T-WJWCHCA 001-2024 基于多重PCR 的呼吸道感染病原體靶向二代測序檢測技術(shù)規(guī)范

ICS11.020CCSC50/WJWCHCATechnicalspecificationfortargetednext-generationsequencingdetectionofrespiratoryinfectionpathogensbasedonmultiplexPCRIT/WJWCHCA001—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 25技術(shù)應(yīng)用 36實驗原理 67實驗室分區(qū)、儀器設(shè)備及試劑 68性能驗證或性能確認(rèn) 79分析前 910分析中 1011分析后 1112質(zhì)量控制 附錄A（資料性）呼吸道感染病原體靶向二代測序申請單模板 14附錄B（資料性）呼吸道感染病原體靶向二代測序檢測報告模板 15參考文獻 T/WJWCHCA001—2024本標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中國醫(yī)藥衛(wèi)生文化協(xié)會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗集團股份有限公司、北京友誼醫(yī)院、中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院、長沙金域醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司、武漢兒童醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司、廣州國家實驗室、廣東省呼吸與健康學(xué)會。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：余艷、趙曉濤、胡敏、李培、陸小霞、胡鵬、張磊、姚欣、關(guān)文達、李慧源、梁萍、馬常鈞。T/WJWCHCA001—2024隨著新發(fā)和再發(fā)病原體的不斷涌現(xiàn)、耐藥性問題日益嚴(yán)重以及免疫功能低下人群的增加，感染性疾病仍是威脅人類健康的主要疾病之一。其中，呼吸道感染是臨床上最常見的感染性疾病，可分為上呼吸道感染和下呼吸道感染。病原學(xué)的快速檢測和準(zhǔn)確診斷是感染性疾病有效治療的重要前提。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測手段主要包括顯微鏡檢查、培養(yǎng)、血清學(xué)試驗、傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法（如PCR）等，但這些方法存在諸多局限性。近年來，分子診斷技術(shù)，特別是二代測序（next-generationsequencing，NGS）技術(shù)的迅猛發(fā)展，極大推動了感染性疾病的精準(zhǔn)診治。靶向二代測序（targetednext-generationsequencing，tNGS）是一種基于多重PCR特異擴增或探針捕獲等方法富集后，檢測標(biāo)本中特定靶標(biāo)核酸的技術(shù)。在病原學(xué)檢測領(lǐng)域，tNGS技術(shù)能夠一次性檢測標(biāo)本中特定的幾十至幾千上萬種特定病原體及其毒力基因和/或耐藥基因。與直接從臨床標(biāo)本中提取核酸進行測序分析、一次性覆蓋檢測病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等多種病原體的宏基因組二代測序（metagenomicnext-generationsequencing，mNGS）相比，tNGS具有靈敏度受宿主核酸影響較小、性價比高等特點。目前，市場上已有眾多醫(yī)療機構(gòu)提供病原體tNGS檢測服務(wù)，不同機構(gòu)的術(shù)語定義、檢測流程和檢測性能等均存在差異，給報告單解讀和臨床應(yīng)用帶來了不小的挑戰(zhàn)。目前尚未有相關(guān)的政策或標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范檢測流程，因此迫切需要制訂規(guī)范的技術(shù)要求及標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此，國內(nèi)多位具有豐富臨床、檢驗和產(chǎn)業(yè)經(jīng)驗的專家學(xué)者共同參與，參考國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、指南與專家共識，結(jié)合tNGS檢測技術(shù)特點，就病原體tNGS技術(shù)要求和操作規(guī)范達成共識，指導(dǎo)和規(guī)范tNGS在呼吸道感染病原體檢測中的應(yīng)用。1T/WJWCHCA001—2024基于多重PCR的呼吸道感染病原體靶向二代測序檢測技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了采用基于多重PCR的靶向二代測序技術(shù)進行呼吸道臨床標(biāo)本病原體檢測（包括分析前、分析中和分析后）的方法和程序，以及性能驗證或性能確認(rèn)和質(zhì)量控制等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于采用基于多重PCR的靶向二代測序技術(shù)進行呼吸道臨床標(biāo)本病原體檢測的醫(yī)療機構(gòu)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T22576.1醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的要求第1部分：通用要求GB/T29791.1體外診斷醫(yī)療器械制造商提供的信息(標(biāo)示)第1部分:術(shù)語、定義和通用要求GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T39367.1體外診斷檢驗系統(tǒng)病原微生物檢測和鑒定用核酸定性體外檢驗程序第1部分：通用要求、術(shù)語和定義WS/T640臨床微生物學(xué)檢驗樣本標(biāo)本的采集和轉(zhuǎn)運WS/T805臨床微生物檢驗基本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)3術(shù)語和定義GB/T29791.1—2013、GB/T39367.1—2020界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1呼吸道感染respiratoryinfection由病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體等病原體引起的呼吸道的感染。注：可分為上呼吸道感染與下呼吸道感染。上呼吸道感染指累及鼻腔、咽/喉部等的感染，多由病毒引起；下呼吸3.2病原體pathogens能引起人或動物感染疾病的微生物。[來源：SN/T2028-2015，6.7，有修改]3.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction；PCR體外擴增DNA的酶促反應(yīng)過程。[來源：GB/T39367.1—2020，3.41]3.4多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)multiplexpolymerasechainreaction使用多對引物進行的PCR反應(yīng)。[來源：GB/T39367.1—2020，3.28]3.5二代測序next-generationsequencing；NGS又稱高通量測序（high-throughputsequencing），能夠一次并行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術(shù)，通常一次性產(chǎn)生數(shù)千條至數(shù)百萬條測序片段。[來源：GB/T30989—2014，3.19，有修改]2T/WJWCHCA001—20243.6宏基因組二代測序metagenomicnext-generationsequencing；mNGS利用二代測序（本標(biāo)準(zhǔn)第3.5條）技術(shù)無預(yù)設(shè)地、不依賴于培養(yǎng)地，直接針對臨床標(biāo)本中提取的所有核酸進行無偏性測序和生信分析，一次性覆蓋檢測病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體等多種病原體的測序技術(shù)。[來源：ISO/TS24420-2023，3.23，有修改]3.7靶向二代測序targetednext-generationsequencing；tNGS一種通過多重PCR（本標(biāo)準(zhǔn)第3.4條）特異擴增或探針捕獲等方法富集靶標(biāo)核酸，再進行二代測序（本標(biāo)準(zhǔn)第3.5條）、生物信息學(xué)分析和結(jié)果解讀，檢測標(biāo)本中特定靶標(biāo)核酸的技術(shù)。3.8測序文庫sequencinglibrary連有相應(yīng)接頭的，且長度和接頭序列都適于測序儀進行處理的一系列DNA片段。3.9堿基識別質(zhì)量qualityofbasecalling評價堿基準(zhǔn)確識別的概率，簡稱為Q，通常以數(shù)值表示，定義：Q=－10lgP。注1：堿基識別質(zhì)量值與堿基識別錯誤率負(fù)相關(guān)，二者注2：堿基識別質(zhì)量值越高，錯誤率越低。如Q20指測序錯誤率為1Q30指測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質(zhì)量值為30的[來源：GB/T30989—2014，3.29，有修改]3.10序列數(shù)reads匹配到該病原體（本標(biāo)準(zhǔn)第3.2條）基因組的序列數(shù)目。注：其多少與標(biāo)本中病原體本身載量負(fù)荷、微生物基因組規(guī)模、核酸3.11引物primer在DNA復(fù)制過程中，結(jié)合于模板鏈上并作為復(fù)制延伸的起始位點和/或終止位點的，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。[來源：GB/T30989—2014，3.11]3.12由目標(biāo)擴增反應(yīng)產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物。[來源：GB/T39367.1—2020，3.1]3.13內(nèi)參internalcontrol分為外源性內(nèi)參和內(nèi)源性內(nèi)參。外源性內(nèi)參指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列非人源基因分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或標(biāo)本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因；內(nèi)源性內(nèi)參指在標(biāo)本中固有的人細(xì)胞中的管家基因，其目的是監(jiān)測采樣過程以及檢測的全流程。[來源：YY/T1182—2010，3.14，有修改]4縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)（按照字母順序列出）。BALF：支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid）CRAB：耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（carbapenemresistantAcinetobacterbaumannii）CRE：耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌（carbapenemresistantEnterobacterales）CRPA：耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（carbapenemresistantPseudomonasaeruginosa）3T/WJWCHCA001—2024cDNA：互補脫氧核糖核酸（complementaryDNA）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DTT：二硫蘇糖醇（dithiothreitol）MRSA：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcusaureus）mNGS：宏基因組二代測序（metagenomicnext-generationsequencing）NGS：二代測序（next-generationsequencing）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）tNGS：靶向二代測序（targetednext-generationsequencing）5技術(shù)應(yīng)用5.1應(yīng)用場景傳統(tǒng)病原學(xué)檢測、tNGS、mNGS在呼吸道感染中的應(yīng)用不同，具體應(yīng)用場景詳見圖1。5.1.1傳統(tǒng)病原學(xué)檢測常見病原體引起的非重癥感染宜送檢傳統(tǒng)病原學(xué)檢測（如培養(yǎng)、鏡檢、PCR、血清學(xué)檢測）。5.1.2tNGS以下應(yīng)用場景宜送檢tNGS檢測（同時做傳統(tǒng)病原學(xué)檢測）：a)常見病原體引起的危急重癥；b)非重癥患者傳統(tǒng)病原學(xué)檢測陰性或者抗感染治療療效不佳（病情無明顯緩解、完全無緩解或者病情惡化）；c)呼吸道常見病原體混合感染；d)特定病原體產(chǎn)生耐藥時（耐藥/毒力基因在tNGS檢測范圍內(nèi)），如肺炎支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等。5.1.3mNGS以下應(yīng)用場景宜送檢mNGS檢測（同時做傳統(tǒng)病原學(xué)檢測）：a)危急重癥感染；b)疑難罕見感染；c)聚集性呼吸道傳播性感染；d)新發(fā)突發(fā)傳染?。籩)臨床排除感染。4T/WJWCHCA001—2024圖1呼吸道感染tNGS檢測應(yīng)用場景5.2檢測范圍5.2.1上呼吸道感染tNGS檢測宜納入的病原體和耐藥基因上呼吸道感染tNGS檢測宜納入的病原體和耐藥基因見表1。表1上呼吸道感染tNGS檢測宜納入的病原體和耐藥基因肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌、百日咳鮑特注1：上、下呼吸道標(biāo)本均適用于肺炎支原體、肺炎衣原體的核酸擴增檢測，但下呼吸道標(biāo)本的結(jié)果相對更具病原注2：上呼吸道標(biāo)本通常不適用于細(xì)菌核酸擴增檢測，本表給出的細(xì)菌類型已結(jié)合文獻報道進行了嚴(yán)格篩選（如百日咳鮑特菌主要感染鼻咽部，因此鼻咽拭子適宜用于百日咳核酸擴增檢測）。考慮到分子檢測無法判斷定植與感染，檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀、影像學(xué)注4：本表中的病原體參考了國內(nèi)外專家共識及最新的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，考慮到臨床醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的不斷發(fā)展以及疾病譜和病原譜可能發(fā)生變化，宜根據(jù)實5.2.2下呼吸道感染tNGS檢測宜納入的病原體和耐藥基因5T/WJWCHCA001—2024下呼吸道感染tNGS檢測宜納入的病原體和耐藥基因見表2。表2下呼吸道感染tNGS檢測宜納入的病原體和耐藥基因肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌、胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、陰溝腸桿菌、念珠菌屬、曲霉屬、毛霉屬、根霉屬、新型隱球菌、耶氏肺孢子菌耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌（CRE）、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（CRAB）和注2：抗菌藥物的不合理使用引發(fā)的細(xì)菌耐藥性已成為威脅人類健康的主要問題之一。為了有效避免抗菌藥物不合理使用和遏制細(xì)菌耐藥性的擴散，關(guān)鍵在于對感染性疾病病原體的早期、快速和精準(zhǔn)診斷。tNGS檢測能夠?qū)崿F(xiàn)耐藥基因的早期、快速鑒定，然而，耐藥基因與耐藥表型之間的關(guān)聯(lián)性仍需進一步深入乏足夠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來支持tNGS檢測耐藥基因能夠直接影響臨床用藥決策。因此，本表給出的耐藥基因檢注3：本表中的病原體參考了國內(nèi)外專家共識及最新的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，考慮到疾病譜和病原譜可能發(fā)生相應(yīng)的變化，應(yīng)根據(jù)實5.3標(biāo)本選擇5.3.1基本要求選擇標(biāo)本應(yīng)考慮患者癥狀、患者免疫狀態(tài)、疾病嚴(yán)重程度、有創(chuàng)檢查的風(fēng)險、流行病學(xué)特點、可疑病原體的特性、播散能力以及受累器官和感染部位等多方面因素。5.3.2上呼吸道感染上呼吸道感染tNGS檢測可采集標(biāo)本包括口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽吸取物等。注1：一般情況下，不單獨采用口咽拭子標(biāo)本診斷上呼吸道感染，宜與鼻咽拭子或鼻咽吸取物聯(lián)合檢驗，以提高呼注2：采集鼻咽吸取物時，將無菌吸痰管與無菌收集器相連，再將吸痰管送入患兒鼻咽部至產(chǎn)生抵抗，稍回抽，利5.3.3下呼吸道感染下呼吸道感染tNGS檢測可采集標(biāo)本包括支氣管肺泡灌洗液（BALF）、痰液、氣管吸取物、下呼吸道組織等。注1：相較于痰標(biāo)本具有黏稠、不均勻以及易被口咽部定植菌影響的短板，BALF更適合作為下呼吸道感染的檢測標(biāo)本。收集BALF需進行有創(chuàng)的纖維支氣管鏡檢查，應(yīng)注2：咳痰、誘導(dǎo)痰或經(jīng)上呼吸道吸痰標(biāo)本可作為下呼吸道感染檢測的一種替代標(biāo)本，但痰液質(zhì)量應(yīng)合格，合格的痰液標(biāo)本應(yīng)是來自下呼吸道，不混入唾液、鼻咽分泌物、食物、漱口水等。有條件的實驗室應(yīng)進行顯微鏡下檢查：合格痰標(biāo)本應(yīng)鱗狀上皮細(xì)胞＜10個/低倍視野，白細(xì)胞＞25個/低倍視野，或白細(xì)胞：鱗狀上皮細(xì)胞＞5.3.4采樣耗材采樣耗材要求如下：6T/WJWCHCA001—2024a)標(biāo)本采集容器應(yīng)首選經(jīng)國家行政部門批準(zhǔn)的商業(yè)化采樣管。采樣管應(yīng)使用帶有螺旋蓋的無菌包裝、耐低溫、耐伽馬射線輻照、不易碎裂的醫(yī)療級聚丙烯等塑料容器。采集深咳痰液時宜使用寬口容器；b)標(biāo)本保存液應(yīng)首選經(jīng)國家行政部門批準(zhǔn)的商業(yè)化病毒標(biāo)本保存液，因標(biāo)本用于核酸檢測以及其他分子生物學(xué)檢測和研究，可選擇含核酸保護劑的標(biāo)本保存液；c)采樣拭子應(yīng)使用商品化無菌拭子，拭子頭材質(zhì)為合成纖維，不宜使用醫(yī)用棉簽等天然棉纖維拭子，以免干擾后續(xù)檢測結(jié)果。拭子桿應(yīng)光滑無毛刺，桿上設(shè)有斷點，全桿長度15cm±1cm。拭子應(yīng)經(jīng)無菌處理，且無滅菌成分殘留。采樣時應(yīng)選用對應(yīng)的鼻咽拭子或口咽拭子，以免對采樣部位造成損傷。6實驗原理tNGS檢測技術(shù)流程包括標(biāo)本處理、核酸提取、文庫構(gòu)建、二代測序、生物信息分析、結(jié)果解讀等。必要時標(biāo)本應(yīng)經(jīng)過均質(zhì)化、破壁等處理裂解細(xì)胞以促進釋放核酸，通過純化步驟使核酸與裂解體系中的其他成分（如蛋白質(zhì)、多糖、脂類和有機溶劑等）徹底分離，并獲得標(biāo)本核酸。然后通過RNA反轉(zhuǎn)錄、一輪或兩輪PCR、核酸純化等步驟將待測序的核酸片段制備成兩端連有接頭、中間有短序列標(biāo)簽結(jié)構(gòu)的測序文庫。最后，對測序文庫進行二代測序并進行生物信息分析，比對測序序列識別病原體，解讀結(jié)果并生成結(jié)果報告。7實驗室分區(qū)、儀器設(shè)備及試劑7.1實驗室分區(qū)tNGS檢測技術(shù)具有靈敏度高的特點，易發(fā)生交叉污染，實驗室應(yīng)采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施，最大限度降低交叉污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果的風(fēng)險。可根據(jù)不同工作內(nèi)容劃分獨立區(qū)域，并設(shè)置明顯標(biāo)識，各區(qū)所用的器材（如移液器和吸頭）不可混用，工作流程和空氣流向按照單一方向進行?；驍U增檢驗實驗室各工作區(qū)域的設(shè)置、進入方向及氣流控制等要求見《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）。tNGS實驗室分區(qū)不少于：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品處理區(qū)、文庫構(gòu)建區(qū)、上機測序區(qū)等。7.2儀器設(shè)備及試劑7.2.1試劑準(zhǔn)備區(qū)宜包含以下儀器設(shè)備和試劑：a)儀器設(shè)備：1)醫(yī)用冰箱（4℃、-20℃低溫、-80℃超低溫）；2)超凈工作臺；3)微量移液器；4)旋渦混勻器；5)微型掌上離心機。b)試劑：以下提到的試劑宜在試劑準(zhǔn)備區(qū)長期保存。7.2.2樣品處理區(qū)宜包含以下儀器設(shè)備和試劑：a)儀器設(shè)備：1)醫(yī)用冰箱（4℃、-20℃低溫、-80℃超低溫）；2)生物安全柜(Ⅱ級或Ⅲ級）；3)微量移液器；4)旋渦混勻器；5)微型掌上離心機；7T/WJWCHCA001—20246)冷凍離心機（最大離心力12000g以上）；7)破碎儀（勻漿儀、均質(zhì)器）；8)自動核酸提取儀。b)試劑：1)液化試劑；注：根據(jù)采取的液化方法選擇對應(yīng)的液化試劑，如二硫蘇糖醇（DTT2)核酸提取試劑。7.2.3文庫構(gòu)建區(qū)宜包含以下儀器設(shè)備和試劑：a)儀器設(shè)備：1)醫(yī)用冰箱（4℃、-20℃低溫、-80℃超低溫）；2)生物安全柜(Ⅱ級或Ⅲ級）；3)微量移液器；4)旋渦混勻器；5)微型掌上離心機；6)PCR儀；7)自動純化儀。b)試劑：1)文庫制備試劑；注：試劑盒內(nèi)至少應(yīng)包含cDNA合成引物、一鏈合成酶、PCR預(yù)混液、文庫擴增預(yù)混液、純化磁珠等。2)靶向擴增引物。注1：引物設(shè)計時根據(jù)目標(biāo)病原體核酸序列，從公共數(shù)據(jù)庫中選擇已收錄的病原體高質(zhì)量基因組或基因序列，進行注2：根據(jù)常用于鑒定病原體的靶標(biāo)基因，包括但不限于功能區(qū)域、保守區(qū)域、多拷貝區(qū)域或經(jīng)過生物信息評估過7.2.4上機測序區(qū)宜包含以下儀器設(shè)備和試劑：a)儀器設(shè)備：1)醫(yī)用冰箱（4℃、-20℃低溫、-80℃超低溫）；2)生物安全柜(Ⅱ級或Ⅲ級）；3)微量移液器；4)旋渦混勻器；5)微型掌上離心機；6)熒光定量儀；7)全自動核酸蛋白分析儀；8)二代測序儀；9)服務(wù)器。b)試劑：二代測序試劑。注：試劑盒內(nèi)至少應(yīng)包含測序引物、高效測序反應(yīng)酶、緩沖液。7.3人員資質(zhì)實驗應(yīng)由具備分子生物學(xué)檢驗專業(yè)技能的人員進行操作，需獲得國家要求的相應(yīng)資質(zhì)；生物信息分析應(yīng)配備生物信息研發(fā)及管理人員，負(fù)責(zé)分析流程的運行、維護和更新；結(jié)果審核應(yīng)由具備臨床感染病學(xué)、高通量測序相關(guān)背景知識的專業(yè)技術(shù)人員進行。所有相關(guān)人員須通過崗位相關(guān)的培訓(xùn)和考核，以確保其具備上崗資格，并定期接受能力評估，以維持和提升專業(yè)技能水平。8性能驗證或性能確認(rèn)8.1方案選擇8T/WJWCHCA001—2024臨床實驗室可參考CNAS-CL02《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》選擇性能驗證方案或性能確認(rèn)方8.2性能驗證按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、制造商說明書規(guī)定的方法對實驗方法進行驗證。tNGS（屬于定性檢測）選擇驗證的性能指標(biāo)宜包括一致性，適用時，還應(yīng)包括檢出限、重復(fù)性等。8.3性能確認(rèn)8.3.1性能確認(rèn)時機檢測方案在投入使用前及關(guān)鍵實驗環(huán)節(jié)發(fā)生改變時應(yīng)進行性能確認(rèn)：a)影響檢測性能的關(guān)鍵檢測設(shè)備（如提取儀、PCR儀、二代測序儀等）搬遷、儀器更新升級，應(yīng)重新進行確認(rèn)；b)改變操作流程及試劑方案包括但不限于核酸提取、PCR產(chǎn)物純化、文庫構(gòu)建、二代測序等時，應(yīng)重新進行確認(rèn)；c)升級生物信息分析流程后應(yīng)重新進行確認(rèn)，包括但不限于數(shù)據(jù)庫更新、生物信息分析流程變動。8.3.2性能確認(rèn)參數(shù)實驗室tNGS檢測系統(tǒng)應(yīng)對重復(fù)性、一致性、檢出限、分析特異性、穩(wěn)定性等性能參數(shù)進行確認(rèn)。8.3.3生物信息分析流程的性能確認(rèn)8.3.3.1實驗室可選擇商業(yè)化的自動分析系統(tǒng)，或根據(jù)檢測項目和預(yù)期用途選擇合適的算法和軟件，搭建本實驗室的生物信息學(xué)分析流程。8.3.3.2對重要指標(biāo)進行必要的性能確認(rèn)（最低測序數(shù)據(jù)量、準(zhǔn)確率、召回率、精確率和F1-Score8.3.3.3使用臨床標(biāo)本tNGS全流程檢測后得到的測序數(shù)據(jù)進行確認(rèn)為宜。8.3.4性能確認(rèn)標(biāo)本的制備8.3.4.1臨床標(biāo)本選擇呼吸道臨床標(biāo)本（BALF、鼻咽拭子、痰液等），所選臨床標(biāo)本應(yīng)經(jīng)過參比方法（如培養(yǎng)）的確認(rèn)，參比方法可以為金標(biāo)準(zhǔn)方法、行業(yè)公認(rèn)方法、經(jīng)驗證性能符合要求滿足臨床預(yù)期用途的方法等。8.3.4.2參考物質(zhì)可選用商品化參考物質(zhì)或自制參考物質(zhì)。參考物質(zhì)制備應(yīng)遵循以下原則：a)代表性：參考物質(zhì)納入的病原體應(yīng)覆蓋呼吸道常見病原體檢出率的80％-90％，涵蓋不同類型病原體，包括革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒、支原體/衣原體；b)均勻性和穩(wěn)定性：參考物質(zhì)應(yīng)進行均勻性和穩(wěn)定性評估，具體方法應(yīng)符合CNAS-CL04《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要求；c)定值：參考物質(zhì)應(yīng)模擬臨床標(biāo)本并選擇合適的策略來進行定值，如經(jīng)過至少3家具備相應(yīng)技術(shù)能力的醫(yī)療機構(gòu)采用兩種或兩種以上的檢測方法證明其一致性，具體方法應(yīng)符合CNAS-CL04《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要求。8.3.5全流程性能確認(rèn)8.3.5.1重復(fù)性對同一批樣品在同一條件下（相同的環(huán)境、操作人員及儀器）3天內(nèi)應(yīng)至少進行3次以上檢測，評價重復(fù)性?？蛇x擇高、低2個不同梯度的參考物質(zhì)進行確認(rèn)，重復(fù)性應(yīng)≥95％。8.3.5.2一致性9T/WJWCHCA001—2024可選擇以下兩種不同類型的標(biāo)本來進行一致性確認(rèn)（例數(shù)應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)意義）：a)使用臨床標(biāo)本：可選取陰性標(biāo)本、陽性標(biāo)本（宜包含弱陽性/低擴增的標(biāo)本，并盡可能覆蓋檢測范圍內(nèi)常見病原體），比較tNGS與參比方法之間的差異，不一致的結(jié)果再用第3種方法進一步確認(rèn)，通過陽性符合率和陰性符合率評價定性測定的一致性，一致率應(yīng)≥95%;b)使用參考物質(zhì)：高、中、低三個濃度的一致率應(yīng)≥95％。8.3.6檢出限（LoD）應(yīng)選擇含有代表物種的混合參考物質(zhì)，梯度稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，并對該濃度進行20次以上重復(fù)。如果是20次檢測，必須檢出至少19次靶核酸(≥95。實驗室應(yīng)建立不同標(biāo)本類型、不同代表物種（如革蘭陰性菌選擇鮑曼不動桿菌，革蘭陽性菌選擇金黃色葡萄球菌等）的LoD。8.3.7分析特異性可通過以下措施進行分析特異性確認(rèn)：a)交叉反應(yīng)：驗證與檢測對象核酸序列具有同源性的病原體核酸是否會產(chǎn)生影響，宜在病原體感染的醫(yī)學(xué)決定水平進行驗證，如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌、白念珠菌和熱帶念珠菌。若驗證病原體均在項目檢測范圍內(nèi)，其比值與理論值相差應(yīng)在兩倍以內(nèi)；若驗證病原體僅有1種在檢測范圍內(nèi)，則該同源性的病原體不應(yīng)檢出，且不改變驗證病原體的檢出；b)抗干擾能力：tNGS潛在干擾物包括內(nèi)源性物質(zhì)（如宿主細(xì)胞、血液、粘液等）、外源性藥物（如用于緩解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和過敏癥狀的鼻腔和咽喉藥物等）、消毒劑等。痰標(biāo)本應(yīng)增加黏蛋白對結(jié)果干擾程度的評估。實驗組為在弱陽性標(biāo)本中加入干擾物溶液（接近臨床真值的干擾物濃度，對照組加入等量的溶劑），與常規(guī)標(biāo)本一樣處理，應(yīng)至少重復(fù)測定3次以上。符合率應(yīng)≥95％。8.3.8穩(wěn)定性分為標(biāo)本穩(wěn)定性和試劑穩(wěn)定性，符合率應(yīng)為100具體操作如下：a)標(biāo)本穩(wěn)定性：將弱陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本保存在不同溫度（如常溫、4℃、-20℃和-80℃)、不同時長（如1、3、7天）、不同凍融次數(shù)（如1次、2次、3次）的條件下進行檢測；b)試劑穩(wěn)定性：參考試劑說明書要求，將同批次試劑組份反復(fù)凍融、長期保存到試劑說明書聲稱的次數(shù)或時間，之后對弱陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本進行檢測。9分析前9.1標(biāo)本采集、保存與轉(zhuǎn)運基本要求標(biāo)本盡可能在首次抗菌藥物使用或更改治療方案前進行采集；采集過程中宜盡可能減少其他污染并及時送檢；標(biāo)本的采集、保存與轉(zhuǎn)運應(yīng)按WS/T640臨床微生物學(xué)檢驗標(biāo)本的采集和轉(zhuǎn)運相關(guān)要求進行操作，以避免因標(biāo)本采集或轉(zhuǎn)運不合適，導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性或假陰性。9.2標(biāo)本信息送檢方宜提供以下信息：受檢者姓名、年齡、性別、標(biāo)本類型、采樣時間、送檢時間、初步診斷、重點關(guān)注病原體、近期抗感染治療方案等。申請單模板見附錄A。9.3標(biāo)本轉(zhuǎn)運標(biāo)本轉(zhuǎn)運要求如下：a)標(biāo)本采集后，宜盡快送到實驗室，不宜超過2h；b)無法及時送達或待處理標(biāo)本應(yīng)置于4℃冰箱保存，不宜超過24h，冷藏運輸；c)若標(biāo)本采集時間與檢測時間間隔＞24h,應(yīng)保存在-20℃或-80℃冰箱，干冰運輸。10分析中T/WJWCHCA001—202410.1方案選擇10.1.1使用商品化試劑盒使用商品化試劑盒時，應(yīng)遵循相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)及制造商的使用說明。10.1.2使用實驗室自建程序根據(jù)是否使用商品化試劑盒的自建程序分為以下情況：a)如果在商品化試劑盒的基礎(chǔ)上開發(fā)新的方法具有新的用途，經(jīng)確認(rèn)符合用戶自定義的用途，應(yīng)制定說明并遵守；b)如果實驗使用不同于商品化試劑盒的自建程序，則應(yīng)確認(rèn)它符合目的，應(yīng)編寫說明并遵守。使用不同制造商的產(chǎn)品可能影響結(jié)果，產(chǎn)品可能不兼容。只有在組件經(jīng)過配套測試并經(jīng)過確認(rèn)檢測性能要求時，它們才宜應(yīng)用于診斷測試。10.2標(biāo)本處理10.2.1均質(zhì)化處理宜采取以下措施進行均質(zhì)化處理：a)標(biāo)本檢測前宜混勻；b)黏稠的標(biāo)本（痰或BALF）可進行相應(yīng)的液化處理，用消化液分散黏液成分；液化方法有DTT法、蛋白酶法等，可選擇合適的方法進行液化。10.2.2破壁處理對核酸提取過程中破壁困難的微生物應(yīng)進行特殊破壁處理（常見于下呼吸道標(biāo)本）。機械研磨、超聲破碎、酶裂解等方法均能提高胞內(nèi)菌和真菌細(xì)胞壁的裂解效率，釋放更多胞內(nèi)菌及真菌的核酸，提高其檢出率?？筛鶕?jù)情況選擇合適的破壁方法。注：相關(guān)微生物如分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隱球菌屬與雙相真菌）等。10.2.3內(nèi)參添加宜加入外源性內(nèi)參用于檢測過程的監(jiān)控（通過監(jiān)測內(nèi)參的指標(biāo)可以判斷測序過程是否穩(wěn)定，是否存在偏差或錯誤）等。10.3核酸提取10.3.1應(yīng)防止外界環(huán)境（如灰塵、氣溶膠、RNA酶等）對核酸提取的污染，同時避免病原體本身及實驗過程中的廢棄物、廢棄液等對環(huán)境的污染。10.3.2在整個實驗操作過程中應(yīng)采用安全有效的防護措施。10.3.3應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性，保證下游檢測流程順利進行。10.3.4驗證指標(biāo)至少應(yīng)包括核酸濃度等，提取后應(yīng)對核酸質(zhì)量進行檢測，還可以進行純度和完整性評估。10.4文庫構(gòu)建10.4.1基于多重PCR反應(yīng)一次性擴增多個目標(biāo)區(qū)域序列，并將二代測序所需的接頭序列引入到擴增子產(chǎn)物的兩側(cè)得到測序文庫。10.4.2如tNGS檢測范圍內(nèi)未包含RNA病毒，可不進行反轉(zhuǎn)錄擴增。10.4.3完成文庫構(gòu)建后應(yīng)對構(gòu)建的文庫進行質(zhì)量評估。主要的文庫質(zhì)控指標(biāo)為文庫片段大小和文庫濃度評估，除此之外還可包括文庫轉(zhuǎn)化率、文庫復(fù)雜度等。10.5二代測序進行二代測序時，應(yīng)注意選擇合格的文庫和二代測序試劑，具體可根據(jù)二代測序儀廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)測序流程進行測序操作。10.6生物信息分析T/WJWCHCA001—202410.6.1基本原則生物信息分析應(yīng)遵循以下原則：a)充分了解公開數(shù)據(jù)庫儲量及質(zhì)量，采用臨床應(yīng)用級微生物數(shù)據(jù)庫；b)生物信息分析人員應(yīng)遵循tNGS數(shù)據(jù)分析流程，從原始序列到非人源高質(zhì)量序列的獲得以及物種注釋應(yīng)經(jīng)過標(biāo)簽識別、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量和測序深度評估、低質(zhì)量序列過濾、去人源核酸序列、高質(zhì)量序列比對等環(huán)節(jié)，每一步應(yīng)嚴(yán)格遵循流程及具體要求。報告要規(guī)范，結(jié)果解釋應(yīng)結(jié)合臨床；c)實驗室應(yīng)具備生物信息學(xué)分析的軟件和硬件條件，服務(wù)器容量應(yīng)滿足大樣本同時下機的數(shù)據(jù)處理。生物信息人員熟悉各種軟件使用方法及功能，掌握物種基因組信息收集、整理、分類、更新及建庫方法和軟件使用。識別因標(biāo)本污染、序列質(zhì)量、測序深度不足及比對錯誤等產(chǎn)生的異常測序結(jié)果，并熟練使用報告生成的信息系統(tǒng)；10.6.2數(shù)據(jù)質(zhì)控測序完成后，在對測序結(jié)果進行生物信息分析之前，應(yīng)對下機數(shù)據(jù)先進行質(zhì)量評估，以保證測序結(jié)果的可用性。質(zhì)控指標(biāo)包括Q20、Q30、內(nèi)參數(shù)據(jù)量等。10.6.3序列比對宜采取以下措施進行序列比對：a)測序序列與病原體數(shù)據(jù)庫中的參考序列進行比對，應(yīng)引用臨床應(yīng)用級微生物數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫宜全面、準(zhǔn)確涵蓋待測病原體的基因組信息，且確保每條收錄的序列數(shù)據(jù)準(zhǔn)確完整，盡可能排除多重比對的情況；b)確認(rèn)病原體檢出真實性時應(yīng)查看擴增子覆蓋情況，擴增子覆蓋越多真實性越高；c)確定序列比對特異時，應(yīng)排除生物信息非特異比對情況（因與其他物種同源性較高導(dǎo)致的假11分析后11.1病原體報告流程測序數(shù)據(jù)下機、生物信息分析完成后，報告解讀人員進行測序數(shù)據(jù)解讀，報告流程如下：a)質(zhì)控檢查：首先確認(rèn)質(zhì)控參數(shù)如Q30值、數(shù)據(jù)量、內(nèi)參等是否合格，以確保后續(xù)分析的可靠b)污染排查：通過分析陰、陽性質(zhì)控品的檢測結(jié)果是否符合預(yù)期、批次病原體檢出率、接頭殘留污染情況以及試劑環(huán)境污染情況，來排查整個標(biāo)本處理到測序數(shù)據(jù)產(chǎn)生的過程中是否存在污染。只有在排除污染的情況下，才能進行下一步病原體的檢出判斷；c)病原體參數(shù)評估：陽性病原體真實性的確定不應(yīng)依賴于某個單一的指標(biāo)，而應(yīng)綜合考慮序列數(shù)、擴增子擴增效率、擴增子覆蓋情況等多個參數(shù)進行綜合判定；d)序列特異性確認(rèn)：對于同源性較高的病原體（如肺炎鏈球菌與其他鏈球菌等），應(yīng)從序列特異性上進行確認(rèn)，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性；e)臨床信息結(jié)合：應(yīng)密切關(guān)注臨床其他相關(guān)檢測結(jié)果，如血常規(guī)、培養(yǎng)、病毒抗體等，進行綜合分析，以提供更全面的診斷信息；f)驗證性檢測：必要時可加做其他相關(guān)檢測項目進行驗證。對于臨床關(guān)注度高且核酸提取困難的病原體（如結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、嗜肺軍團菌等），如果檢出低序列可加做qPCR或抗原抗體檢測進行驗證，以提高診斷的準(zhǔn)確性。11.2結(jié)果報告發(fā)布核對患者信息與報告單，準(zhǔn)確無誤后發(fā)布報告單。結(jié)果報告除滿足GB/T22576.1—2018《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的要求第1部分：通用要求》中第5.8.3條的要求外，報告還應(yīng)包括以下內(nèi)容（報告模板見附錄B）：——檢測到的病原體物種（包括屬和種）、耐藥基因、檢出序列數(shù)；T/WJWCHCA001—2024——質(zhì)控信息（總序列數(shù)、Q30等）；——該檢測方法的檢測范圍及檢測技術(shù)說明；——對相關(guān)的專業(yè)術(shù)語進行說明，并注明檢測方法的檢出限等。11.3假陰性與假陽性結(jié)果處理11.3.1假陰性結(jié)果處理當(dāng)tNGS檢測結(jié)果為陰性，而其他感染相關(guān)檢測陽性且與臨床診斷相符時，可能出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。由此，可采取以下措施：a)核查原始樣品管、申請單、實驗流程編號，確認(rèn)全流程的唯一對應(yīng)性。排查是否存在實驗異?；驑?biāo)本錯誤；b)實驗和標(biāo)本無異常的情況下，可能存在該標(biāo)本病原體載量低于檢出限等情況，臨床醫(yī)生或護士宜重新采樣并送檢，注意選擇合適的標(biāo)本類型，靠近病灶采樣；c)梳理整個檢測流程，明確導(dǎo)致假陰性的原因，與臨床進行溝通。同時實驗室內(nèi)部應(yīng)針對問題進行整改，持續(xù)改進檢測流程。11.3.2假陽性結(jié)果處理處理流程參考本標(biāo)準(zhǔn)第11.3.1條的規(guī)定，同時應(yīng)關(guān)注以下幾點：a)嚴(yán)格排查實驗過程中是否存在其他來源的陽性污染，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；b)對于送檢的BALF標(biāo)本，必要時應(yīng)向臨床咨詢了解支氣管鏡取樣過程中是否存在污染或洗消不徹底的情況，以避免支氣管鏡殘留病原體核酸片段影響檢測結(jié)果；c)如需重新采樣送檢，務(wù)必注意進行徹底的消殺和無菌操作，以防止標(biāo)本污染。11.4臨床標(biāo)本的儲存、保留和處置原始標(biāo)本、核酸及其核酸擴增產(chǎn)物應(yīng)根據(jù)實驗室的要求規(guī)定保存期限，以便于復(fù)查和必要時加做其他檢測。為便于追溯，測序原始數(shù)據(jù)以及分析結(jié)果也應(yīng)同時進行保存。12質(zhì)量控制12.1分析前質(zhì)量控制分析前質(zhì)量控制包含標(biāo)本采集、送檢流程及標(biāo)本前處理流程等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可采取以下措施監(jiān)控相關(guān)檢測點：a)各實驗室應(yīng)建立標(biāo)本采集與送檢流程以明確標(biāo)本選擇、采集時機和方式、耗材、標(biāo)本量、申請單填寫規(guī)則、運送保存條件、拒收標(biāo)準(zhǔn)等，以減少環(huán)境和人體定植微生物或其核酸污染；b)應(yīng)考慮標(biāo)本保存運輸?shù)姆€(wěn)定性；c)應(yīng)建立臨床標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化前處理程序，對標(biāo)本性狀、運輸容器、時長、溫度等建立明確的接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)，不同的標(biāo)本類型選擇對應(yīng)的前處理方式。12.2分析中質(zhì)量控制12.2.1室內(nèi)質(zhì)量控制12.2.1.1分析中質(zhì)量控制涉及核酸提取、文庫構(gòu)建、二代測序、生物信息分析等環(huán)節(jié)。關(guān)鍵質(zhì)控點包括：a)核酸濃度、純度、完整性等；建庫前核酸投入量下限與上限、文庫核酸濃度、片段大小分布b)文庫有效數(shù)據(jù)量、Q30值、接頭比例、內(nèi)參序列等。12.2.1.2針對以上質(zhì)控點，可采取以下措施進行質(zhì)量控制：T/WJWCHCA001—2024a)tNGS相較傳統(tǒng)PCR有更廣的病原體覆蓋范圍和更高的靈敏度，因此應(yīng)制定更高的防污染要求，在保證實驗質(zhì)量的前提下應(yīng)優(yōu)先采用經(jīng)性能確認(rèn)的封閉式自動化設(shè)備代替部分人工操作，以避免實驗過程中來自操作人員和實驗室環(huán)境中的微生物或其核酸造成的污染；b)每次測序應(yīng)包括陰性和陽性質(zhì)控品，明確陰性、陽性質(zhì)控品的在控和失控標(biāo)準(zhǔn)。注：陰性質(zhì)控物為不含病原體核酸的標(biāo)本，用于識別外部污染、試劑12.2.2室間質(zhì)量評價12.2.2.1實驗室應(yīng)制定相應(yīng)的政策和措施，有計劃地參加外部質(zhì)量控制活動，包括國內(nèi)外實驗室認(rèn)可機構(gòu)組織的能力驗證活動，實驗室主管機構(gòu)組織的比對活動，國際間、國內(nèi)同行間的實驗室比對試驗等。改進質(zhì)量管理，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。12.2.2.2實驗室完成試驗，及時遞交試驗結(jié)果和相關(guān)記錄。12.2.2.3應(yīng)根據(jù)外部評審、能力驗證、考核、比對等結(jié)果來評估本實驗室的工作質(zhì)量并采取相應(yīng)的改進措施。12.2.3結(jié)果可比性進行實驗室內(nèi)部比對，主要包括實驗室內(nèi)部不同人員、設(shè)備的比對。12.3分析后質(zhì)量控制分析后質(zhì)量控制涉及報告周轉(zhuǎn)時間、陽性率/陰性率、室內(nèi)質(zhì)控失敗率、報告修改率、與臨床診斷的一致率、復(fù)測率、取消測試數(shù)等數(shù)據(jù)的記錄、統(tǒng)計和分析等，針對異常記錄，應(yīng)提供糾正措施以不斷改進和優(yōu)化流程，并審查所有與檢測相關(guān)的文檔。T/WJWCHCA001—2024呼吸道感染病原體靶向二代測序申請單模板表A.1給出了呼吸道感染病原體靶向二代測序申請單模板，可不限于下列形式。表A.1呼吸道感染病原體靶向二代測序申請單模板*姓名：*性別：*年齡：*聯(lián)系人電話：*門診/住院號：）：）：）：）：）：）：）：注：標(biāo)注星號(*)的為必填項。T/WJWCHCA001—2024呼吸道感染病原體靶向二代測序檢測報告模板表B.1給出了呼吸道感染病原體靶向二代測序檢測報告模板,可不限于下列形式。表B.1呼吸道感染病原體靶向二代測序檢測報告模板（％）1.本檢測應(yīng)用基于多重PCR的靶向二代測序技術(shù)（targetednext-generationsequ測，通過生物信息分析鑒定標(biāo)本中病原體，輔助臨床醫(yī)生進行診斷和制定個2.本檢測病原體包含可單獨列表）。范圍外的病原體無法檢測。4.本檢測檢出限為：***copies/mL，低于檢出限的病原5.本報告僅對本次送檢標(biāo)本負(fù)責(zé)，無檢測人或?qū)徍巳撕炞?.臨床醫(yī)生應(yīng)綜合患者癥狀/體征、病史、其他實驗室檢測結(jié)果等情況進行診斷，本檢測報告不作7.本實驗室保留對上述結(jié)果的最終解釋權(quán)，如有疑義請在收到報告均一化序列數(shù)指每***的原始序列中含有該病原體的序列數(shù)，均一化序列數(shù)數(shù)值越高，則反映該T/WJWCHCA001—2024參考文獻[1]GB/T40226—2021環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法.[2]GB/T40458—2021用于病原微生物高通量檢測的核酸提取技術(shù)規(guī)范.[3]GB/T40664—2021用于高通量測序的核酸類樣本質(zhì)量控制通用要求.[4]GB/T42066—2022急性病毒性感染呼吸道樣本采集.[5]WS/T499—2017下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作指南.[6]WS/T807-2022臨床微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏檢測系統(tǒng)的性能驗證.[7]YY/T1182—2010核酸擴增檢測用試劑（盒）.[8]YY/T1725—2020細(xì)菌和真菌感染多重核酸檢測試劑盒.[9]CNAS-CL02：醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則.[10]CNAS—GL050：醫(yī)學(xué)實驗室分子診斷領(lǐng)域認(rèn)可指南.[11]CNAS—GL039：分子診斷檢驗程序性能驗證指南.[12]CNAS-CL04：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則.[13]T/GDPMAA0012—2023：高通量基因測序項目分類.[14]中國研究型醫(yī)院學(xué)會呼吸病學(xué)專業(yè)委員會,成人呼吸系統(tǒng)感染性疾病病原學(xué)診斷專家意見編寫組.成人呼吸系統(tǒng)感染性疾病病原學(xué)診斷專家意見[J].中華結(jié)核和呼吸雜志2020年43卷9期,757-764頁.[15]鄒曉輝,