膠溶脹時(shí)及裝柱平衡時(shí)使用的一致，體積一般為凝膠床體積的120%，洗脫流出液分步收集。凝膠層析操作過程（詳見蛋白質(zhì)工程p213）洗脫完畢后，凝膠柱已經(jīng)恢復(fù)酶液上樣前的狀態(tài)，不需再生處理就可以重復(fù)進(jìn)行下一批分離純化。如果使用次數(shù)較多，或要純化不同樣品時(shí)，用2－3倍柱體積非離子去污劑除去吸附在凝膠中的雜質(zhì)，或卸下凝膠，用0.2mol/LNaOH浸泡，再水洗。然后加入20%乙醇或0.04%NaN3在4－8℃長期保存親和層析親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物、酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、酶與輔助因子、抗原與抗體、酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段、RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對(duì)。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用親和層析技術(shù)的特點(diǎn)是選擇性很高，可減少提純步驟在親和層析中,作為固定相的一方稱為配基(Ligand)，配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(Matrix)上，母體又稱為載體或擔(dān)體。一般采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素作母體當(dāng)小分子物質(zhì)(金屬離子等無機(jī)輔助因子、有機(jī)輔助因子等)作為配基時(shí)，由于空間位阻作用，難以與配對(duì)的大分子親和吻合，需要在母體與配基之間引入適當(dāng)長度的連接臂（spacearm）

要使不溶性母體與配基偶聯(lián)或通過連接臂與配基偶聯(lián)，都必須進(jìn)行母體活化。即通過某種方法，如溴化氰法、疊氮法、高碘酸氧化法、環(huán)氧化法、甲苯磺酰氯法、雙功能試劑法等，使母體引入某種活潑基團(tuán)，才能以共價(jià)鍵與配基偶聯(lián)由于親和結(jié)合專一性強(qiáng)，洗脫條件要求高。在親和層析過程中，應(yīng)控制好溫度（0－10℃）、pH等條件，以免酶變性失活，親和層析劑免遭破壞。親和介質(zhì)昂貴，處理量不大，制備時(shí)只是在純化后期使用親和層析的四個(gè)要素常用的親和介質(zhì)及專一性配體根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：

共價(jià)親和層析 疏水層析(要區(qū)別疏水層析與反相層析) 金屬離子親和層析（實(shí)驗(yàn)方法見蛋白質(zhì)工程p218） 免疫親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析

金屬離子親和層析

金屬離子親和層析是利用蛋白類酶和其它蛋白表面的組氨酸的咪唑基團(tuán)、半胱氨酸的巰基基團(tuán)、色氨酸的吲哚基團(tuán)可與金屬離子發(fā)生可逆性親和結(jié)合的特性，用螯合在母體上的金屬離子對(duì)混合液中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化。要將酶或蛋白從親和層析柱上洗脫下來，可改變鹽濃度或pH（降低金屬離子和蛋白質(zhì)間的親和常數(shù)），或采用競(jìng)爭(zhēng)性的試劑將蛋白置換下來，可采用分級(jí)洗脫或梯度洗脫方式金屬離子親和層析的主要優(yōu)點(diǎn)是可用不同的金屬離子結(jié)合到螯合載體上，實(shí)現(xiàn)母體再生。

層析聚焦－將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的層析技術(shù)5、電泳分離帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過程稱為電泳。顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時(shí)受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件的影響。紙電泳自由電泳薄層電泳凝膠電泳薄膜電泳等電聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖電泳連續(xù)凝膠電泳梯度凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳SDS-凝膠電泳電泳制備式電泳通常以不含SDS的原態(tài)disc進(jìn)行，以便回收具有活性的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)樣本要先經(jīng)過部分純化，否則效果不佳，并先以分析式電泳確定所要色帶的位置。電極緩沖液應(yīng)根據(jù)欲分離組分而定。一種為陰離子電泳系統(tǒng)，緩沖液pH為8－9，上槽接負(fù)極，下槽接正極，用溴酚藍(lán)為指示劑，適用于一般蛋白質(zhì)和核酸的分離；一種為陽離子電泳系統(tǒng)，緩沖液pH為4左右，上槽接正極，下槽接負(fù)極，用亞甲基綠為指示劑，適用于堿性蛋白質(zhì)的電泳分離電泳的實(shí)驗(yàn)方法主要要求看SDS－PAGE和雙向電泳（詳見《蛋白質(zhì)工程》p220-223）凝膠層析詳見《蛋白質(zhì)工程》p213金屬離子親和層析見《蛋白質(zhì)工程》

p218高效液相色譜（HPLC）高效液相色譜，將常規(guī)層析介質(zhì)制備成特殊的高效液相色譜柱，它使用的基質(zhì)珠更小，孔徑更均一，基質(zhì)填充比常規(guī)層析柱更致密，因此可以耐受更大的壓力，采用更快的洗脫速度，具有更高的分辨率和重復(fù)性。高效液相色譜根據(jù)凝膠介質(zhì)的分離原理不同，又可分為高效凝膠過濾色譜、高效離子交換色譜、高效疏水色譜、高效親和色譜6、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個(gè)液相。有時(shí)也可采用其它流體。按照兩相的組成不同，萃取可以分為：

有機(jī)溶劑萃取 雙水相萃取 超臨界萃取 反膠束萃取

有機(jī)溶劑萃取在酶的萃取過程中，有機(jī)溶劑要預(yù)冷至0－10℃，萃取過程在0－10℃低溫條件下進(jìn)行，并盡量縮短酶與有機(jī)溶劑接觸時(shí)間雙水相萃取

雙水相系統(tǒng)一般是指將兩種親水性的聚合物都加在水溶液中，當(dāng)超過某一濃度時(shí)，產(chǎn)生兩相，兩種聚合物分別溶于互不相溶的兩相中（每種聚合物在上下相中的分配比率不同）成相是由于聚合物分子的空間阻礙作用，無法相互滲透，不能形成均一相，從而具有相分離的傾向。雙水相形成的條件和定量關(guān)系可用相圖表示，對(duì)于兩種聚合物和水相組成的系統(tǒng)，其相圖如圖4-8所示。各種雙水相系統(tǒng)聚合物P聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉圖4－7雙水相系統(tǒng)相圖在雙節(jié)線TCB下方區(qū)域是單相區(qū)，上方是雙相區(qū)。T點(diǎn)和B點(diǎn)分別表示達(dá)到平衡時(shí)的上相組成和下相組成，在同一直線上的各點(diǎn)分成的兩相，具有相同的組成，但體積比不同當(dāng)系線TMB下移，長度減小，兩相之間的差別逐漸減小，達(dá)到臨界點(diǎn)C點(diǎn)時(shí)，系線長度為零，達(dá)到均相。聚合物P%B′TBCT′聚合物Q或鹽%M雙節(jié)線的位置和形狀與聚合物的分子質(zhì)量有關(guān)，聚合物分子質(zhì)量越高，相分離所需的濃度越低。在高分子聚合物上引入親和配基，可以進(jìn)行雙水相親和萃取雙水相萃取不足：分離后酶液濃度低高分子聚合物在分離后需要分離除去超臨界萃取超臨界萃取又稱超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)在相同的壓力和溫度條件下，同一物質(zhì)的液相和氣相的物理特性是截然不同的。當(dāng)溫度和壓力達(dá)到某一特定的數(shù)值時(shí)，氣體和液體的物理特性就會(huì)趨于相同，這個(gè)數(shù)值稱為超臨界點(diǎn)。當(dāng)溫度和壓力超過其超臨界點(diǎn)時(shí)，兩相變?yōu)橐幌?，這種狀態(tài)下的流體稱為超臨界流體pTGLSSCF圖4-8超臨界系統(tǒng)相超臨界流體的顯著特點(diǎn)：①其物理特性和傳質(zhì)特性介于液體和氣體之間，適于作萃取溶劑；②其具有和液體同樣的溶解能力，具有很高的萃取速度；③隨溫度和壓力變化，其對(duì)物質(zhì)的萃取具有選擇性，萃取后易分離；④其黏度接近于氣體的黏度，利于物質(zhì)的擴(kuò)散；作為萃取劑的超臨界流體必須具備以下條件：具備良好的化學(xué)穩(wěn)定性，對(duì)設(shè)備沒腐蝕性；臨界溫度不能太高或太低，最好在室溫或操作溫度附近；操作溫度應(yīng)低于被萃取溶質(zhì)的分解溫度；臨界壓力不能太高，節(jié)約壓縮動(dòng)力；選擇性要好，容易制得高純度制品；溶解度要高，可減少溶劑的循環(huán)量；萃取劑要容易獲得，價(jià)格便宜CO2超臨界萃取的工藝工程由萃取和分離兩個(gè)步驟組成，按分離方法不同，分離工藝過程分為：等壓分離：壓力相同，溫度升高，溶質(zhì)在CO2中溶解度降低而分離析出分離等溫分離：溫度相同，壓力下降，溶質(zhì)在CO2中溶解度降低而分離析出吸附分離：溫度壓力不變，分離罐中的吸附劑吸附溶質(zhì)而分離溶質(zhì)在超臨界流體萃取中，為提高分離效果，在超臨界流體中添加少量的另一溶劑，稱為夾帶劑，如水、乙醇、丙酮。某些超臨界流體的超臨界點(diǎn)和超臨界密度流體名稱臨界溫度(℃)臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳CO231.17.380.46二氧化硫SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑氣N2O36.57.170.45