核酸擴增技術分子生物學檢驗技術生物化學檢驗教研室38課件

分子生物學檢驗技術核酸擴增技術生物化學檢驗教研室學習目標掌握：PCR技術的基本原理及反應體系；及PCR產(chǎn)物電泳檢測方法。熟悉：PCR常見問題及體系優(yōu)化；實時熒光定量RCR的原理。了解：PCR衍生技術；產(chǎn)物的其他檢測方法；PCR方法標準化。目錄聚合酶鏈反應01PCR衍生技術02CONTENTS分子生物學檢驗技術CONTENTSPCR檢測技術的臨床應用03聚合酶鏈反應/PCRPART01聚合酶鏈反應/PCR聚合酶鏈反應于二十世紀80年代由K.Mullis建立榮，獲1993年度諾貝爾化學獎，為生命科學領域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。一、PCR技術基本原理聚合酶鏈反應PolymeraseChainReaction,PCRDNA體外擴增處處都在的PCR遺骨性別鑒定親自鑒定產(chǎn)前診斷處處都在的PCR處處都在的PCR5’5’3’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’加入試管中5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火添加反應混合液及樣本變性處處都在的PCR5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)延伸繼續(xù)延伸處處都在的PCR5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第二個循環(huán)4個拷貝第三個循環(huán)8個拷貝第n個循環(huán)2n個拷貝PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關系循環(huán)次數(shù)DNA的鏈數(shù)121

22224323

810210

1024202201,048,576302301,073,741,824二、PCR的反應體系1.模板2.一對引物3.TaqDNA聚合酶4.脫氧核苷三磷酸5.緩沖溶液（鎂離子）二、PCR的反應體系PCR體系的基本成分體積模板DNA（50-100ng/ul）1.0ul上游引物（20uM）0.4ul下游引物（20uM）0.4ulTaqDNA聚合酶（5U/ul）0.2uldNTPs（1mM）2.0ul含有Mg2+的緩沖液（10Χ）2.0ulddH2O14.0ul二、PCR的反應體系（一）模板/template基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等。RNA作為模板時，須先將RNA逆轉錄為cDNA。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng……反應體系中較低量的模板有利于提高擴增產(chǎn)量和減少非特異性擴增。（二）引物/primer與模板DNA特異地結合化學合成的寡核苷酸鏈決定PCR產(chǎn)物的特異性和長度設計引物的原則01兩條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負鏈序列互補。02長度為15～30個核苷酸。03二條引物之間避免形成引物二聚體。04引物：濃度過高容易生成引物二聚體。05C+G堿基含量在引物中的比例一般以45%～55%為宜。06引物退火溫度計算：Tm=2（A+T）+4（C+G）。07引物3′端兩個堿基應嚴格配對，引物的5′端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標記）。設計引物的原則如何獲得引物？引物設計軟件Primer6（自動搜索）OLIGO7（引物評價）Primer3（在線服務）根據(jù)需擴增DNA片段的末端序列來確定。（二）引物/primer（三）TaqDNA聚合酶從一種生活在熱泉（80℃～90℃）中的水生棲熱菌/Taq）中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性。作用在模板指導下，以dNTP為原料，在引物3′-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成3′,5′-磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5′→3′方向延伸，催化DNA合成。作用TaqDNA聚合酶無3′→5′外切酶活性，因而無校正功能，在復制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯配。Pfu

DNA聚合酶是一種超耐熱酶，來自于水熱環(huán)境中的超嗜熱古細菌。在95°C下，Pfu聚合酶的穩(wěn)定性能比Taq聚合酶高20倍。有3′→5′外切酶活性高保真DNA聚合酶。（四）脫氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。01反應體系中各種核苷酸的濃度必須一致。02濃度過高雖能加快反應速度，但非特異性擴增也隨之增加。03最適濃度：20～200μmol/L。04（五）鎂離子對反應系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影響。01PCR反應體系中dNTP、引物、模板DNA及鰲合劑均可與Mg2+結合，降低游離Mg2+的濃度，影響酶的活性。02dNTP濃度為200μmol/L時，MgCl2濃度為1.5mmol/L較宜。03三、PCR技術的程序95℃，5min預變性95℃，30S變性45～65℃，30S退火72℃，30S～120S延伸72℃，10min充分延伸15～35個循環(huán)三、PCR技術的程序三、PCR技術的程序（一）溫度與時間變性退火95℃，30S。低于引物Tm5℃左右，溫度根據(jù)引物設定。溫度過高：降低擴增效率；溫度過低：增加非特異性擴增。延伸溫度72℃，根據(jù)擴增片段長度設定，1kb以內(nèi)延伸1min。（二）循環(huán)次數(shù)根據(jù)所需要的產(chǎn)物的量設定。每一個循環(huán)使一個分子的模板被復制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。一個分子的模板經(jīng)過30個循環(huán)，理論上即可得230（約109）個拷貝產(chǎn)物。實際反應中，每個循環(huán)的擴增效率大多約為85%左右。如何操作PCR程序？（二）循環(huán)次數(shù)（二）循環(huán)次數(shù)PCR技術的原理模板引物以待擴增的DNA分子為模板。以一對與模板3’末端互補的寡核苷酸片段為引物。酶在耐高溫的DNA聚合酶的作用下。底物以四種dNTP為底物。機制按照體內(nèi)DNA半保留復制的機制。程序通過變性、退火、延伸三個步驟，完成新的DNA合成，并反復重復一個過程，獲得目的DNA的大量拷貝。結果如何分析？瓊脂糖凝膠電泳分析酶切分析根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段。分子雜交檢測PCR產(chǎn)物特異性、產(chǎn)物的突變。Southern印記在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈，標記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。鑒定特異性。序列分析檢測PCR產(chǎn)物特異性最可靠的方法。結果如何分析？常見問題分析假陰性：操作不當，試劑質(zhì)量差（包括引物和探針設計不當）或過期、儀器設備不準確。假陽性：幾乎均由污染所致。非特異性擴增條帶現(xiàn)象：條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶。常見問題分析常見問題分析常見問題分析缺點只能對終產(chǎn)物進行分析，無法對起始模板準確定量。01必須在擴增