KTA2010-CN-一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）

一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）Cat#:KTA2010 Size：50T/100T 一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光） 貨號(hào)：KTA2010 批號(hào)：見(jiàn)產(chǎn)品標(biāo)簽 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)：適用細(xì)胞及組織樣本的流式細(xì)胞術(shù)、熒光檢測(cè)等實(shí)驗(yàn) 保質(zhì)期：-20℃，避光保存6個(gè)月原理細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧尿苷三磷酸核苷酸（dUTP）和熒光素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL成為了檢測(cè)DNA片段化（細(xì)胞凋亡）的最常用方法。一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）提供實(shí)驗(yàn)所需的全套試劑組分以及優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案，適用于熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。適用于如下樣品類型：貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞，石蠟包埋組織切片，冰凍切片。熒光信號(hào)檢測(cè)通道為FITC通道（Ex/Em=490nm/520nm）。包裝清單試劑盒組分 規(guī)格 儲(chǔ)存條件 50T 100T TdTEnzyme 100μL 200μL -20℃EquilibrationBuffer(5×) 1mL 2mL -20℃LabelMixGreen 17μL 35μL -20℃，避光保存ProbeDiluent 0.5mL 1mL 4℃DAPI(500×) 12μL 24μL -20℃，避光保存BSAWorkingSolution 15mL 30mL -20℃TritonX-100(100%) 100μL 100μL 4℃DNaseI(5U/μL) 10μL 10μL -20℃10×DNaseIBuffer 0.6mL 0.6mL -20℃ProteinaseK(20mg/mL) 10μL 20μL -20℃自備耗材·離心機(jī)，熒光顯微鏡·96孔細(xì)胞板，可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭，10mMTrispH7.5，磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）·4%多聚甲醛，去離子水，組織自發(fā)熒光淬滅劑試劑準(zhǔn)備WorkingLabelMixGreen：根據(jù)實(shí)際用量，用ProbeDiluent將LabelMixGreen稀釋15倍得到WorkingLabelMixGreen，未用完的WorkingLabelMixGreen于-20℃避光分裝保存3個(gè)月，避免反復(fù)凍融。DAPI(1×)：根據(jù)實(shí)際用量，用PBS將DAPI(500×)稀釋成DAPI(1×)。TritonX-100(0.3%)：根據(jù)實(shí)際用量，用PBS將100%TritonX-100稀釋成0.3%TritonX-100。1×EquilibrationBuffer：流式細(xì)胞儀分析需制備1×EquilibrationBuffer，根據(jù)實(shí)際用量，用去離子水將5×EquilibrationBuffer稀釋成1×EquilibrationBuffer。1×DNaseIBuffer：根據(jù)實(shí)際用量，用去離子水將10×DNaseIBuffer稀釋成1×DNaseIBuffer。實(shí)驗(yàn)步驟A.樣本制備1.對(duì)于貼壁細(xì)胞（通過(guò)熒光顯微鏡分析）(1)在96孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，至少24h。通過(guò)所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)培養(yǎng)無(wú)誘導(dǎo)的對(duì)照組細(xì)胞。(2)除去培養(yǎng)基，在室溫下用50μL4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min。(3)除去固定液并用200μLPBS浸洗3次，每次5min。(4)固定后，每孔添加50μL0.3%TritonX-100，并在室溫下孵育30min。(5)除去通透劑，用50μLBSAWorkingSolution洗滌細(xì)胞2-3次。進(jìn)行熒光顯微鏡分析（繼續(xù)進(jìn)行步驟B.1）。注意：對(duì)于細(xì)胞爬片及其他孔板細(xì)胞，可依據(jù)實(shí)際情況調(diào)整固定液和通透劑體積。2.對(duì)于非貼壁細(xì)胞（通過(guò)流式細(xì)胞儀分析）(1)培養(yǎng)細(xì)胞至最佳密度（約1-2×106細(xì)胞/mL），通過(guò)所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)培養(yǎng)無(wú)誘導(dǎo)的對(duì)照培養(yǎng)物。(2)以300g離心并收集細(xì)胞（1-5×106），用PBS洗滌2次。(3)加入1mL4%多聚甲醛，在室溫下孵育30min。(4)以300g離心細(xì)胞，除去上清液，重懸于1mLPBS中，重復(fù)洗滌2次。(5)以300g離心細(xì)胞，除去上清液，在室溫下，用500μL0.3%Triton-X100重懸細(xì)胞5min使其通透（或者將細(xì)胞在100μg/mL蛋白酶K的PBS中重懸5min使其通透）。(6)以300g離心細(xì)胞，除去上清液，重懸于1mLPBS中。重復(fù)洗滌2次，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析（繼續(xù)進(jìn)行步驟B.2）。3.對(duì)于石蠟包埋的組織切片（通過(guò)熒光顯微鏡分析）(1)將組織在二甲苯浸泡2次，每次10-20min進(jìn)行脫蠟。(2)通過(guò)以下步驟（按給定順序）為組織復(fù)性：在100%乙醇中2次洗滌5min，然后依次在95%，70%和50%乙醇中洗滌3min。(3)用適量的PBS浸洗樣品2次，每次5min。(4)排出組織中多余的PBS，并在20μg/mL蛋白酶K（在10mMTrispH7.5中，現(xiàn)配現(xiàn)用）溶液中室溫孵育15min。注意：必須針對(duì)特定組織類型和厚度優(yōu)化蛋白酶消化時(shí)間。蛋白酶過(guò)度消化將導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)喪失，組織切片可能會(huì)從玻片上脫落。消化不充分會(huì)導(dǎo)致TdT標(biāo)記不徹底。(5)用適量的PBS浸洗樣品3次，每次5min來(lái)終止蛋白酶消化作用，進(jìn)行熒光顯微鏡分析（繼續(xù)進(jìn)行步驟B.1）。4.對(duì)于冰凍組織切片（通過(guò)熒光顯微鏡分析）(1)將切片在玻片上干燥后，在室溫下用200μL4%多聚甲醛固定30min。(2)用適量的PBS浸洗2次，每次5min。(3)去除組織中多余的PBS，并在20μg/mL蛋白酶K（在10mMTrispH7.5中，現(xiàn)配現(xiàn)用）溶液中室溫孵育15min。(4)用適量的PBS浸洗樣品3次，每次5min來(lái)終止蛋白酶消化作用，進(jìn)行熒光顯微鏡分析（繼續(xù)進(jìn)行步驟B.1）。注意：1.組織切片會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光，可使用組織自發(fā)熒光淬滅劑進(jìn)行處理。2.陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置（可選），A步驟完成后，在室溫條件下可用10U/mL的DNaseI（用1×DNaseIBuffer將5U/μL的DNaseI稀釋成10U/mL）消化細(xì)胞或組織10-20min，然后再進(jìn)行熒光顯微鏡分析。B.TUNEL分析1.熒光顯微鏡分析(1)根據(jù)要分析的樣品數(shù)量，在使用前準(zhǔn)備TdT標(biāo)記反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)組分 每孔體積（μL）TdTEnzyme 2EquilibrationBuffer(5×) 10WorkingLabelMixGreen 5去離子水 33總體積 50注意：配制TdT標(biāo)記反應(yīng)緩沖液之前，將各組分平衡至室溫，EquilibrationBuffer(5×)母液因低溫保存，會(huì)出現(xiàn)少量成分析出的現(xiàn)象，請(qǐng)顛倒混勻后使用。EquilibrationBuffer(5×)中含有高毒性化學(xué)物質(zhì)二甲胂酸鈉和氯化鈷，皮膚接觸后，立即用大量水沖洗。萬(wàn)一發(fā)生事故或感到不適，請(qǐng)立即就醫(yī)。使用時(shí)請(qǐng)勿飲酒，飲食或吸煙。(2)向每個(gè)樣品中加入50μL（96孔板推薦50μL，24孔板推薦200μL，切片建議添加100-200μL蓋住組織即可）反應(yīng)混合物，并在濕盒中37℃下避光孵育2h(不同的樣本，可視情況調(diào)整孵育時(shí)間)。(3)用PBS將樣品浸洗3次，每次5min。(4)用1×DAPI孵育10min對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)染。注意：如需計(jì)算凋亡細(xì)胞比例，建議復(fù)染，根據(jù)染色組織的不同，復(fù)染濃度可能需要調(diào)整。DAPI過(guò)度染色可能導(dǎo)致難以觀察熒光素標(biāo)記。(5)用適量的PBS浸洗樣品3次，每次5min。(6)對(duì)于細(xì)胞爬片、石蠟切片和冰凍切片等樣本，可加入水性封固劑或抗熒光淬滅劑，封住蓋玻片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。對(duì)于孔板、培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞樣本，加入適量PBS浸沒(méi)細(xì)胞，再進(jìn)行熒光顯微鏡拍照觀察。FITC通道（Ex/Em=490nm/520nm）。顯微鏡拍照技巧：1）使用DAPI通道查找細(xì)胞位置；2）陰性對(duì)照組優(yōu)先拍照，陰性對(duì)照顯示熒光為非特異性染色熒光，需要通過(guò)黑白平衡進(jìn)行扣除至無(wú)熒光；3）實(shí)驗(yàn)組或陽(yáng)性組拍照，扣除與對(duì)照相同的黑白平衡，得到實(shí)驗(yàn)組或陽(yáng)性組有效熒光。2.流式細(xì)胞儀分析(1)將細(xì)胞重懸于100μL1×EquilibrationBuffer中，在室溫下避光孵育10min。(2)300g離心細(xì)胞，除去上清液，重懸于50μLTdT標(biāo)記反應(yīng)緩沖液中，在37℃下孵育2h(不同的樣本，可視情況調(diào)整孵育時(shí)間)，孵育期間可定時(shí)輕輕地晃動(dòng)以混勻細(xì)胞。(3)300g離心細(xì)胞。除去上清液，重懸于1mLPBS中。重復(fù)洗滌2次。(4)重懸于200μL1×DAPI中，孵育10min。(5)通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。草莓時(shí)刻：除了基于細(xì)胞核變化檢測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞質(zhì)和線粒體的變化也能反映細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞質(zhì)的變化包括Caspase（KTA3020，KTA3022）、Bax（ABM0074）的表達(dá)差異；線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件（KTA4001）。掃描右側(cè)二維碼，關(guān)注Abbkine公眾號(hào)，了解更多Abbkine產(chǎn)品信息。 FAQ1.做TUNEL凋亡檢測(cè)，需要抗原修復(fù)或者冰凍修復(fù)嗎？需要先固定細(xì)胞，不需要做抗原修復(fù)，本試劑盒標(biāo)記的是細(xì)胞核內(nèi)的斷裂基因，而不是抗原蛋白。2.TUNEL檢測(cè)可以和免疫熒光（IF）一起雙染嗎？先后順序在怎樣的？可以和IF進(jìn)行共染，建議先做TUNEL檢