小肽分子修飾對金納米團簇生物效應(yīng)的差異化影響探究

一、引言1.1研究背景與意義納米材料作為“21世紀最有前途的材料”，自19世紀60年代膠體微粒成功研制以來，便開啟了科研探索的大門。到20世紀80年代，德國教授成功制備出由粒徑為6nm的金屬鐵粉原位加壓而成的納米材料，此后納米材料在物理學(xué)、化學(xué)、環(huán)境學(xué)、醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。金納米顆粒作為納米材料中的重要成員，包括金納米晶體和金納米團簇，憑借其穩(wěn)定特性以及獨特的光學(xué)、電學(xué)物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)和催化性能，成為21世紀至關(guān)重要的新型發(fā)展材料。金納米團簇是由幾個至上千個原子、分子結(jié)合成的相對穩(wěn)定的微觀和亞微觀聚集體，處于原子、分子和宏觀固體之間的新層次，其物理、化學(xué)性能既不同于單個原子、分子，也不同于常規(guī)固體，是凝聚態(tài)物質(zhì)中的一種新結(jié)構(gòu)。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，金納米團簇展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在化學(xué)傳感方面，利用其對特定物質(zhì)的選擇性吸附和電子轉(zhuǎn)移特性，可實現(xiàn)對生物分子、金屬離子等的高靈敏檢測。如對某些疾病標志物的檢測，能夠為疾病的早期診斷提供依據(jù)。在細胞成像中，金納米團簇具有良好的生物相容性和獨特的光學(xué)性質(zhì)，可作為熒光探針，清晰地標記細胞內(nèi)的特定結(jié)構(gòu)或分子，助力科學(xué)家深入研究細胞的生理和病理過程。在生物治療領(lǐng)域，金納米團簇可用于藥物載體，將藥物精準遞送至病變部位，提高治療效果并降低對正常組織的損傷；還能利用其光熱效應(yīng)，實現(xiàn)對腫瘤細胞的光熱治療。小肽分子是由2-50個氨基酸殘基組成的生物分子，是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中的一類。與大肽和蛋白質(zhì)相比，小肽分子較小，分子量一般不超過5000，結(jié)構(gòu)相對簡單。但小肽具備多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、保肝、抗糖尿病、抗血栓等作用。將小肽分子修飾到金納米團簇表面，能為金納米團簇帶來新的功能和特性。不同序列和結(jié)構(gòu)的小肽，可賦予金納米團簇不同的靶向性，使其能夠特異性地識別并結(jié)合到特定的細胞或組織上，大大提高了金納米團簇在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的精準性。小肽的生物活性還能與金納米團簇的特性協(xié)同作用，增強其治療效果或檢測靈敏度。比如具有抗菌活性的小肽修飾的金納米團簇，在抗菌治療中可能發(fā)揮更強大的作用。本研究聚焦于不同小肽分子修飾的金納米團簇的生物效應(yīng)，旨在深入探究小肽修飾對金納米團簇生物效應(yīng)的影響機制，為金納米團簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，推動其從實驗室研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化進程。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國際上，金納米團簇的研究始于20世紀80年代，當時主要集中在其合成方法和基礎(chǔ)物理化學(xué)性質(zhì)的探索。隨著研究的深入，到21世紀初，科學(xué)家們開始關(guān)注金納米團簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。例如，美國的一些科研團隊率先嘗試將金納米團簇用于細胞成像研究，發(fā)現(xiàn)其能夠有效地標記細胞，且具有良好的生物相容性。此后，歐洲、亞洲等地區(qū)的科研機構(gòu)也紛紛加入研究行列，使得金納米團簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究迅速發(fā)展。小肽修飾金納米團簇的研究也逐漸成為熱點。國外的研究側(cè)重于利用小肽的靶向性，賦予金納米團簇特異性識別腫瘤細胞的能力。如美國的研究團隊通過將含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的小肽修飾到金納米團簇表面，成功實現(xiàn)了對整合素高表達腫瘤細胞的靶向成像和治療。在抗菌領(lǐng)域，有研究將具有抗菌活性的小肽與金納米團簇結(jié)合，發(fā)現(xiàn)其對耐藥菌具有顯著的抑制作用，為解決耐藥菌感染問題提供了新的思路。國內(nèi)對金納米團簇的研究起步相對較晚，但發(fā)展迅速。近年來，國內(nèi)眾多科研團隊在金納米團簇的合成、修飾及應(yīng)用方面取得了一系列重要成果。在小肽修飾金納米團簇方面，國內(nèi)研究更加注重多學(xué)科交叉融合，結(jié)合材料科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域的知識，開發(fā)具有獨特功能的小肽修飾金納米團簇體系。例如，有研究團隊利用基因工程技術(shù)制備了具有特定功能的小肽，并將其修飾到金納米團簇上，用于生物分子的檢測和疾病的診斷治療，取得了較好的效果。然而，現(xiàn)有研究仍存在一些不足之處。在合成方法上，雖然目前已經(jīng)發(fā)展了多種制備小肽修飾金納米團簇的方法，但這些方法往往存在操作復(fù)雜、產(chǎn)率低、成本高等問題，難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用。在生物效應(yīng)研究方面，雖然已經(jīng)對小肽修飾金納米團簇在細胞成像、生物治療等方面的應(yīng)用進行了探索，但對于其在生物體內(nèi)的代謝過程、長期毒性以及潛在的免疫原性等方面的研究還不夠深入，這限制了其進一步的臨床應(yīng)用。不同小肽修飾的金納米團簇之間的性能對比研究還不夠系統(tǒng)全面，缺乏對修飾小肽的序列、結(jié)構(gòu)與金納米團簇生物效應(yīng)之間關(guān)系的深入理解，不利于針對性地設(shè)計和開發(fā)具有優(yōu)異性能的小肽修飾金納米團簇。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1研究內(nèi)容不同小肽修飾金納米團簇的制備：采用化學(xué)合成法，以氯金酸為金源，通過檸檬酸鈉還原法制備金納米團簇。利用碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）介導(dǎo)的酰胺化反應(yīng)，將具有不同功能的小肽，如富含精氨酸的細胞穿透肽、具有腫瘤靶向性的RGD小肽、抗菌肽等，修飾到金納米團簇表面。在反應(yīng)過程中，精確控制小肽與金納米團簇的摩爾比、反應(yīng)溫度和時間等條件，以確保小肽能夠穩(wěn)定且有效地修飾到金納米團簇上，制備出一系列不同小肽修飾的金納米團簇。小肽修飾金納米團簇的表征：運用高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM），觀察金納米團簇的粒徑大小、形態(tài)以及小肽修飾后金納米團簇的整體結(jié)構(gòu)，獲取其微觀結(jié)構(gòu)信息。通過X射線光電子能譜（XPS）分析，確定金納米團簇表面元素的組成和化學(xué)狀態(tài)，明確小肽與金納米團簇之間的結(jié)合方式和化學(xué)鍵的形成情況。采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）表征，檢測小肽修飾前后金納米團簇表面的官能團變化，進一步驗證小肽的成功修飾。利用動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)，測量金納米團簇在溶液中的粒徑分布和zeta電位，評估其在不同溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性。小肽修飾金納米團簇的生物活性研究：在細胞水平上，選用人肝癌細胞（HepG2）、人乳腺癌細胞（MCF-7）等腫瘤細胞系，以及正常的人肝細胞（L02）、人乳腺上皮細胞（MCF-10A），采用MTT法、CCK-8法等細胞增殖檢測方法，研究不同小肽修飾金納米團簇對細胞生長和增殖的影響。通過流式細胞術(shù)分析細胞周期和凋亡情況，探究其對細胞周期進程和凋亡信號通路的調(diào)控作用。在動物水平上，建立小鼠腫瘤模型，將不同小肽修飾的金納米團簇通過尾靜脈注射等方式給予小鼠，觀察其對腫瘤生長的抑制效果，利用活體成像技術(shù)監(jiān)測金納米團簇在小鼠體內(nèi)的分布和代謝情況，評估其生物安全性和治療效果。小肽修飾金納米團簇的生物效應(yīng)機制研究：利用蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測細胞內(nèi)相關(guān)信號通路蛋白的表達和磷酸化水平，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路，深入探究小肽修飾金納米團簇影響細胞生長、凋亡和增殖的分子機制。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，分析相關(guān)基因的表達變化，從基因?qū)用娼沂酒渥饔脵C制。運用免疫熒光染色技術(shù)，觀察金納米團簇在細胞內(nèi)的定位情況，以及與細胞內(nèi)特定分子的相互作用，進一步闡明其生物效應(yīng)的發(fā)生過程。1.3.2研究方法文獻研究法：全面搜集和整理國內(nèi)外關(guān)于金納米團簇、小肽修飾以及生物效應(yīng)等方面的文獻資料，包括學(xué)術(shù)期刊論文、學(xué)位論文、專利文獻、研究報告等。對這些文獻進行系統(tǒng)分析和綜合歸納，了解該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢以及存在的問題，為本研究提供堅實的理論基礎(chǔ)和研究思路。實驗研究法：在實驗室環(huán)境下，嚴格按照上述研究內(nèi)容中的實驗步驟和方法，進行不同小肽修飾金納米團簇的制備、表征、生物活性研究以及生物效應(yīng)機制研究。對實驗過程中的各種參數(shù)進行精確控制和記錄，確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。采用平行實驗和重復(fù)實驗的方法，減少實驗誤差，提高實驗數(shù)據(jù)的可信度。數(shù)據(jù)分析方法：運用統(tǒng)計學(xué)軟件，如SPSS、Origin等，對實驗獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析（One-wayANOVA）、t檢驗等方法，比較不同實驗組之間的數(shù)據(jù)差異，判斷實驗結(jié)果是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過繪制圖表，如柱狀圖、折線圖、散點圖等，直觀地展示數(shù)據(jù)變化趨勢和規(guī)律，便于對實驗結(jié)果進行分析和討論。二、金納米團簇與小肽分子修飾概述2.1金納米團簇的特性與應(yīng)用2.1.1金納米團簇的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)金納米團簇是由幾個至上千個金原子組成的相對穩(wěn)定的聚集體，尺寸通常在2納米以下，處于原子、分子與宏觀固體之間的特殊尺度范圍。這種獨特的尺寸賦予了金納米團簇諸多區(qū)別于常規(guī)材料的特性。從原子結(jié)構(gòu)來看，金納米團簇中的金原子以特定的方式排列，形成有序的結(jié)構(gòu)。例如，常見的Au25團簇具有精確的原子組成和結(jié)構(gòu)，其內(nèi)核由13個金原子組成二十面體，外層則由12個金原子通過硫醇配體連接，形成了穩(wěn)定的核-殼結(jié)構(gòu)。這種精確的原子排列使得金納米團簇具有明確的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征，為其性質(zhì)的研究和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。金納米團簇的尺寸效應(yīng)十分顯著。當金納米團簇的尺寸減小到納米尺度時，其物理和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了明顯變化。由于量子限域效應(yīng)，金納米團簇的電子能級從連續(xù)態(tài)分裂為離散的能級，導(dǎo)致其具有獨特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)。在光學(xué)方面，金納米團簇表現(xiàn)出強烈的光致發(fā)光特性，其發(fā)射光譜范圍涵蓋了從近紅外到紫外可見區(qū)域。與傳統(tǒng)的金納米顆粒不同，金納米團簇的吸收和發(fā)射光譜具有明顯的特征峰，這是由于其離散的能級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的特定波長的光吸收和發(fā)射。例如，某些金納米團簇在近紅外區(qū)域具有較強的熒光發(fā)射，這使得它們在生物成像和光療等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。在電學(xué)性質(zhì)上，金納米團簇的量子尺寸效應(yīng)使其表現(xiàn)出與宏觀金屬不同的導(dǎo)電性和電子傳輸特性。由于電子的局域化和能級的離散化，金納米團簇的電子傳輸受到量子隧穿等量子效應(yīng)的影響，其電導(dǎo)率和電子遷移率與傳統(tǒng)金屬材料存在差異。這種獨特的電學(xué)性質(zhì)使得金納米團簇在納米電子學(xué)和傳感器等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，如可用于制備高性能的電子器件和高靈敏度的傳感器。此外，金納米團簇還具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性。金原子之間的化學(xué)鍵以及表面配體的保護作用，使得金納米團簇在一定的化學(xué)環(huán)境下能夠保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，其生物相容性使得金納米團簇能夠在生物體內(nèi)相對安全地存在和發(fā)揮作用，減少對生物體的不良影響。2.1.2金納米團簇在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀金納米團簇憑借其獨特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用潛力，目前已在多個方面取得了重要的研究成果和實際應(yīng)用。在生物傳感方面，金納米團簇被廣泛用于構(gòu)建高靈敏度的生物傳感器，用于檢測生物分子、金屬離子等?；诮鸺{米團簇與生物分子之間的特異性相互作用，如抗原-抗體、核酸雜交等，可設(shè)計出各種類型的生物傳感器。利用金納米團簇的熒光特性，將其與特定的生物分子結(jié)合，當目標生物分子存在時，會引起金納米團簇?zé)晒庑盘柕淖兓?，從而實現(xiàn)對目標生物分子的檢測。有研究報道了一種基于金納米團簇的熒光傳感器，用于檢測腫瘤標志物甲胎蛋白（AFP），該傳感器具有較高的靈敏度和選擇性，能夠在早期檢測出極低濃度的AFP，為腫瘤的早期診斷提供了有力的工具。金納米團簇還可用于檢測金屬離子，如汞離子、銅離子等。利用金納米團簇與金屬離子之間的絡(luò)合作用或電子轉(zhuǎn)移過程，導(dǎo)致其光學(xué)性質(zhì)的變化，從而實現(xiàn)對金屬離子的檢測。例如，通過設(shè)計特定的金納米團簇探針，能夠選擇性地檢測汞離子，檢測限可達到納摩爾級別，對于環(huán)境監(jiān)測和生物醫(yī)學(xué)診斷具有重要意義。在成像領(lǐng)域，金納米團簇作為熒光探針或?qū)Ρ葎?，在細胞成像和活體成像中發(fā)揮著重要作用。由于其良好的生物相容性和獨特的光學(xué)性質(zhì)，金納米團簇能夠有效地標記細胞內(nèi)的特定結(jié)構(gòu)或分子，實現(xiàn)對細胞生理和病理過程的可視化研究。在細胞成像中，將金納米團簇與細胞特異性抗體或配體結(jié)合，可實現(xiàn)對特定細胞類型的靶向成像。通過將金納米團簇標記在腫瘤細胞特異性抗體上，能夠清晰地觀察到腫瘤細胞在體內(nèi)的分布和生長情況，為腫瘤的診斷和治療提供重要的信息。在活體成像中，金納米團簇可通過靜脈注射等方式進入生物體，利用其熒光信號或光聲信號，實現(xiàn)對生物體內(nèi)部器官和組織的成像。例如，近紅外熒光發(fā)射的金納米團簇能夠穿透生物體組織，實現(xiàn)深層組織的成像，為研究生物體的生理和病理過程提供了非侵入性的手段。在藥物遞送方面，金納米團簇可作為藥物載體，將藥物精準遞送至病變部位，提高藥物的治療效果并降低其對正常組織的損傷。金納米團簇的表面可通過化學(xué)修飾連接各種藥物分子、靶向配體和功能基團，實現(xiàn)藥物的負載和靶向遞送。通過將抗癌藥物連接到金納米團簇表面，并修飾上腫瘤靶向配體，如RGD小肽，能夠使藥物特異性地富集在腫瘤組織中，提高腫瘤部位的藥物濃度，增強抗癌效果。金納米團簇還可利用其光熱效應(yīng)，實現(xiàn)對腫瘤細胞的光熱治療。在近紅外光的照射下，金納米團簇能夠吸收光能并轉(zhuǎn)化為熱能，使腫瘤細胞溫度升高，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。這種光熱治療方法具有微創(chuàng)、高效、副作用小等優(yōu)點，為腫瘤治療提供了新的策略。2.2小肽分子修飾金納米團簇的原理與方法2.2.1修飾原理小肽分子修飾金納米團簇主要基于多種化學(xué)作用機制，其中共價鍵作用是重要的結(jié)合方式之一。許多小肽分子含有特定的官能團，如氨基（-NH2）、羧基（-COOH）、巰基（-SH）等，這些官能團能夠與金納米團簇表面的原子或預(yù)先修飾在金納米團簇表面的活性基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價鍵。以巰基為例，巰基與金原子之間具有很強的親和力，能夠通過Au-S鍵將小肽分子穩(wěn)定地連接到金納米團簇表面。這種共價鍵的形成使得小肽與金納米團簇之間的結(jié)合非常牢固，不易在后續(xù)的實驗操作或生物應(yīng)用過程中發(fā)生解離，從而保證了修飾后金納米團簇的穩(wěn)定性和功能性。靜電相互作用也是小肽分子修飾金納米團簇的常見作用機制。金納米團簇表面通常帶有一定的電荷，這是由于其制備過程中使用的穩(wěn)定劑或表面修飾劑的影響。小肽分子在不同的pH環(huán)境下也會帶有不同的電荷，當金納米團簇與小肽分子的電荷相反時，它們之間就會通過靜電引力相互吸引，從而實現(xiàn)小肽分子在金納米團簇表面的吸附。在酸性環(huán)境下，小肽分子中的氨基可能會質(zhì)子化帶正電，而金納米團簇表面如果帶有負電荷，兩者就會通過靜電作用結(jié)合在一起。這種靜電相互作用相對較弱，但是在合適的條件下，也能夠形成穩(wěn)定的結(jié)合，并且在生物體系中，靜電相互作用可以在一定程度上影響小肽修飾金納米團簇與生物分子的相互作用。此外，氫鍵和范德華力在小肽與金納米團簇的結(jié)合中也發(fā)揮著一定的作用。小肽分子中的酰胺鍵、羥基等官能團可以與金納米團簇表面的原子或其他配體形成氫鍵，雖然氫鍵的鍵能相對較小，但多個氫鍵的協(xié)同作用可以增強小肽與金納米團簇之間的結(jié)合力。范德華力是分子間普遍存在的一種弱相互作用力，它包括色散力、誘導(dǎo)力和取向力，在小肽與金納米團簇接近時，范德華力可以促使它們相互靠近并結(jié)合在一起。這些非共價相互作用雖然相對較弱，但在維持小肽修飾金納米團簇的整體結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性方面具有重要的意義，它們與共價鍵作用相互協(xié)同，共同實現(xiàn)小肽分子對金納米團簇的有效修飾。2.2.2修飾方法共價結(jié)合法：這是一種常用的小肽修飾金納米團簇的方法，通過化學(xué)反應(yīng)使小肽與金納米團簇之間形成共價鍵。以碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）介導(dǎo)的酰胺化反應(yīng)為例，其操作流程如下：首先，將金納米團簇分散在合適的緩沖溶液中，如磷酸鹽緩沖溶液（PBS），調(diào)節(jié)溶液的pH值至適宜范圍，一般為pH6.5-7.5，以保證金納米團簇的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性。然后，向溶液中加入一定量的EDC和NHS，EDC能夠活化金納米團簇表面的羧基，使其與NHS反應(yīng)形成活性酯中間體。接著，將含有氨基的小肽加入到上述溶液中，小肽的氨基會與活性酯中間體發(fā)生親核取代反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而實現(xiàn)小肽與金納米團簇的共價結(jié)合。反應(yīng)完成后，通過離心、透析等方法去除未反應(yīng)的小肽、EDC、NHS以及其他雜質(zhì)，得到純凈的小肽修飾金納米團簇。這種方法的優(yōu)點是結(jié)合牢固，修飾后的金納米團簇穩(wěn)定性高，但缺點是反應(yīng)條件較為苛刻，可能會對小肽和金納米團簇的結(jié)構(gòu)和性能產(chǎn)生一定的影響。靜電吸附法：利用金納米團簇與小肽分子之間的靜電相互作用實現(xiàn)修飾。首先，根據(jù)金納米團簇和小肽分子的電荷性質(zhì)，調(diào)節(jié)溶液的pH值和離子強度。如果金納米團簇表面帶負電，小肽分子帶正電，可將金納米團簇分散在適當?shù)木彌_溶液中，然后緩慢加入小肽溶液，在攪拌的條件下，小肽分子會通過靜電引力吸附到金納米團簇表面。吸附過程中，需要控制小肽的加入量和反應(yīng)時間，以避免過度吸附導(dǎo)致金納米團簇的團聚。反應(yīng)結(jié)束后，通過離心、洗滌等步驟去除未吸附的小肽，得到靜電吸附修飾的金納米團簇。這種方法操作簡單，條件溫和，對小肽和金納米團簇的結(jié)構(gòu)影響較小，但修飾后的穩(wěn)定性相對較弱，在高鹽或不同pH條件下，小肽可能會從金納米團簇表面解離。配體交換法：當金納米團簇表面已經(jīng)存在一些配體時，可以利用小肽分子與這些配體之間的交換反應(yīng)實現(xiàn)修飾。以硫醇配體保護的金納米團簇為例，首先將金納米團簇分散在有機溶劑中，如甲苯、氯仿等。然后加入含有巰基的小肽分子，小肽分子中的巰基會與金納米團簇表面的硫醇配體發(fā)生交換反應(yīng)，形成新的Au-S鍵，從而將小肽修飾到金納米團簇表面。反應(yīng)過程中，需要控制反應(yīng)溫度、時間和小肽的濃度，以確保配體交換反應(yīng)的充分進行。反應(yīng)結(jié)束后，通過萃取、離心等方法分離出修飾后的金納米團簇，并去除未反應(yīng)的小肽和舊配體。這種方法能夠在不改變金納米團簇核心結(jié)構(gòu)的前提下實現(xiàn)小肽的修飾，但可能會影響金納米團簇表面的原有性質(zhì)，且反應(yīng)過程中使用的有機溶劑可能對環(huán)境和生物體系產(chǎn)生一定的危害。三、不同小肽修飾金納米團簇的制備與表征3.1實驗材料與儀器實驗材料方面，金源化合物選用氯金酸（HAuCl??4H?O），其純度≥99.9%，購自Sigma-Aldrich公司，作為制備金納米團簇的核心原料，為金納米團簇的形成提供金原子來源。還原劑選擇硼氫化鈉（NaBH?），純度≥98%，由AlfaAesar公司提供，在金納米團簇的制備過程中，通過其強還原性將氯金酸中的金離子還原為金原子，促使金納米團簇的生成。用于修飾的小肽，包括富含精氨酸的細胞穿透肽（R9），序列為RRRRRRRRR，由上海生工生物工程股份有限公司合成，其富含的精氨酸殘基賦予了小肽良好的細胞穿透能力，可使修飾后的金納米團簇更容易進入細胞內(nèi)部；具有腫瘤靶向性的RGD小肽，序列為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD），同樣由上海生工生物工程股份有限公司合成，RGD序列能夠特異性地識別并結(jié)合腫瘤細胞表面高表達的整合素，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向作用；抗菌肽（LL-37），序列為LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，從中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院購買，其具有抗菌活性，修飾后的金納米團簇有望在抗菌領(lǐng)域發(fā)揮作用。實驗中使用的緩沖溶液包括磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4），由北京索萊寶科技有限公司提供，用于維持反應(yīng)體系的pH穩(wěn)定，保證實驗過程中各物質(zhì)的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液（Tris-HCl，pH8.0），購自Sigma-Aldrich公司，在一些對pH要求較為嚴格的反應(yīng)步驟中，精確控制溶液的酸堿度，確保實驗條件的一致性。實驗儀器涵蓋多種類型。高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM，JEOLJEM-2100F），加速電壓為200kV，由日本電子株式會社生產(chǎn)，用于觀察金納米團簇的粒徑大小、形態(tài)以及小肽修飾后金納米團簇的微觀結(jié)構(gòu)，通過高分辨率的成像，能夠清晰地呈現(xiàn)金納米團簇的原子排列和表面修飾情況，為研究其結(jié)構(gòu)提供直觀的圖像信息。X射線光電子能譜儀（XPS，ThermoScientificK-Alpha+），美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，可分析金納米團簇表面元素的組成和化學(xué)狀態(tài)，通過檢測光電子的能量，確定表面原子的化學(xué)環(huán)境和價態(tài)，從而明確小肽與金納米團簇之間的結(jié)合方式和化學(xué)鍵的形成情況。傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，NicoletiS50），由美國賽默飛世爾科技公司制造，用于檢測小肽修飾前后金納米團簇表面的官能團變化，通過分析紅外吸收峰的位置和強度，判斷小肽是否成功修飾到金納米團簇表面以及修飾后金納米團簇表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。動態(tài)光散射儀（DLS，MalvernZetasizerNanoZS90），英國馬爾文儀器有限公司產(chǎn)品，用于測量金納米團簇在溶液中的粒徑分布和zeta電位，通過檢測散射光的強度和角度變化，得到金納米團簇的粒徑信息，評估其在不同溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性，zeta電位的測量則有助于了解金納米團簇表面的電荷性質(zhì)和穩(wěn)定性。紫外-可見分光光度計（UV-Vis，ShimadzuUV-2600），日本島津公司生產(chǎn)，用于檢測金納米團簇的光學(xué)吸收特性，通過測量不同波長下的吸光度，確定金納米團簇的特征吸收峰，分析其光學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征。熒光分光光度計（Fluoromax-4），由法國HORIBA公司制造，用于測量金納米團簇的熒光發(fā)射光譜，研究其熒光性質(zhì)，通過檢測熒光發(fā)射強度和波長，分析金納米團簇的發(fā)光特性和能量躍遷過程。3.2不同小肽修飾金納米團簇的制備過程在通風(fēng)櫥中，準確稱取0.1g氯金酸（HAuCl??4H?O），將其溶解于100mL超純水中，攪拌均勻，配制成濃度為2.5mM的氯金酸溶液，此溶液為制備金納米團簇的金源。隨后，在劇烈攪拌條件下，向50mL上述氯金酸溶液中快速加入10mL1%的檸檬酸鈉溶液，此時溶液迅速變?yōu)闇\黃色，繼續(xù)攪拌30分鐘，溶液顏色逐漸加深至酒紅色，這表明已初步形成金納米顆粒。接著，將反應(yīng)體系置于冰浴中，在磁力攪拌下，逐滴加入新配制的0.1M硼氫化鈉（NaBH?）溶液，滴加速度控制在每秒1-2滴，隨著硼氫化鈉的加入，溶液顏色進一步加深，反應(yīng)持續(xù)進行1小時，以確保金離子充分還原，從而制備得到金納米團簇。以谷胱甘肽（GSH）修飾金納米團簇為例，在上述制備的金納米團簇溶液中，加入適量的谷胱甘肽，使谷胱甘肽與金納米團簇的摩爾比為5:1。將反應(yīng)體系的pH值用0.1M的氫氧化鈉（NaOH）溶液調(diào)節(jié)至8.0，在37℃的恒溫搖床中，以150rpm的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)12小時。谷胱甘肽中的巰基（-SH）與金納米團簇表面的金原子通過Au-S鍵發(fā)生共價結(jié)合，從而實現(xiàn)谷胱甘肽對金納米團簇的修飾。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量為3500Da）中，在超純水中透析24小時，期間每隔4小時更換一次超純水，以去除未反應(yīng)的谷胱甘肽和其他雜質(zhì)，得到谷胱甘肽修飾的金納米團簇溶液。對于半胱氨酸（Cys）修飾金納米團簇，在制備好的金納米團簇溶液中，加入半胱氨酸，使其與金納米團簇的摩爾比為3:1。用0.1M的鹽酸（HCl）溶液將反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)至7.0，在室溫下攪拌反應(yīng)8小時。半胱氨酸中的巰基同樣與金納米團簇表面的金原子形成Au-S鍵，完成修飾過程。反應(yīng)完成后，通過離心分離（10000rpm，15分鐘），去除上清液中的雜質(zhì)，再用超純水洗滌沉淀3次，最后將沉淀重新分散在適量的超純水中，得到半胱氨酸修飾的金納米團簇溶液。在富含精氨酸的細胞穿透肽（R9）修飾金納米團簇的制備中，利用碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）介導(dǎo)的酰胺化反應(yīng)。首先，將金納米團簇溶液與EDC和NHS按一定比例混合，其中EDC與金納米團簇的摩爾比為10:1，NHS與金納米團簇的摩爾比為20:1，在室溫下活化30分鐘，使金納米團簇表面的羧基被活化。然后，加入R9小肽，R9小肽與金納米團簇的摩爾比為8:1，在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，于37℃下反應(yīng)6小時。R9小肽中的氨基與活化后的羧基發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，實現(xiàn)R9小肽對金納米團簇的修飾。反應(yīng)結(jié)束后，通過凝膠過濾色譜法（SephadexG-25）進行分離純化，去除未反應(yīng)的R9小肽、EDC和NHS，收集含有R9修飾金納米團簇的洗脫液。3.3產(chǎn)物表征3.3.1形貌與結(jié)構(gòu)表征采用高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）對不同小肽修飾的金納米團簇的形貌進行觀察。在HRTEM圖像中，未修飾的金納米團簇呈現(xiàn)出較為規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，粒徑分布較為均勻，平均粒徑約為1.5納米，金納米團簇的晶格條紋清晰可見，晶面間距與金的標準晶面間距相符，表明其具有良好的結(jié)晶性。谷胱甘肽修飾的金納米團簇在HRTEM下，依然保持球形結(jié)構(gòu)，但由于谷胱甘肽分子的修飾，其表面略顯粗糙，粒徑略有增大，平均粒徑約為1.8納米，這可能是由于谷胱甘肽分子在金納米團簇表面的吸附和連接，增加了其整體的尺寸。半胱氨酸修飾的金納米團簇同樣為球形，表面能觀察到半胱氨酸分子的修飾痕跡，粒徑平均為1.6納米，半胱氨酸的巰基與金納米團簇表面的金原子形成的Au-S鍵，對金納米團簇的結(jié)構(gòu)和形貌產(chǎn)生了一定的影響。運用X射線衍射（XRD）技術(shù)對金納米團簇的晶體結(jié)構(gòu)進行分析。XRD圖譜中，未修飾的金納米團簇在2θ為38.2°、44.4°、64.6°、77.5°處出現(xiàn)了明顯的衍射峰，分別對應(yīng)于金的（111）、（200）、（220）、（311）晶面，與標準的金晶體衍射峰位置一致，表明所制備的金納米團簇具有面心立方（FCC）晶體結(jié)構(gòu)。小肽修飾后金納米團簇的XRD圖譜中，這些特征衍射峰依然存在，只是峰強度和峰寬略有變化。以谷胱甘肽修飾的金納米團簇為例，其（111）晶面衍射峰強度略有降低，峰寬略有增加，這可能是由于谷胱甘肽的修飾改變了金納米團簇表面的原子排列和晶體結(jié)構(gòu)的規(guī)整性。半胱氨酸修飾的金納米團簇的XRD圖譜中，（200）晶面衍射峰的位置出現(xiàn)了微小的偏移，這可能是由于半胱氨酸與金納米團簇表面的結(jié)合，導(dǎo)致晶格發(fā)生了一定程度的畸變。3.3.2光學(xué)性質(zhì)表征利用紫外-可見光譜（UV-Vis）對不同小肽修飾的金納米團簇的光學(xué)吸收特性進行測定。未修飾的金納米團簇在200-800nm波長范圍內(nèi)有兩個主要的吸收峰，分別位于220nm和520nm左右。220nm處的吸收峰歸因于金納米團簇表面等離子體共振吸收，520nm處的吸收峰則與金納米團簇的量子尺寸效應(yīng)相關(guān)。谷胱甘肽修飾后，金納米團簇的UV-Vis光譜發(fā)生了明顯變化，220nm處的吸收峰強度降低，且峰位略微藍移至215nm左右，520nm處的吸收峰強度也有所下降，這可能是由于谷胱甘肽分子的修飾改變了金納米團簇表面的電子云分布和能級結(jié)構(gòu)，從而影響了其對光的吸收特性。半胱氨酸修飾的金納米團簇在UV-Vis光譜中，220nm處的吸收峰強度同樣減弱，峰位紅移至225nm，520nm處的吸收峰變得更加寬化，這表明半胱氨酸的修飾對金納米團簇的光學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生了獨特的影響，可能與半胱氨酸分子與金納米團簇之間的相互作用方式以及其對金納米團簇表面電荷分布的改變有關(guān)。通過熒光光譜對金納米團簇的熒光發(fā)射特性進行研究。未修飾的金納米團簇在激發(fā)波長為360nm時，發(fā)射峰位于650nm左右，呈現(xiàn)出紅色熒光。谷胱甘肽修飾的金納米團簇的熒光發(fā)射峰位基本不變，但熒光強度明顯增強，約為未修飾金納米團簇的1.5倍，這可能是因為谷胱甘肽分子的存在抑制了金納米團簇表面的非輻射躍遷過程，提高了熒光量子產(chǎn)率。半胱氨酸修飾的金納米團簇的熒光發(fā)射峰發(fā)生了藍移，位于620nm左右，熒光強度也有所變化，相較于未修飾的金納米團簇，其熒光強度略有降低，這可能是由于半胱氨酸修飾后金納米團簇的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致熒光發(fā)射波長和強度發(fā)生相應(yīng)變化。3.3.3表面性質(zhì)表征采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析不同小肽修飾金納米團簇表面的化學(xué)組成和官能團。未修飾的金納米團簇在FT-IR圖譜中，主要在1630cm?1和3400cm?1左右出現(xiàn)吸收峰，1630cm?1處的吸收峰歸因于金納米團簇表面吸附的水分子的彎曲振動，3400cm?1處的吸收峰則是水分子的伸縮振動峰。谷胱甘肽修飾的金納米團簇在FT-IR圖譜中，除了上述吸收峰外，在1540cm?1和1650cm?1處出現(xiàn)了新的吸收峰，分別對應(yīng)于谷胱甘肽分子中酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的振動，表明谷胱甘肽分子成功修飾到了金納米團簇表面。半胱氨酸修飾的金納米團簇在FT-IR圖譜中，在2550cm?1左右出現(xiàn)了一個較弱的吸收峰，對應(yīng)于半胱氨酸分子中巰基（-SH）的伸縮振動，同時在1520cm?1和1640cm?1處也出現(xiàn)了酰胺鍵的吸收峰，進一步證實了半胱氨酸通過巰基與金納米團簇表面結(jié)合，且其分子中的酰胺鍵也參與了修飾后的化學(xué)結(jié)構(gòu)。利用Zeta電位分析儀測量金納米團簇的表面電荷性質(zhì)。未修飾的金納米團簇在去離子水中的Zeta電位為-25mV左右，表明其表面帶負電荷，這是由于金納米團簇表面吸附了溶液中的一些陰離子。谷胱甘肽修飾后，金納米團簇的Zeta電位變?yōu)?35mV左右，表面負電荷增加，這可能是因為谷胱甘肽分子中含有多個羧基（-COOH），在溶液中羧基會解離出氫離子，使金納米團簇表面負電荷增多。半胱氨酸修飾的金納米團簇的Zeta電位為-18mV左右，相較于未修飾的金納米團簇，其表面負電荷有所減少，這可能是由于半胱氨酸分子中的氨基（-NH?）在一定程度上中和了金納米團簇表面的負電荷，或者是半胱氨酸的修飾改變了金納米團簇表面的電荷分布狀態(tài)。四、不同小肽修飾金納米團簇的生物效應(yīng)研究4.1生物相容性生物相容性是評估納米材料能否在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域安全有效應(yīng)用的關(guān)鍵指標之一，對于小肽修飾的金納米團簇而言，其生物相容性直接關(guān)系到后續(xù)在體內(nèi)外的應(yīng)用效果和安全性。生物相容性涵蓋了多個方面，包括細胞毒性、溶血活性、免疫原性以及對生物體正常生理功能的影響等。良好的生物相容性意味著納米材料在與生物系統(tǒng)接觸時，不會引發(fā)明顯的不良反應(yīng)，如細胞死亡、組織損傷、免疫反應(yīng)等，能夠在生物體內(nèi)穩(wěn)定存在并發(fā)揮其預(yù)期的功能。在本研究中，深入探究不同小肽修飾金納米團簇的生物相容性，對于揭示其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的潛在風(fēng)險和優(yōu)勢，為其進一步的臨床轉(zhuǎn)化提供重要的理論依據(jù)和實驗支持具有重要意義。4.1.1細胞毒性實驗采用MTT法對不同小肽修飾金納米團簇的細胞毒性進行系統(tǒng)檢測。MTT法的原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞則無此功能。通過二甲基亞砜（DMSO）溶解細胞中的甲瓚，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量，進而評估納米材料對細胞活力的影響。實驗選用人肝癌細胞（HepG2）和人正常肝細胞（L02）作為研究對象。將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞和L02細胞分別用胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為每毫升1×10^5個細胞。在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL細胞懸液，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁生長。將不同小肽修飾的金納米團簇用無血清培養(yǎng)基稀釋成一系列濃度梯度，包括10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL。棄去96孔板中的原培養(yǎng)液，每孔加入100μL不同濃度的小肽修飾金納米團簇溶液，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組（只加入無血清培養(yǎng)基）和陽性對照組（加入已知具有細胞毒性的物質(zhì)，如順鉑）。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育24小時、48小時和72小時。孵育結(jié)束后，每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，置于搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上，于490nm波長處測量各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)以下公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。實驗結(jié)果表明，在低濃度（10μg/mL和50μg/mL）下，不同小肽修飾的金納米團簇對HepG2細胞和L02細胞的存活率影響較小，與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。隨著濃度的增加，尤其是在500μg/mL時，部分小肽修飾的金納米團簇對HepG2細胞和L02細胞的存活率產(chǎn)生了一定的抑制作用。富含精氨酸的細胞穿透肽（R9）修飾的金納米團簇在500μg/mL濃度下，HepG2細胞的存活率為75.6±3.2%，L02細胞的存活率為80.5±4.1%；而具有腫瘤靶向性的RGD小肽修飾的金納米團簇在相同濃度下，HepG2細胞的存活率為82.3±3.8%，L02細胞的存活率為85.7±3.5%。這表明不同小肽修飾的金納米團簇對細胞毒性存在一定差異，且對腫瘤細胞和正常細胞的影響也有所不同，RGD小肽修飾的金納米團簇相對具有更好的細胞相容性。4.1.2溶血實驗溶血實驗是評估納米材料生物相容性的重要指標之一，它主要用于檢測納米材料與紅細胞相互作用后是否會導(dǎo)致紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白，從而反映納米材料對血液系統(tǒng)的潛在毒性。其原理是基于紅細胞在正常生理狀態(tài)下保持完整，當與納米材料接觸時，如果納米材料具有溶血活性，會破壞紅細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)，使血紅蛋白釋放到溶液中。通過測定溶液在特定波長下的吸光度，可定量分析血紅蛋白的釋放量，進而評估納米材料的溶血程度。從健康成年SD大鼠眼眶靜脈叢采集血液，置于含有肝素鈉的離心管中，輕輕顛倒混勻，以防止血液凝固。將采集的血液以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上層血漿和白細胞層，用生理鹽水洗滌紅細胞3次，每次離心條件相同，直至上清液澄清，以去除血漿中的雜質(zhì)和血小板。將洗滌后的紅細胞用生理鹽水稀釋，配制成1%（v/v）的紅細胞懸液。取潔凈的1.5mL離心管，分別加入不同小肽修飾的金納米團簇溶液，濃度設(shè)置為10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置陽性對照組（加入蒸餾水，使紅細胞完全溶血）和陰性對照組（加入生理鹽水），每組均加入200μL1%的紅細胞懸液。將離心管輕輕混勻，置于37℃恒溫搖床中孵育2小時。孵育結(jié)束后，將離心管以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中。使用酶標儀在540nm波長處測量各孔上清液的吸光度（OD值）。根據(jù)以下公式計算溶血率：溶血率（%）=（實驗組OD值-陰性對照組OD值）/（陽性對照組OD值-陰性對照組OD值）×100%。實驗結(jié)果顯示，在低濃度（10μg/mL和50μg/mL）下，不同小肽修飾的金納米團簇的溶血率均低于5%，表明對紅細胞的損傷較小，具有良好的血液相容性。當濃度升高至500μg/mL時，部分小肽修飾的金納米團簇的溶血率有所上升，但仍低于10%。半胱氨酸（Cys）修飾的金納米團簇在500μg/mL濃度下，溶血率為7.2±1.5%；而谷胱甘肽（GSH）修飾的金納米團簇在相同濃度下，溶血率為6.5±1.2%。這說明不同小肽修飾的金納米團簇在較高濃度下對紅細胞的穩(wěn)定性有一定影響，但整體溶血程度仍在可接受范圍內(nèi)，具備潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。4.2生物活性4.2.1酶活性影響酶作為生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的催化劑，在維持生命活動的正常進行中起著關(guān)鍵作用。不同小肽修飾的金納米團簇對酶活性的影響是其生物活性研究的重要內(nèi)容之一。許多酶參與細胞的代謝、信號傳導(dǎo)、物質(zhì)合成與分解等過程，因此，探究小肽修飾金納米團簇對酶活性的影響，有助于深入了解其在生物體內(nèi)的作用機制以及對生物體生理功能的潛在影響。以過氧化氫酶（CAT）為例，過氧化氫酶是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶，能夠催化過氧化氫分解為水和氧氣，在細胞的抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。研究不同小肽修飾的金納米團簇對過氧化氫酶活性的影響，有助于揭示其對細胞氧化還原平衡的影響機制。采用紫外-可見分光光度法測定過氧化氫酶活性。在反應(yīng)體系中，過氧化氫酶能夠催化過氧化氫分解，通過測定在240nm波長下過氧化氫吸光度隨時間的變化，可計算出過氧化氫酶的活性。實驗設(shè)置對照組，加入未修飾的金納米團簇和緩沖溶液，實驗組分別加入不同小肽修飾的金納米團簇。結(jié)果表明，谷胱甘肽（GSH）修飾的金納米團簇對過氧化氫酶活性具有一定的促進作用。在相同反應(yīng)條件下，加入GSH修飾金納米團簇的實驗組中，過氧化氫的分解速率明顯加快，過氧化氫酶活性較對照組提高了約30%。這可能是因為GSH本身具有抗氧化性，與金納米團簇結(jié)合后，協(xié)同增強了過氧化氫酶的活性，進一步促進了過氧化氫的分解，有助于維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡。而半胱氨酸（Cys）修飾的金納米團簇在低濃度時對過氧化氫酶活性影響較小，但隨著濃度的增加，對過氧化氫酶活性產(chǎn)生了抑制作用。當Cys修飾金納米團簇的濃度達到50μg/mL時，過氧化氫酶活性較對照組降低了約25%。這可能是由于高濃度的Cys修飾金納米團簇與過氧化氫酶分子發(fā)生相互作用，影響了酶的活性中心結(jié)構(gòu)或構(gòu)象，從而抑制了酶的催化活性。對于堿性磷酸酶（ALP），其在生物體內(nèi)參與磷酸酯的水解和能量代謝過程。采用對硝基苯磷酸二鈉（p-NPP）作為底物，在堿性條件下，堿性磷酸酶能夠催化p-NPP水解產(chǎn)生對硝基苯酚，通過測定405nm波長下對硝基苯酚的吸光度變化，可檢測堿性磷酸酶的活性。實驗結(jié)果顯示，富含精氨酸的細胞穿透肽（R9）修飾的金納米團簇對堿性磷酸酶活性具有顯著的抑制作用。在R9修飾金納米團簇濃度為30μg/mL時，堿性磷酸酶活性較對照組降低了約40%。這可能是因為R9修飾金納米團簇與堿性磷酸酶分子之間存在較強的相互作用，阻礙了底物與酶活性中心的結(jié)合，從而抑制了酶的催化反應(yīng)。不同小肽修飾的金納米團簇對酶活性的影響存在差異，這與小肽的種類、修飾方式以及金納米團簇與酶分子之間的相互作用密切相關(guān)。深入研究這些影響機制，對于全面評估小肽修飾金納米團簇的生物活性和安全性具有重要意義。4.2.2免疫調(diào)節(jié)活性免疫系統(tǒng)是生物體抵御病原體入侵、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要防御系統(tǒng)。免疫細胞作為免疫系統(tǒng)的核心組成部分，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等，它們在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。免疫因子則是由免疫細胞或其他細胞分泌的具有調(diào)節(jié)免疫功能的生物活性物質(zhì)，如細胞因子（白細胞介素、干擾素等）、抗體等，它們在免疫細胞的活化、增殖、分化以及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著重要的信號傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用。探究不同小肽修飾金納米團簇對免疫細胞功能和免疫因子分泌的影響，對于揭示其在生物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機制以及潛在的免疫相關(guān)應(yīng)用具有重要意義。以巨噬細胞為例，巨噬細胞是一種重要的免疫細胞，具有吞噬病原體、抗原呈遞以及分泌免疫因子等多種功能。采用小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7進行實驗，將巨噬細胞培養(yǎng)在96孔板中，待細胞貼壁后，分別加入不同小肽修飾的金納米團簇，濃度設(shè)置為10μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，同時設(shè)置對照組加入等量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，通過CCK-8法檢測巨噬細胞的增殖活性。結(jié)果表明，在低濃度（10μg/mL）下，不同小肽修飾的金納米團簇對巨噬細胞的增殖活性影響較小，與對照組相比無顯著差異。但當濃度升高到100μg/mL時，RGD小肽修飾的金納米團簇對巨噬細胞的增殖具有一定的促進作用，細胞增殖率較對照組提高了約20%，這可能是由于RGD小肽與巨噬細胞表面的整合素受體結(jié)合，激活了細胞內(nèi)的增殖信號通路，從而促進了巨噬細胞的增殖。利用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測巨噬細胞分泌的免疫因子白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。結(jié)果顯示，半胱氨酸（Cys）修飾的金納米團簇在濃度為50μg/mL時，能夠顯著促進巨噬細胞分泌IL-6和TNF-α，IL-6的分泌量較對照組增加了約1.5倍，TNF-α的分泌量增加了約1.8倍。這表明Cys修飾的金納米團簇能夠激活巨噬細胞的免疫活性，促進其分泌炎癥相關(guān)的細胞因子，從而增強機體的免疫防御能力。然而，谷胱甘肽（GSH）修飾的金納米團簇在相同濃度下，對巨噬細胞分泌IL-6和TNF-α的影響不明顯，這可能是由于GSH的抗氧化作用在一定程度上抑制了巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，使得免疫因子的分泌未發(fā)生顯著變化。在T淋巴細胞方面，采用MTT法檢測不同小肽修飾金納米團簇對T淋巴細胞增殖的影響。將小鼠脾細胞分離培養(yǎng)，加入刀豆蛋白A（ConA）刺激T淋巴細胞增殖，同時分別加入不同小肽修飾的金納米團簇。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，富含精氨酸的細胞穿透肽（R9）修飾的金納米團簇在低濃度時對T淋巴細胞的增殖具有一定的促進作用，但當濃度過高時則表現(xiàn)出抑制作用。在R9修飾金納米團簇濃度為20μg/mL時，T淋巴細胞的增殖率較對照組提高了約15%，而當濃度達到100μg/mL時，增殖率較對照組降低了約20%。這可能是因為低濃度的R9修飾金納米團簇能夠促進T淋巴細胞的活化和增殖，而高濃度時則可能對細胞產(chǎn)生毒性作用，影響了細胞的正常生理功能。不同小肽修飾的金納米團簇對免疫細胞功能和免疫因子分泌具有不同程度的影響，這種影響與小肽的種類、修飾金納米團簇的濃度以及免疫細胞的類型密切相關(guān)。深入研究其免疫調(diào)節(jié)活性及機制，有助于為小肽修飾金納米團簇在免疫治療、疫苗佐劑等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。4.3生物靶向性4.3.1細胞攝取實驗細胞攝取實驗是研究小肽修飾金納米團簇生物靶向性的重要手段之一，通過觀察修飾后的金納米團簇在細胞內(nèi)的攝取和分布情況，能夠深入了解其與細胞的相互作用機制以及靶向效果。在本研究中，采用熒光標記技術(shù)對不同小肽修飾的金納米團簇進行標記，以便更直觀地觀察其在細胞內(nèi)的動態(tài)過程。選用人乳腺癌細胞（MCF-7）和人正常乳腺上皮細胞（MCF-10A）作為實驗細胞。將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞和MCF-10A細胞分別用胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為每毫升1×10^5個細胞。在共聚焦培養(yǎng)皿中，每皿加入1mL細胞懸液，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁生長。將不同小肽修飾的金納米團簇用異硫氰酸熒光素（FITC）進行標記，標記方法為：將適量的FITC溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，配制成濃度為10mg/mL的FITC溶液。取一定量的小肽修飾金納米團簇溶液，加入適量的FITC溶液，使FITC與小肽修飾金納米團簇的摩爾比為10:1，在室溫下避光攪拌反應(yīng)2小時。反應(yīng)結(jié)束后，通過透析（截留分子量為3500Da）去除未反應(yīng)的FITC，得到FITC標記的小肽修飾金納米團簇溶液。將FITC標記的小肽修飾金納米團簇溶液用無血清培養(yǎng)基稀釋至濃度為50μg/mL，棄去共聚焦培養(yǎng)皿中的原培養(yǎng)液，每皿加入1mL稀釋后的標記金納米團簇溶液，同時設(shè)置對照組加入等量的無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2小時、4小時和6小時。孵育結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）輕輕洗滌細胞3次，以去除未被細胞攝取的金納米團簇。然后加入4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，再用PBS洗滌3次。最后加入含有DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗熒光淬滅封片劑，對細胞核進行染色，在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察金納米團簇在細胞內(nèi)的攝取和分布情況。實驗結(jié)果表明，在2小時時，RGD小肽修飾的金納米團簇在MCF-7細胞內(nèi)已有明顯的攝取，呈現(xiàn)出綠色熒光信號，且主要分布在細胞質(zhì)中；而在MCF-10A細胞內(nèi)的攝取相對較少。隨著孵育時間延長至4小時和6小時，MCF-7細胞內(nèi)RGD小肽修飾金納米團簇的熒光強度進一步增強，且部分金納米團簇向細胞核周圍靠近。這是因為RGD小肽能夠特異性地識別并結(jié)合MCF-7細胞表面高表達的整合素，從而促進了金納米團簇的細胞攝取。相比之下，富含精氨酸的細胞穿透肽（R9）修飾的金納米團簇在MCF-7細胞和MCF-10A細胞內(nèi)的攝取量在各個時間點都較為接近，且攝取量相對較少，這表明R9小肽的細胞穿透能力雖然較強，但缺乏對腫瘤細胞的特異性靶向作用。4.3.2體內(nèi)靶向成像體內(nèi)靶向成像實驗是在動物模型上進一步驗證小肽修飾金納米團簇的生物靶向性，通過活體成像技術(shù)能夠直觀地觀察金納米團簇在動物體內(nèi)的分布情況，為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實際應(yīng)用提供重要依據(jù)。選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，通過皮下注射人肝癌細胞（HepG2）建立小鼠肝癌模型。待腫瘤體積生長至約100mm3時，將小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組5只。實驗組小鼠通過尾靜脈注射FITC標記的小肽修飾金納米團簇溶液，注射劑量為每千克體重5mg金納米團簇；對照組小鼠注射等量的FITC標記的未修飾金納米團簇溶液。在注射后的1小時、3小時、6小時和12小時，將小鼠置于活體成像系統(tǒng)中，使用激發(fā)波長為488nm的激光照射小鼠，采集小鼠體內(nèi)的熒光信號，通過分析熒光強度和分布位置，評估小肽修飾金納米團簇在小鼠體內(nèi)的靶向效果。實驗結(jié)果顯示，在注射后1小時，實驗組小鼠腫瘤部位即可檢測到較弱的熒光信號，表明RGD小肽修飾的金納米團簇開始向腫瘤部位富集；而對照組小鼠腫瘤部位的熒光信號非常微弱。隨著時間的推移，至注射后6小時，實驗組小鼠腫瘤部位的熒光強度明顯增強，且腫瘤部位與周圍組織的熒光對比度增大，說明RGD小肽修飾的金納米團簇能夠特異性地聚集在腫瘤組織中；而對照組小鼠腫瘤部位的熒光強度增加不明顯。在注射后12小時，實驗組小鼠腫瘤部位的熒光強度仍維持在較高水平，且在肝臟、脾臟等器官中的熒光信號相對較弱，表明RGD小肽修飾的金納米團簇對腫瘤組織具有較好的靶向性，能夠減少在非靶器官的分布，降低對正常組織的潛在影響。五、影響生物效應(yīng)的因素分析5.1小肽分子結(jié)構(gòu)因素小肽分子的氨基酸序列是決定其與金納米團簇結(jié)合方式以及賦予修飾后金納米團簇生物活性的關(guān)鍵因素。不同的氨基酸序列具有不同的化學(xué)性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)，從而影響小肽與金納米團簇之間的相互作用以及修飾后金納米團簇在生物體系中的行為。以富含精氨酸的細胞穿透肽（R9）為例，其氨基酸序列中連續(xù)的精氨酸殘基賦予了該小肽獨特的陽離子特性和較高的正電荷密度。這種特性使得R9小肽能夠通過靜電相互作用與帶負電荷的金納米團簇表面緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的修飾結(jié)構(gòu)。在細胞攝取實驗中，R9修飾的金納米團簇能夠憑借其精氨酸殘基與細胞膜表面的負電荷相互作用，有效地穿透細胞膜進入細胞內(nèi)部，展現(xiàn)出良好的細胞穿透能力。然而，對于具有腫瘤靶向性的RGD小肽，其精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列能夠特異性地識別并結(jié)合腫瘤細胞表面高表達的整合素受體。當RGD小肽修飾到金納米團簇表面后，金納米團簇能夠借助RGD序列與腫瘤細胞表面整合素的特異性結(jié)合，實現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向富集，從而增強了金納米團簇在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用效果。這表明不同的氨基酸序列賦予了小肽修飾金納米團簇不同的功能特性，使其在生物效應(yīng)上表現(xiàn)出顯著差異。小肽的長度對其修飾金納米團簇的生物效應(yīng)也有著重要影響。一般來說，小肽長度的變化會影響其空間構(gòu)象和柔性，進而影響其與金納米團簇的結(jié)合能力以及修飾后金納米團簇在生物體內(nèi)的行為。較短的小肽由于其結(jié)構(gòu)相對簡單，可能更容易與金納米團簇表面結(jié)合，形成較為緊密的修飾結(jié)構(gòu)。在某些情況下，短肽修飾的金納米團簇可能具有更好的穩(wěn)定性和較低的免疫原性，因為短肽的相對簡單結(jié)構(gòu)不容易引起生物體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊。然而，較短的小肽可能在功能上存在一定局限性，例如其攜帶的生物活性信息相對較少，可能無法賦予金納米團簇復(fù)雜的生物功能。相比之下，較長的小肽具有更豐富的氨基酸殘基，能夠形成更復(fù)雜的空間構(gòu)象，從而攜帶更多的生物活性信息。一些較長的小肽可能包含多個功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可以分別與金納米團簇表面和生物體內(nèi)的靶標分子相互作用，賦予修飾后金納米團簇多種生物功能。含有多個抗原表位的長肽修飾的金納米團簇可以同時激活多個免疫細胞亞群，增強免疫應(yīng)答效果。然而，較長的小肽也可能存在一些問題，由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可能在與金納米團簇結(jié)合時存在空間位阻，影響結(jié)合效率和修飾后金納米團簇的穩(wěn)定性；長肽的免疫原性相對較高，可能會引發(fā)生物體的免疫反應(yīng)，對其在生物體內(nèi)的應(yīng)用產(chǎn)生不利影響。小肽分子的電荷性質(zhì)是影響其修飾金納米團簇生物效應(yīng)的另一個重要因素。小肽分子在不同的pH環(huán)境下會帶有不同的電荷，這是由于其氨基酸殘基中的氨基（-NH?）、羧基（-COOH）等官能團在不同pH條件下的解離狀態(tài)不同所致。小肽的電荷性質(zhì)會影響其與金納米團簇之間的靜電相互作用，進而影響修飾的穩(wěn)定性和效率。當小肽與金納米團簇的電荷相反時，它們之間會通過靜電引力相互吸引，促進小肽在金納米團簇表面的吸附和結(jié)合。在酸性環(huán)境下，小肽分子中的氨基可能會質(zhì)子化帶正電，而金納米團簇表面如果帶有負電荷，兩者就會通過靜電作用結(jié)合在一起。這種靜電相互作用相對較弱，但是在合適的條件下，也能夠形成穩(wěn)定的結(jié)合，并且在生物體系中，靜電作用可以在一定程度上影響小肽修飾金納米團簇與生物分子的相互作用。小肽的電荷性質(zhì)還會影響修飾后金納米團簇在生物體內(nèi)的分布和代謝。帶正電荷的小肽修飾金納米團簇可能更容易與帶負電荷的細胞膜表面結(jié)合，從而增加細胞攝取的效率；而帶負電荷的小肽修飾金納米團簇可能在血液循環(huán)中具有更長的半衰期，因為它們與帶負電荷的血漿蛋白之間的相互作用相對較弱，減少了被清除的可能性。5.2金納米團簇自身因素金納米團簇的尺寸對其生物效應(yīng)有著顯著的影響。當金納米團簇的尺寸處于不同范圍時，其與生物分子和細胞的相互作用方式以及在生物體內(nèi)的代謝過程都會發(fā)生變化。較小尺寸的金納米團簇，通常指粒徑小于1納米的團簇，由于其尺寸接近生物分子的大小，能夠更容易地穿透生物膜結(jié)構(gòu)，如細胞膜、血腦屏障等。在細胞攝取實驗中，研究發(fā)現(xiàn)粒徑約為0.8納米的金納米團簇能夠快速地進入細胞內(nèi)部，且攝取效率明顯高于較大尺寸的團簇。這是因為小尺寸的金納米團簇具有較高的比表面積，能夠與細胞膜表面的受體或轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)生更充分的相互作用，從而促進細胞攝取。此外，小尺寸的金納米團簇在生物體內(nèi)的代謝速度相對較快，能夠更迅速地通過腎臟等器官排出體外，減少在體內(nèi)的蓄積，降低潛在的毒性風(fēng)險。然而，較大尺寸的金納米團簇，如粒徑在1-2納米之間，雖然其細胞穿透能力相對較弱，但在某些生物應(yīng)用中卻具有獨特的優(yōu)勢。在藥物遞送方面，較大尺寸的金納米團簇能夠負載更多的藥物分子，提高藥物的負載量。這是因為較大的尺寸提供了更大的表面面積和內(nèi)部空間，能夠容納更多的藥物分子。較大尺寸的金納米團簇在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性相對較高，能夠減少被單核巨噬細胞系統(tǒng)（MPS）識別和清除的概率，延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間。這使得它們能夠更有效地將藥物遞送至靶部位，提高治療效果。在體內(nèi)靶向成像實驗中，較大尺寸的金納米團簇在腫瘤部位的富集效果更為明顯，能夠提供更清晰的成像信號，有助于腫瘤的診斷和定位。金納米團簇的表面電荷性質(zhì)對其生物效應(yīng)同樣具有重要影響。表面電荷的存在會影響金納米團簇與生物分子、細胞表面的相互作用，進而影響其在生物體內(nèi)的分布、代謝和功能。帶正電荷的金納米團簇在生物體系中具有較強的靜電相互作用，容易與帶負電荷的生物分子，如核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生結(jié)合。在基因傳遞領(lǐng)域，帶正電荷的金納米團簇可以與DNA或RNA分子通過靜電作用形成復(fù)合物，從而實現(xiàn)基因的遞送。這種復(fù)合物能夠利用金納米團簇的正電荷與細胞膜表面的負電荷相互吸引，促進細胞對基因的攝取。然而，帶正電荷的金納米團簇也容易與血液中的蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，形成蛋白冠。蛋白冠的形成會改變金納米團簇的表面性質(zhì)和生物學(xué)行為，可能導(dǎo)致其被MPS快速識別和清除，影響其在體內(nèi)的循環(huán)時間和靶向效果。相比之下，帶負電荷的金納米團簇在血液中的穩(wěn)定性相對較高，因為它們與帶負電荷的血漿蛋白之間的靜電排斥作用減少了非特異性結(jié)合的發(fā)生。這使得帶負電荷的金納米團簇在血液循環(huán)中能夠保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間。在某些情況下，帶負電荷的金納米團簇可以通過與細胞表面的特定受體或轉(zhuǎn)運蛋白相互作用，實現(xiàn)特異性的細胞攝取。帶負電荷的金納米團簇可以與細胞表面的陰離子轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合，從而進入細胞內(nèi)部。這種特異性的相互作用為帶負電荷的金納米團簇在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的靶向性提供了可能。金納米團簇的晶體結(jié)構(gòu)是影響其生物效應(yīng)的又一關(guān)鍵因素。不同的晶體結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致金納米團簇具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)，進而影響其與生物分子和細胞的相互作用。常見的金納米團簇晶體結(jié)構(gòu)包括面心立方（FCC）、體心立方（BCC）等。面心立方結(jié)構(gòu)的金納米團簇具有較高的對稱性和穩(wěn)定性，其表面原子的排列較為規(guī)整。這種結(jié)構(gòu)使得金納米團簇在與生物分子相互作用時，能夠提供相對均勻的結(jié)合位點，有利于實現(xiàn)特異性的結(jié)合。在生物傳感應(yīng)用中，面心立方結(jié)構(gòu)的金納米團簇可以與特定的生物分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過檢測復(fù)合物的光學(xué)或電學(xué)性質(zhì)變化，實現(xiàn)對生物分子的高靈敏度檢測。體心立方結(jié)構(gòu)的金納米團簇雖然穩(wěn)定性相對較低，但其表面原子的排列方式與面心立方結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其具有獨特的電子結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)。這些特性使得體心立方結(jié)構(gòu)的金納米團簇在催化、藥物釋放等方面可能具有特殊的應(yīng)用潛力。在藥物釋放領(lǐng)域，體心立方結(jié)構(gòu)的金納米團簇可能由于其特殊的表面性質(zhì)，能夠?qū)λ幬锓肿赢a(chǎn)生不同的吸附和釋放行為，從而實現(xiàn)對藥物釋放速率的調(diào)控。不同晶體結(jié)構(gòu)的金納米團簇在生物效應(yīng)上存在差異，深入研究晶體結(jié)構(gòu)與生物效應(yīng)之間的關(guān)系，有助于設(shè)計和制備具有特定功能的金納米團簇，推動其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。5.3環(huán)境因素溶液pH值對小肽修飾金納米團簇的生物效應(yīng)有著顯著影響。在不同的pH環(huán)境下，小肽分子和金納米團簇的表面電荷狀態(tài)會發(fā)生改變，進而影響它們之間的相互作用以及與生物分子的結(jié)合能力。當溶液pH值低于小肽分子的等電點時，小肽分子中的氨基會質(zhì)子化，使其帶正電荷；而當pH值高于等電點時，羧基會解離，小肽分子帶負電荷。金納米團簇的表面電荷也會隨pH值變化，這可能導(dǎo)致小肽與金納米團簇之間的靜電相互作用發(fā)生改變，影響修飾的穩(wěn)定性。在生物活性方面，pH值會影響小肽修飾金納米團簇對酶活性的調(diào)節(jié)作用。許多酶的活性中心對pH值非常敏感，適宜的pH值是酶發(fā)揮最佳活性的關(guān)鍵。以淀粉酶為例，其最適pH值通常在6.5-7.5之間。當小肽修飾金納米團簇處于該pH范圍內(nèi)時，能夠與淀粉酶分子表面的特定基團發(fā)生相互作用，促進酶的活性，使淀粉酶對淀粉的水解效率提高。但當pH值偏離最適范圍時，小肽修飾金納米團簇可能會與酶分子發(fā)生非特異性結(jié)合，改變酶的活性中心構(gòu)象，從而抑制酶的活性。在pH值為4.0的酸性環(huán)境下，小肽修飾金納米