膠原蛋白凝膠-眼刺激性試驗起草說明

膠原蛋白凝膠-眼刺激性試驗起草說明為加強化妝品的監(jiān)督管理，進一步提高化妝品使用安全性，中國食品藥品檢定研究院組織開展了膠原蛋白凝膠-眼刺激性試驗方法的研究制定工作。現(xiàn)就工作有關(guān)情況說明如下：一、起草原則本方法的編制本著客觀、易行、針對性強等原則，采用目前各化妝品檢驗檢測實驗室已具備的試驗條件、技術(shù)能力，保證方法科學(xué)規(guī)范的同時，兼具和國際標準的接軌性、先進性，以及可操作性、便捷性。二、起草過程本方法于2021年立項，起草過程包括：擬定研究內(nèi)容；建立膠原蛋白凝膠-眼刺激性試驗方法并確認試驗條件；開展實驗室間比對；與我國現(xiàn)行的試驗方法比較分析；形成方法草案并通過標委會結(jié)題驗收；根據(jù)標委會專家意見，修改完善技術(shù)方法，起草征求意見稿。三、與國內(nèi)有關(guān)現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性國家標準的關(guān)系目前，我國檢測化妝品眼睛刺激性/腐蝕性的主要依據(jù)為《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中的家兔急性眼刺激性/腐蝕性試驗、體外兔角膜上皮細胞短時暴露試驗和熒光素滲漏試驗。隨著3R理念的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進步，越來越多的替代方法被應(yīng)用到化妝品毒性的預(yù)測中。我國正在努力推進化妝品安全評價中替代方法的研究、驗證和技術(shù)轉(zhuǎn)化工作，并形成合適的整合評價策略。本研究的主要內(nèi)容是建立眼刺激性體外替代試驗方法，尤其適用于眼刺激試驗整合評價策略中“自下而上”方法的起始方法。本方法與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》內(nèi)容不沖突，技術(shù)方法上形成互補，以期與有關(guān)國際條約盡快接軌，為推進我國體外試驗工作的開展，建立我國自己的動物體外替代方法體系，促進我國未來的化妝品貿(mào)易提供技術(shù)支持與保證。四、與國際同類標準的關(guān)系2019年經(jīng)濟合作和發(fā)展組織（OECD）正式發(fā)布膠原蛋白凝膠-眼刺激性試驗操作指南，將其用于判定眼刺激性試驗中無刺激性或輕微刺激性的化學(xué)物質(zhì)，之后于2021年修訂該方法的操作指南，現(xiàn)行的指南標準為2021年版。本方法涵蓋了OECD2021年正式發(fā)布“膠原蛋白凝膠-眼刺激性試驗操作指南”的要求，而且結(jié)合我國實驗室特點，對實驗操作中的重要質(zhì)量控制條件進行了確認和優(yōu)化。本方法草案體現(xiàn)眼刺激性體外試驗的試驗思路，貼近國內(nèi)實驗室實際情況，更具可操作性。五、實驗室驗證情況概述對OECDGuidelinesforTestingofChemicals（No.494，2021）（OECD《化學(xué)品測試指南》494號，2021年）中的各項技術(shù)內(nèi)容進行驗證，包括細胞株、培養(yǎng)基、模型構(gòu)建、受試物配制、對照設(shè)置、實驗操作、公式和結(jié)果計算與判定等。在此基礎(chǔ)上，本標準還結(jié)合我國實驗室檢測的特點，對實驗操作中的某些條款進行了確認和優(yōu)化。在方法轉(zhuǎn)化過程中，參考OECD指南及文獻數(shù)據(jù)庫選擇10種參考物質(zhì)進行了實驗室內(nèi)方法建立，檢測結(jié)果與OECD數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致。2024年1-9月，分別邀請A、B、C3家不同實驗室參與了實驗室間比對工作。對于陽性物質(zhì)，3家實驗室的檢測結(jié)果均一致，與OECD的參考數(shù)據(jù)吻合。對于陰性物質(zhì)，三家單位對t1判定出現(xiàn)了不同的理解，綜合考慮后，我們認為個別非連續(xù)點出現(xiàn)dP/dt＜0.03%/s的情況是由該試驗本身性質(zhì)決定的，此時間不應(yīng)取為t1。按照OECD指南，陰性樣品的判定標準為t1＞180s且強度＜0.05%/s且坪值≤5.0%。實際上，當t1＞180s時，則不存在t2、P1和P2，強度和坪值無法計算。當t1＞180s時，可知TEER的最大變化值小于5.4%（180s×0.03%/s=5.4%）。在多次重復(fù)陰性樣品時，出現(xiàn)了t1=110s，強度=0.029%，坪值=0.13的案例，提醒我們該試驗的靈敏性。我們建議陰性結(jié)果的判定標準為t1＞180s或強度＜0.05%/s且坪值≤5.0%。按照這個判定標準，三家實驗室的檢測結(jié)果均一致，表明本方法在我國實驗室建立是可行的。六、其他需要說明的問題1.本方法的條件確認本方法適用于化妝品原料進行體外眼刺激性測試，測試結(jié)果的靈敏性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，可有效替代動物實驗，作為整合評價策略中“自下而上”的起始方法。2.本方法的可行性分析本方法的檢測終點為跨膜電阻，反應(yīng)角膜上皮屏障的損壞，相比于其他替代方法中的細胞活性和濁度等檢測終點，上皮屏障更能反應(yīng)眼損傷的早期變化。本方法操作簡便，所需的相關(guān)技術(shù)、人員、設(shè)備等條件易達到。我國開展化妝品注冊備案檢驗檢測的機構(gòu)均具有建立本方法開展檢驗檢測的條件和能力。本方法的模型構(gòu)建和測試結(jié)果與OECD結(jié)果基本一致，表明本方法在我國實驗室建立是可行的，建議有條件的實驗室盡快開展該項試驗。3.參考化學(xué)物質(zhì)附件：參考化學(xué)物質(zhì)目錄

附件參考化學(xué)物質(zhì)目錄參照OECDTG494，選擇10種已知眼刺激性的化妝品原料作為受試物，10種受試物包括了家兔眼刺激性試驗為不可逆眼損傷（UNGHS1類）、可逆眼損傷輕刺激性（UNGHS2A類）、可逆眼損傷刺激性（UNGHS2B類）和無刺激性（UNGHS未分類）四類；其中5個受試物為液體，5個受試物為固體；受試物涵蓋了硅化合物、丙烯酸酯、有機鹽、醇、腈類化合物、鹵化物、硫化物、芳香化合物、二胺和砜類化合物。其名單見表1。表1本研究選用的10種受試化妝品原料CAS類別形態(tài)家兔眼刺激試驗為不可逆眼損傷（UNGHS1類）N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷1760-24-3硅化合物液體四甘醇二丙烯酸酯17831-71-9丙烯酸酯液體水楊酸鈉54-21-7有機鹽固體家兔眼刺激為可逆眼損傷輕刺激性（UNGHS2A類）環(huán)戊醇96-41-3醇液體氰乙酸甲酯105-34-0腈類化合物固體家兔眼刺激為可逆眼損傷刺激性（UNGHS2B類）2