人肝前體細(xì)胞 征求意見稿

3T/XXXXXXX—XXXX人肝前體細(xì)胞本文件規(guī)定了人肝前體細(xì)胞制備的原材料和輔料、制備的一般要求、技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)簽、包裝、儲存及運(yùn)輸和廢棄物處理要求。本文件適用于人肝前體細(xì)胞的制備和檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件?！吨腥A人民共和國藥典》（2020年版）GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19815離心機(jī)安全要求GB/T26497電子天平Y(jié)Y/T0588流式細(xì)胞儀JJF1665流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1人肝前體細(xì)胞由肝細(xì)胞在特殊條件下轉(zhuǎn)化而得，可再次分化為肝細(xì)胞，在肝再生過程中起到重要作用的一類細(xì)胞。3.2主細(xì)胞庫由細(xì)胞種子經(jīng)培養(yǎng)至特定倍增水平或傳代水平，并經(jīng)一次制備獲得并分裝的同質(zhì)和均一的懸液。注：細(xì)胞種子是指已通過鑒定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢測的，來傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體，或經(jīng)過克隆培養(yǎng)以及基因工程構(gòu)建的3.3工作細(xì)胞庫由主細(xì)胞庫的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)至特定倍增水平或傳代水平，并經(jīng)一次制備獲得的同質(zhì)和均一的懸液。4縮略語下列縮略語適用于本文件。FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）ALB：白蛋白（Albumin）AFP：甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein）ASGR1：去唾液酸糖蛋白受體1（AsialoglycoproteinReceptor1）CD：分化簇（ClusterofDifferentiation）CFSE：羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CarboxyfluoresceinSuccinimidylEster)ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）FGF7：肝前體細(xì)胞生長因子7（FibroblastGrowthFactor7）HGF:肝細(xì)胞生長因子（HepatocyteGrowthFactor）HLA-DR,DP,DQ：人白細(xì)胞抗原DR,DP,DQ（HumanLeukocyteAntigen-DR,DP,DQ）HNF4α：肝細(xì)胞核因子4α（HepatocyteNuclearFactor4Alpha）4T/XXXXXXX—XXXXIL-2：白介素-2（Interleukin-2）MMP1:基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MatrixMetalloproteinase-1）MMP2:基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MatrixMetalloproteinase-2）PBMC：外周血單核細(xì)胞（PeripheralBloodMononuclearCells）PHA：植物血凝素（Phytohemagglutinin）LAC：白細(xì)胞活化混合液（LeukocyteActivationCocktail）Fix/PermKit：固定/通透化試劑盒（Fixation/PermeabilizationSolutionKit）RPMA：反相蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)（ReversePhaseProteinMicroarray）TNF-α：腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-alpha）5原材料和輔料5.1起始原材料的獲取應(yīng)符合倫理和法律法規(guī)，起始原材料供者應(yīng)簽署書面的合法有效的知情同意書，并建立起始原材料數(shù)據(jù)庫，保護(hù)供者隱私信息。5.2應(yīng)建立和執(zhí)行供者評估及篩選方法，供者應(yīng)至少篩查HBV、HCV、HIV、TP，檢測結(jié)果應(yīng)均為陰性,注：HBV為乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）的縮寫，HCV為丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）的縮寫，HIV為人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyViru5.3應(yīng)排除有遺傳性疾病的供者，并應(yīng)對供者進(jìn)行一般情況篩查。5.4應(yīng)建立和執(zhí)行組織或細(xì)胞的采集、運(yùn)輸、交接與儲存方法。5.5細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基及其他添加物等應(yīng)建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。5.6不宜使用動物血清或其他動物源成分，如必須使用，應(yīng)確認(rèn)無特定動物源性病毒感染。5.7細(xì)胞凍存時使用的輔料，應(yīng)建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。6制備的一般要求6.1人肝前體細(xì)胞培養(yǎng)所需的基礎(chǔ)設(shè)施和環(huán)境條件，應(yīng)符合GMP要求，滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制需要的潔凈條件并避免微生物污染和交叉污染。注：GMP為GoodManufacturingPractice，即為良好生產(chǎn)規(guī)范，是一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生產(chǎn)和控制的系統(tǒng)化準(zhǔn)則。其核心目標(biāo)是通過嚴(yán)格的流程控制確保產(chǎn)品6.2制備方應(yīng)對制備操作人員進(jìn)行培訓(xùn)，建立考核標(biāo)準(zhǔn)，人員培訓(xùn)考核合格后進(jìn)行制備操作。6.3制備方宜建立人肝前體細(xì)胞的主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫。6.4人肝前體細(xì)胞應(yīng)長期凍存于低于-130℃的環(huán)境下，并有相應(yīng)的凍存記錄，至少包含細(xì)胞名稱、培養(yǎng)代次、凍存密度、凍存體積、凍存時間等信息。6.5人肝前體細(xì)胞的制備應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，制備過程應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的要求。6.6人肝前體細(xì)胞培養(yǎng)或使用時，應(yīng)記錄細(xì)胞名稱、培養(yǎng)代次、細(xì)胞密度與細(xì)胞活率等信息。6.7人肝前體細(xì)胞培養(yǎng)或使用時，細(xì)胞代次不應(yīng)超過18代。7技術(shù)要求人肝前體細(xì)胞應(yīng)符合表1中的技術(shù)要求。表1人肝前體細(xì)胞計數(shù)要求AFP、CD34、CD45、ASGR1陽性比例均應(yīng)不大于2.5T/XXXXXXX—XXXXHLA-DR,DP,DQ陽性比例應(yīng)不大于2染色體核型應(yīng)為46，XY或者46，XX。8檢驗(yàn)方法8.1細(xì)胞形態(tài)體外培養(yǎng)，二維貼壁培養(yǎng)條件下，用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。8.2細(xì)胞標(biāo)志蛋白按照附錄B細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測進(jìn)行試驗(yàn)。8.3細(xì)胞存活率按照附錄A細(xì)胞存活率檢測進(jìn)行試驗(yàn)。8.4可溶性因子分泌水平（MMP1）按照附錄C細(xì)胞功能指標(biāo)檢測進(jìn)行試驗(yàn)。8.5可溶性因子分泌水平（MMP2）按照附錄C細(xì)胞功能指標(biāo)檢測進(jìn)行試驗(yàn)。8.6可溶性因子分泌水平（HGF）按照附錄C細(xì)胞功能指標(biāo)檢測進(jìn)行試驗(yàn)。8.7可溶性因子分泌水平（FGF7）按照附錄C細(xì)胞功能指標(biāo)檢測進(jìn)行試驗(yàn)。8.8免疫原性按照附錄B細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測進(jìn)行試驗(yàn)。8.9淋巴細(xì)胞增殖效力按照附錄D免疫調(diào)控檢測進(jìn)行試驗(yàn)。8.10PBMC分泌TNF-α能力按照附錄D免疫調(diào)控檢測進(jìn)行試驗(yàn)。8.11無菌檢查按照中華人民共和國藥典（2020年版）四部通則1101無菌檢查法進(jìn)行試驗(yàn)。8.12支原體檢查按照中華人民共和國藥典（2020年版）四部通則3301支原體檢查法進(jìn)行試驗(yàn)。8.13細(xì)胞內(nèi)毒素檢查按照中華人民共和國藥典（2020年版）四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn)。6T/XXXXXXX—XXXX8.14染色體核型按照中華人民共和國藥典（2020年版）三部生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制要求進(jìn)行試驗(yàn)。8.15成瘤性按照附錄E人肝前體細(xì)胞成瘤性檢測進(jìn)行試驗(yàn)。9檢驗(yàn)規(guī)則9.1抽樣方法9.1.1在一個制備周期中，同一供體來源、同一制備線、同一代次、同一天收獲、同一方法制備出來的產(chǎn)品為一批。9.1.2在同一批中，每個檢測類別隨機(jī)抽取1個此批次最小包裝單元進(jìn)行檢驗(yàn)。9.2檢驗(yàn)9.2.1每批產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，并附檢驗(yàn)報告。9.2.2出廠檢驗(yàn)應(yīng)涵蓋第7章的全部項(xiàng)目。9.3判定規(guī)則使用符合第5章要求的原材料和輔料、制備過程符合第6章要求，且出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目全部符合第7章的技術(shù)要求時，判為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合要求時，判為不合格品。10標(biāo)簽人肝前體細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)在包裝上的規(guī)定位置上標(biāo)注，標(biāo)注內(nèi)容至少應(yīng)包括名稱、細(xì)胞代次、細(xì)胞數(shù)量、制備批號、儲存條件、制備日期等內(nèi)容。11包裝、儲存及運(yùn)輸11.1包裝應(yīng)選擇對人肝前體細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性無影響的材料和容器。11.2儲存11.2.1應(yīng)選擇不影響細(xì)胞質(zhì)量性狀的細(xì)胞凍存液、細(xì)胞保護(hù)液及其他液體。11.2.2應(yīng)在低于-130℃的環(huán)境下長期儲存。11.3運(yùn)輸11.3.1應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的使用要求，選擇合適的承運(yùn)機(jī)構(gòu)。承運(yùn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具備相應(yīng)的功能單元，如質(zhì)量體系、人員、設(shè)備監(jiān)控及調(diào)度等。11.3.2凍存的細(xì)胞應(yīng)在低于-130℃條件下運(yùn)輸，非凍存細(xì)胞應(yīng)在2℃~8℃條件下運(yùn)輸。細(xì)胞運(yùn)輸時的介質(zhì)，如細(xì)胞凍存液、細(xì)胞保護(hù)液及其他液體，應(yīng)能保證細(xì)胞活性。12廢棄物處理12.1人肝前體細(xì)胞制備和檢測過程中產(chǎn)生的廢棄物，應(yīng)有完善的廢棄物暫存、運(yùn)輸記錄，應(yīng)選擇有資質(zhì)的承運(yùn)廢棄物機(jī)構(gòu)。12.2人肝前體細(xì)胞制備和檢測過程中不合格的細(xì)胞、剩余廢棄的細(xì)胞或組織，應(yīng)滅菌/滅活后，進(jìn)行合法并符合倫理的處理。7T/XXXXXXX—XXXX細(xì)胞存活率檢測細(xì)胞計數(shù)法A.1儀器和設(shè)備A.1.1熒光細(xì)胞分析儀熒光細(xì)胞分析儀應(yīng)按照J(rèn)JF1665要求進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。A.2試劑A.2.1除另有說明外，所有試劑均為分析純，檢測用水應(yīng)為符合GB/T6682要求的一級水。A.2.2磷酸鹽緩沖液：市售，pH值應(yīng)為7.2～7.4。A.2.3AO/PI染液：市售，吖啶橙和碘化丙錠染料。A.3檢測步驟A.3.1細(xì)胞懸液制備收集待檢測細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（A.2.2）配置細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液終濃度宜在1×106個細(xì)胞/mL到1×107個細(xì)胞/mL之間。A.3.2細(xì)胞染色按1：1的體積比將AO/PI染液（A.2.3）與細(xì)胞懸液（A.3.1）混合均勻。A.3.3細(xì)胞計數(shù)取混合好染料的樣品（A.3.2），上樣至計數(shù)板進(jìn)行檢測,每個樣品需2個復(fù)孔檢測。在儀器面板上輸入實(shí)驗(yàn)名稱，樣品編號，選擇細(xì)胞直徑參數(shù)（12～24μm），輸入稀釋比例，讀取總細(xì)胞密度、活細(xì)胞密度和活率。A.3.4計算與分析細(xì)胞存活率“%”、活細(xì)胞濃度“個細(xì)胞/mL”以及總細(xì)胞濃度“個細(xì)胞/mL為儀器直接讀取。A.3.5精密度在重復(fù)性條件下進(jìn)行兩次獨(dú)立測定，兩次測定結(jié)果的絕對誤差應(yīng)不超過其算術(shù)平均值的10%?！?T/XXXXXXX—XXXX細(xì)胞標(biāo)志蛋白及免疫原性檢測流式細(xì)胞法B.1儀器和設(shè)備B.1.1流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀應(yīng)遵循YY/T0588要求，具有紅色、藍(lán)色發(fā)射光，配備所使用的熒光通道相應(yīng)的帶通濾B.1.2水平離心機(jī)水平離心機(jī)應(yīng)遵循GB19815標(biāo)準(zhǔn)。B.1.3電子天平顯示分度值0.1mg，電子天平應(yīng)遵循GB/T26497標(biāo)準(zhǔn)。B.2試劑B.2.1除另有說明外，所有試劑均為分析純，檢測用水均為符合GB/T6682要求的一級水。B.2.2磷酸鹽緩沖液，市售，pH值應(yīng)為7.2～7.4。B.2.3抗人ALB、HNF4α、CD44、CD90、AFP、CD34、CD45、ASGR1、HLA-DR,DP,DQ抗體及同型對照抗體。B.2.4固定液：含有4%多聚甲醛的組織固定液，于2℃~8℃保存。B.2.5穿膜液：用磷酸鹽緩沖液配制，體積比為0.5%曲拉通X-100緩沖液，或者購買穿膜液，于2℃~8℃保存。B.2.6封閉液：用磷酸鹽緩沖液配制含0.3mol/L甘氨酸的，體積比為10%羊血清緩沖液，或者購買封閉液，于2℃~8℃保存。B.2.7洗滌液：磷酸鹽緩沖液，于2℃~8℃保存。B.3樣品保存標(biāo)記后的樣品于2℃~8℃避光保存。B.4檢測步驟B.4.1樣品準(zhǔn)備收集細(xì)胞，用水平離心機(jī)（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液洗滌一遍樣品，再用水平離心機(jī)（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。B.4.2抗體孵育B.4.2.1細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體孵育選擇細(xì)胞標(biāo)志蛋白對應(yīng)的抗體及同型對照抗體，按照供應(yīng)商提供的抗體說明書稀釋抗體，抗體與細(xì)胞懸液混勻后，于2℃~8℃孵育30～60min。孵育結(jié)束后，用洗滌液（B.2.7）清洗樣品兩遍，用水平離心機(jī)（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。B.4.2.2細(xì)胞胞內(nèi)標(biāo)志物抗體孵育樣品中加入1mL固定液（B.2.4）重懸沉淀細(xì)胞，室溫固定30min后，用水平離心機(jī)（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。9T/XXXXXXX—XXXX樣品中加入1mL穿膜液（B.2.5），重懸沉淀細(xì)胞，室溫孵育30min后，用水平離心機(jī)（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。樣品中加入1mL封閉液（B.2.6）重懸沉淀細(xì)胞，室溫孵育30min后，用水平離心機(jī)（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。選擇細(xì)胞標(biāo)志蛋白對應(yīng)的抗體及同型對照（若有按照說明書稀釋抗體，抗體與細(xì)胞懸液混勻后，37℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后用洗滌液（B.2.7）清洗1～2遍，用水平離心機(jī)（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清B.4.3過濾上機(jī)用洗滌液重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀（B.1.1）上機(jī)檢測。B.4.4圈門設(shè)定B.4.4.1根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群（即cells排除細(xì)胞碎片和多細(xì)胞聚團(tuán)，如B.4.4.2同型對照抗體組作為陰性對照，根據(jù)其熒光強(qiáng)度，在分群cells的基礎(chǔ)上畫出細(xì)胞群singlecells，排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞和粘連細(xì)胞，如圖B.1中B。B.4.4.3在分群singlecells的基礎(chǔ)上顯示具體細(xì)胞標(biāo)志蛋白的陽性比例，如圖B.1中C。圖B.1圈門示意圖T/XXXXXXX—XXXX細(xì)胞功能指標(biāo)檢測ELISA法C.1儀器和設(shè)備多功能酶標(biāo)儀，應(yīng)可以進(jìn)行試劑盒推薦的波長檢測。C.2試劑MMP1檢測試劑盒、MMP2檢測試劑盒、HGF檢測試劑盒、FGF7檢測試劑盒。C.3樣品保存C.3.1實(shí)驗(yàn)組為培養(yǎng)人肝前體細(xì)胞3天的培養(yǎng)上清液，保存于-60℃~-80℃。C.3.2對照組為人肝前體細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，保存于2℃~8℃。C.4檢測步驟C.4.1樣品準(zhǔn)備收集不少于2mL的培養(yǎng)人肝前體細(xì)胞3天的培養(yǎng)上清液，放入離心管中，用水平離心機(jī)（B.1.2）300×g，離心10min，取上清液，保存于-60℃~-80℃。C.4.2樣品檢測C.4.2.1按試劑盒操作說明將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至推薦的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用濃度，樣品稀釋至推薦比例。C.4.2.2將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入試劑盒提供的檢測板內(nèi)并孵育一抗。C.4.2.3一抗孵育完成后清洗檢測板，去除殘留洗滌液。C.4.2.4孵育帶標(biāo)簽的二抗。C.4.2.5孵育完成后清洗檢測板，去除殘留洗滌液。C.4.2.6檢測板內(nèi)加入顯色劑，充分反應(yīng)。C.4.2.7根據(jù)試劑盒操作說明中推薦檢測波長，使用多功能酶標(biāo)儀（C.1）進(jìn)行檢測。C.4.3計算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的樣品濃度與酶標(biāo)儀讀數(shù)換算公式，將樣品的酶標(biāo)儀讀數(shù)帶入公式計算，得到對應(yīng)的樣品濃度。T/XXXXXXX—XXXX免疫調(diào)控檢測流式細(xì)胞法D.1儀器和設(shè)備D.1.1熒光細(xì)胞分析儀熒光細(xì)胞分析儀應(yīng)按照J(rèn)JF1665要求進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。D.1.2流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀應(yīng)遵循YY/T0588要求。D.1.3水平離心機(jī)水平離心機(jī)應(yīng)遵循GB19815標(biāo)準(zhǔn)。D.2試劑D.2.1除另有說明外，所有試劑均為分析純，檢測用水均為符合GB/T6682要求的一級水。D.2.2磷酸鹽緩沖液：市售，pH值應(yīng)為7.2～7.4。D.2.3消化酶：市售，應(yīng)為重組蛋白酶。D.2.4AO/PI染色液：市售，吖啶橙和碘化丙錠染料。D.2.5FBS：市售，應(yīng)含多種細(xì)胞生長所需的因子，對細(xì)胞的增殖和代謝具有支持作用。D.2.6RPMI1640完全培養(yǎng)基：移取1mLFBS加入8.99mLRPMI1640培養(yǎng)基中，充分混勻。D.2.7IL-2：市售，活性應(yīng)滿足不低于1×107U/mg。D.2.8PHA：市售。D.2.9CFSE：市售。D.2.10TNF-α：市售，應(yīng)為抗人單克隆抗體。D.2.11LAC：市售。D.2.12Fix/PermKit：市售。D.3淋巴細(xì)胞增殖效率檢測步驟D.3.1將人肝前體細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁培養(yǎng)16h～24h。D.3.2第二天將PBMC復(fù)蘇，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。按照CFSE試劑盒說明書推薦進(jìn)行染色，染色結(jié)束后使用添加了IL-2、PHA的活化的RPMI1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸。D.3.3取出培養(yǎng)16h～24h的人肝前體細(xì)胞，棄掉孔里培養(yǎng)基，加入染色、活化后的PBMC細(xì)胞共培養(yǎng)3~4天。D.3.4同時接種染色、活化后的PBMC細(xì)胞用作陽性對照；染色、未活化的PBMC細(xì)胞作為陰性對照；接種活化但未染色的PBMC細(xì)胞作為空白對照培養(yǎng)3～4天。D.3.5流式上機(jī)：將培養(yǎng)的細(xì)胞混勻取出于流式管中，用水平離心機(jī)（D.1.3）500×g，離心5min，棄去上清液；用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）洗滌一遍樣品，再用水平離心機(jī)（D.1.3）機(jī)500×g，離心5min，棄去上清液，用用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）重懸上機(jī)。D.3.6數(shù)據(jù)分析：根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞排除細(xì)胞碎片和多細(xì)胞聚團(tuán)；根據(jù)根據(jù)陰性對照和空白對照圈出目的細(xì)胞的增殖信號。D.4PBMC分泌TNF-α能力檢測步驟D.4.1將人肝前體細(xì)胞接種于24孔板貼壁培養(yǎng)一天。T/XXXXXXX—XXXXD.4.2第二天將PBMC復(fù)蘇進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按照CFSE試劑盒說明書推薦進(jìn)行染色。D.4.3取出培養(yǎng)一天的人肝前體細(xì)胞，棄掉孔里培養(yǎng)基，加入染色后的PBMC細(xì)胞共培養(yǎng)1天。D.4.4同時加入染色后的PBMC兩孔分別用作陽性對照和同型對照。D.4.5第三天加入LAC刺激3h～6h，結(jié)束后使用Fix/PermKit將PBMC進(jìn)行固定、破膜，再加入抗人TNF-α抗體及其同型對照于2℃~8℃孵育30min。D.4.6流式上機(jī)：將孵育結(jié)束后的細(xì)胞混勻取出于流式管中，用水平離心機(jī)（D.1.3）機(jī)500×g，離心5min，棄去上清液；用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）洗滌一遍樣品，再用水平離心機(jī)（D.1.3）機(jī)500×g，離心5min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）重懸上機(jī)。D.4.7數(shù)據(jù)分析：根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除細(xì)胞碎片和多細(xì)胞聚團(tuán)。D.4.8根據(jù)同型對照圈出目的細(xì)胞陽性區(qū)域。D.5計算結(jié)果按公式（D.1和D.2）進(jìn)行計算，正值為促進(jìn)率，負(fù)值為抑制率。D.5.1PBMC增殖抑制檢測計算公式式中：X——促進(jìn)率/抑制率，%；Y1——供試品CFSE陽性結(jié)果，%；Y0——陽性對照CFSE陽性結(jié)果，%。D.5.2PBM