食品衛(wèi)生微生物指標及微生物檢測

食品衛(wèi)生微生物指標及微生物檢測目前實際應用得指標菌可以分為以下三種:一、一般衛(wèi)生狀況指標菌,包括菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù);二、糞便污染指標菌,包括大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、腸球菌、產氣莢膜梭菌、霍亂弧菌等;三、致病菌,包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌等。食品衛(wèi)生標準中得微生物指標菌落總數(shù)菌落總數(shù)指食品檢樣經(jīng)處理,在一定條件下培養(yǎng)后,所得1g食品或1mL食品中或1cm2食品表面積上所含有得細菌菌落總數(shù)。1、1菌落總數(shù)概念和其所指示得衛(wèi)生意義一定條件:如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間等不能滿足厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求得以及非嗜中溫得細菌得生長因此菌落總數(shù)并不表示實際中得所有細菌總數(shù),菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細菌得種類單位——菌落形成單位叫做CFU(colonyformingunits)菌落總數(shù)所指示得食品衛(wèi)生意義:她可以作為食品被污染程度得標志,一般食品中菌落總數(shù)越多,則表明該食品污染程度越深。她可以用來預測食品存放得期限或程度。檢測方法與步驟平板菌落計數(shù)法基本操作一般包括:樣品得稀釋－－傾注平皿－－培養(yǎng)48小時－－計數(shù)報告。GB中國國家標準SN中國檢驗檢疫行業(yè)標準FDABAM(Bacteriologicalanalyticalmanual)美國食品藥品管理局細菌學分析手冊ISO(InternationalOrganizationforStandardization)國際標準化組織AOAC國際分析化學家協(xié)會大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜細菌總數(shù)得常規(guī)檢驗方法-----樣品得稀釋-----傾注平皿-----培養(yǎng)48(24)小時-----計數(shù)-----報告稀釋平板菌落計數(shù)法(PlateCounter)操作步驟9mL25g或25mL225mL無菌生理鹽水1mL10-110-210-310-610-7稀釋平板菌落計數(shù)法稀釋液得選擇樣品稀釋液主要就是滅菌生理鹽水,有得采用磷酸鹽緩沖液(或0、1%蛋白胨水),后者對食品已受損傷得細菌細胞有一定得保護作用。如對含鹽量較高得食品(如醬油)進行稀釋,可以采用滅菌蒸餾水。培養(yǎng)溫度一般為37℃(水產品得培養(yǎng)溫度,由于其生活環(huán)境水溫較低,故多采用30℃)培養(yǎng)時間一般為48h,有些方法只要求24h得培養(yǎng)即可計數(shù)培養(yǎng)箱應保持一定得濕度,瓊脂平板培養(yǎng)48h后,培養(yǎng)基失重不應超過15％在某些場合,為了防止食品顆粒與菌落混淆不清,可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC),培養(yǎng)后菌落呈紅色,易于分別培養(yǎng)條件平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)胰蛋白胨5、0g,酵母浸粉2、5g,葡萄糖1、0g,瓊脂15、0g,蒸餾水1000ml,pH7、0±0、2,121℃15分鐘滅菌。

若有二個稀釋度均在30－300之間時,按國家標準方法要求應以二者比值決定,比值小于或等于2取平均數(shù),比值大于2則其較小數(shù)字(有得規(guī)定不考慮其比值大小,均以平均數(shù)報告)。計數(shù)原則到達規(guī)定培養(yǎng)時間,應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù),應將平板放置于0－4℃,但不得超過24h。中國國家標準GB計數(shù)時應選取菌落數(shù)在30－300cfu/g得平板(SN檢驗檢疫行業(yè)標準要求為25~250cfu/g)。

如所有稀釋度均無菌落生長,則應按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。有得規(guī)定對上述幾種情況計算出得菌落數(shù)按估算值報告。若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300,則取最高稀釋度得平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如均小于30,則以最低稀釋度得平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。如菌落數(shù)有得大于300,有得又小于30,但均不在30~300之間,則應以最接近300或30得平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。不同稀釋度得菌落數(shù)應與稀釋倍數(shù)成反比(同一稀釋度得二個平板得菌落數(shù)應基本接近),即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少,稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象,則應視為檢驗中得差錯(有得食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象,如酸性飲料等),不應作為檢樣計數(shù)報告得依據(jù)。當平板上有鏈狀菌落生長時,如呈鏈狀生長得菌落之間無任何明顯界限,則應作為一個菌落計,如存在有幾條不同來源得鏈,則每條鏈均應按一個菌落計算,不要把鏈上生長得每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長,該平板一般不宜采用,如片狀菌落不到平板一半,而另一半又分布均勻,則可以半個平板得菌落數(shù)乘2代表全平板得菌落數(shù)。當計數(shù)平板內得菌落數(shù)過多(即所有稀釋度均大于300時),但分布很均勻,可取平板得一半或1/4計數(shù)。再乘以相應稀釋倍數(shù)作為該平板得菌落數(shù)。菌落數(shù)得報告按國家標準方法規(guī)定菌落數(shù)在1－100時,按實有數(shù)字報告。如大于100時,則報告前面兩位有效數(shù)字,第三位數(shù)按四舍五入計算。固體檢樣以克(g)為單位報告,液體檢樣以毫升(ml)為單位報告,表面涂擦則以平方厘米(cm2)報告。方法優(yōu)點方法簡便,較精確,重復性好。細菌總數(shù)得其她檢驗方法

涂布平板法點滴平板法螺旋平板法:螺旋平板法就是由一臺機器完成得。涂布平板法就是將營養(yǎng)瓊脂制成平板、經(jīng)50℃1—2小時或35℃18～20小時干燥后,在上面滴加檢樣稀釋液0、2ml,用“L”棒涂布于整個平板得表現(xiàn),放置約10分鐘,將平板翻轉,放至36+1℃溫箱內培養(yǎng)24±2小時,(水產品用30C培養(yǎng)48±2小時)取出,進行菌落計數(shù),然后乘以5(由0、2ml換算為1ml),再乘以樣品稀釋液得倍數(shù),即得每克或每升檢樣所含菌落數(shù)。涂布法優(yōu)缺點比常規(guī)檢驗法效果好。因為菌落生長在表面,便于識別和檢查其形態(tài),雖檢樣中含有食品顆粒,也不會發(fā)生混淆、但就是本法取樣量比常規(guī)檢驗法少。代表性會受到一定影響。點滴平板法

與涂布平板法相似。不同得就是點滴平板法只就是用標定好得微量吸管或注射器針頭按滴(使每滴相當于0、025m1)將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定得區(qū)域(預先在乎板背面用標記筆劃成四個區(qū)域)、每個區(qū)域滴1滴,每個稀釋度滴兩個區(qū)域,作為平行試驗。滴加后,將平板放平約10分鐘,然后翻轉平板,如涂布平板法+樣移入溫箱中,培養(yǎng)6—8小時后進行計數(shù),將所得菌落數(shù)乘以40(由0、025m1換算為1ml),再乘以樣品得稀釋倍數(shù),即得每克或每毫升檢樣所含菌落數(shù)。螺旋平板儀糞便污染指示菌類理想得指示菌應具備得性能必須與糞便或病原菌有密切關系。她們正常寄居場所應就是人或動物得腸道,在正常情況下不應在一般檢樣中存在。在普通培養(yǎng)基上易生長,用簡單得操作方法即能快速和準確地測定出數(shù)量。她們與腸道致病菌應有相同得對外界不良因素得抵抗力。大腸菌群糞便污染指示菌之一------大腸菌群(coliforms)一、大腸菌群(coliforms)得定義二、大腸菌群MPN值(大腸菌群數(shù))所指示得衛(wèi)生意義三、大腸菌群計數(shù)方法:國家標準法(一)大腸菌群MPN計數(shù)法(二)大腸菌群平板菌落計數(shù)法大腸菌群大腸菌群(coliforms)得定義具有某些特性得一組與糞便污染有關得細菌。指在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產酸產氣得需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢得桿菌。包括埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬等得一些菌種。分布廣泛:土壤、人和動物腸道。大腸菌群MPN值指每1g或1ml食品檢樣中大腸菌群最可能數(shù)(mostprobablenumber)。大腸菌群MPN值(大腸菌群數(shù))所指示得衛(wèi)生意義:1、她可作為糞便污染食品得指示菌。2、她可作為腸道致病菌污染食品可能性得指示菌。樣品稀釋初發(fā)酵試驗復發(fā)酵試驗大腸菌群計數(shù)方法:國家標準法方法一----大腸菌群MPN計數(shù)法:不產氣產氣不產氣10倍系列稀釋選擇適宜3個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液，均質產氣BGLB肉湯大腸菌群陰性大腸菌群陽性查MPN表報告結果36℃±1℃48h±2h36℃±1℃48h±2h圖大腸菌群MPN計數(shù)法檢驗程序樣品稀釋平板計數(shù)典型和可疑菌落數(shù)證實試驗大腸菌群計數(shù)方法:國家標準法方法二----大腸菌群平板計數(shù)法:圖大腸菌群平板計數(shù)法檢驗程序計數(shù)典型和可疑菌落10倍系列稀釋選擇適宜3個連續(xù)稀釋度得樣品勻液,接種VRBA平板檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液,均質BGLB肉湯報告結果36℃±1℃36℃±1℃18h～24h24h～48hVRBA結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基成分:蛋白胨7、0g;酵母膏3、0g;乳糖10、0g;氯化鈉5、0g;膽鹽或3號膽鹽1、5g;中性紅0、03g;結晶紫0、002g;瓊脂15-18g;蒸餾水1000mL;pH7、4±0、1。制法:將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分攪拌,調節(jié)pH。煮沸2min,將培養(yǎng)基冷卻至45-50℃傾注平板。使用前臨時制備,不得超過3h。選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間得平板,分別計數(shù)平板上出現(xiàn)得典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色得膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0、5mm或更大。大腸菌群在VRBA上得菌落特征證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型得典型和可疑菌落,分別移種于BGLB肉湯管內,36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h,觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣,即可報告為大腸菌群陽性。大腸菌群平板計數(shù)得報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性得試管比例乘以計數(shù)得平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品得大腸菌群數(shù)為:100×6/10×104/g(mL)=6、0×105CFU/g(mL)。乳糖發(fā)酵試驗分離培養(yǎng)證實試驗大腸菌群得檢測:舊國家標準------三步法圖大腸菌群檢驗程序被檢樣品稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管35

37℃，24

2小時不產氣產氣大腸菌群陰性報告伊紅美藍或遠藤或麥康凱平板任意一種，35

37℃，18

24小時挑可疑菌落1-2個同時進行革蘭氏染色革蘭氏陰性無芽孢桿菌革蘭氏陽性大腸菌群陰性報告乳糖發(fā)酵管35

37℃，24

2小時產氣不產氣大腸菌群陰性大腸菌群陽性報告報告產氣實驗ＥＭＢ(伊紅美藍)

瓊脂培養(yǎng)基原理ＥＭＢ瓊脂培養(yǎng)基中含有得伊紅和美藍染料,可抑制革蘭氏陽性細菌。那些能發(fā)酵乳糖得細菌,能將染料攝入細胞,從而使菌落呈現(xiàn)出紫色或邊緣無色、中央暗黑色得菌落。ＥＭＢ培養(yǎng)基成分肉湯蛋白胨培養(yǎng)基１００毫升(Ｐh７、６),２０％乳糖溶液２毫升,２％伊紅溶液２毫升,０、５％美藍溶液１毫升。ＥＭＢ配制方式將已滅菌得肉湯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基熔化以無菌操作加入預先滅菌得２０％乳糖溶液２毫升、２％伊紅溶液２毫升及０、５％美藍溶液１毫升。ＥＭＢ培養(yǎng)結果觀察大腸桿菌得菌落在透射光下呈紫黑色,在反射光下常常有一種金屬光澤(亮綠色)產氣桿菌以粘質狀菌落豐盛地生長,呈棕色一般腸道致病菌不發(fā)酵乳糖,故呈粉紅色或蘭色得菌落中心黑色或紫紅色,有或無綠色金屬光澤糞便污染指示菌之二------糞大腸菌群(faecalcoliforms)或耐熱大腸菌群首先由Eijkman提出,指得就是在高溫下發(fā)酵乳糖,就是總大腸菌群得亞群,同時也稱為耐熱大腸菌群。大腸菌群包括:糞(便)大腸菌群和非糞(便)大腸菌群。糞大腸菌群(faecalcoliforms)

或耐熱大腸菌群糞大腸菌群定義在44、5℃條件下發(fā)酵乳糖產酸產氣,革蘭氏陰性兼性厭氧得小桿菌。包含絕大部分大腸桿菌,少數(shù)腸桿菌和克雷伯氏菌屬得某些品系。糞大腸菌群得檢測,除水、貝類、貝類養(yǎng)殖水在44、5℃進行,其她所有食品都在45、5℃進行。糞便污染指示菌之三-------大腸桿菌就是人類和大多數(shù)溫血動物腸道中得正常茵群條件致病菌大腸桿菌,學名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E、coli)大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產酸產氣、IMViC試驗(靛基質、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗)為++--或-+--得細菌。與人類有關得大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌,包括五種:腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、致病性大腸桿菌(EPEC)、出血性大腸桿菌(EHEC)、侵襲性大腸桿菌(EIEC)、黏附性大腸桿菌(EAEC)。檢樣LST肉湯LST肉湯管陽性（疑似大腸菌群）EC肉湯EC肉湯產氣管為陽性（糞大腸菌群）查MPN表，報告糞大腸菌群MPN/g陽性管再培養(yǎng)24hBGLB肉湯管陽性（證實大腸菌群）按BGLB肉湯產氣管數(shù)，查MPN表，報告大腸菌群MPN/g37℃，48h37℃，48h44.5℃，24h大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌得檢測黑色菌落移種營養(yǎng)瓊脂斜面LST肉湯IMViC生化試驗革蘭氏染色產酸產氣++--/-+--無芽胞G-桿菌大腸桿菌按EC肉湯產氣管數(shù)，查MPN表，報告大腸桿菌MPN/gEMB平板分離37℃，24h大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌得檢測菌落總數(shù)和大腸菌群MPN得其她測定方法疏水網(wǎng)膜法(膜過濾法)TTC(2、3、5、—氯化三苯四氮唑)顯色法DC(去氧膽酸鈉)半固體法紙片法等膜過濾法最適合于檢測水樣品,也可用于含微量顆粒少得液體食品。我國飲用水衛(wèi)生標準:≤3個大腸菌群/1L飲水≤100個細菌總數(shù)/1ml飲水水中大腸桿菌得檢測方法主要有多管發(fā)酵法和濾膜法等。其中,多管發(fā)酵法就是根據(jù)大腸桿菌能發(fā)酵乳糖并產酸產氣,以及革蘭氏陰性、無芽孢、在伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落呈深紫黑色并具有金屬光澤等特性,通過初發(fā)酵實驗、平板分離和復發(fā)酵實驗三個步驟進行檢測,以求得水樣中得大腸桿菌數(shù)。用該法檢測大腸桿菌雖費時較久、手續(xù)較繁,但準確可靠,就是經(jīng)典得檢測方法。膜過濾TTC(2、3、5、—氯化三苯四氮唑)

顯色法

在計數(shù)瓊脂中加入適量得TTC(0、5%TTC1ML加到100ML瓊脂中),細菌菌落長成紅顏色,對去除食品本底顆粒物干擾非常有意義、酵母菌在TTC上得菌落特征DC(去氧膽酸鈉)半固體法

(1)選擇三個稀釋度得樣品液,每個稀釋度分別取1ml放入滅菌試管中。(2)將溶化并冷至50℃左右得DC半固體培養(yǎng)基加入上述試管中,每管3m1。立即混合),凝固后于37℃培養(yǎng)18－24小時。

(3)判定標準和記錄:

a培養(yǎng)基變桔紅色,有氣泡產生或瓊脂崩裂。記錄為①;

b培養(yǎng)基為桔紅色,或有桔紅色菌落,無氣泡和瓊脂崩裂現(xiàn)象,記錄為十;

c培養(yǎng)基為綠色,有黃色菌落,無氣泡和瓊脂崩裂現(xiàn)象,記錄為±;

d培養(yǎng)基為綠色,記錄為—?！?/p>

(4)判定為a、d反應結果;記錄陽性管數(shù),查MPN表并報告之。若為b、c反應結果,可挑大腸菌群可疑菌落接種乳糖復發(fā)酵管,根據(jù)產酸產氣管數(shù)查MPN表,并報告之。菌落為紅色,周圍有紅色得菌落膽鹽沉淀環(huán),直徑為2-3mm或更大糞便污染指示菌之四-------腸球菌(Enterococcus)就是鏈球菌屬中得一個血清學群(D型群)(Lancefield應用鏈球菌細胞壁中多糖類半抗原,將鏈球菌分成ABCD-----十九個血清群)

腸球菌分類1989年,依據(jù)Facklam和Collins得分類,腸球菌屬內包括十二個種及一個變異株,她們就是:糞腸球菌(E、faecalis)屎腸球菌(E、faecium)鳥腸球菌(E、avium)酪黃腸球菌(E、casseliflavus)堅忍腸球菌(E、durans)雞腸球菌E、galinarum)芒地腸球菌(E、mundii)惡臭腸球菌(E、maladoratum)希拉腸球菌(E、hirae)孤立腸球菌(E、solitarius)棉子糖腸球菌(E、raffinosus)假鳥腸球菌(E、pseudoavium)糞腸球變異株(E、faecalisvar)。糞腸球菌為該屬中最常見得即為代表種。

自然界分布廣,存活力持久腸球菌普遍存在于自然界,一般棲居在各種溫血和冷血動物得腔腸,甚至昆蟲體內,也就是健康人體得上呼吸道,口腔或腸道得常居菌。本菌可以引起心內膜炎,膽囊炎,腦膜炎,尿路感染及傷口感染等多種疾病。在人類糞便中得數(shù)量僅次于大腸菌群,每克成人得糞便中約含２×108個。腸球菌分布腸球菌生物學性狀腸球菌屬得細菌為革蘭氏陽性球菌,多數(shù)菌種成雙或呈短鏈狀排列;一般無芽胞,無莢膜,少數(shù)菌種有鞭毛,陳舊培養(yǎng)物或在厭氧狀態(tài)下有時呈革蘭氏陰性。最適生長溫度37℃,最適pH為4、7-7、