【源版】雙向電泳技術(shù)2008a

雙向電泳2-dimentionalgelelectrophoresis

高分辨的雙向電泳是由O’Farrell’s和Klose三十多年前各自創(chuàng)建的。1975年O’Farrell’s對(duì)E.coli提取物進(jìn)行雙向電泳后，成功地分離約1000個(gè)E.coli蛋白，從此拉開了雙向電泳在蛋白組學(xué)中的研究序幕。雙向電泳其原理簡(jiǎn)明，第一向沿水平方向按等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離（等電聚焦），不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)沿pH梯度分離，到達(dá)各自的等電點(diǎn)；隨后第二向沿垂直的方向按分子量進(jìn)行分離，它是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。

（一）等電聚焦電泳技術(shù)

（isoelectricfocusing，IEF）

是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)，進(jìn)行分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)。1、等電聚焦原理

等電點(diǎn)聚焦就是在電泳槽中放入載體兩性電解質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)混合物放進(jìn)此體系，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度，而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上,從而得到分離。測(cè)出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH101-DIsoelectricFocusingTheory2、優(yōu)點(diǎn)1)分辨率可達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分；2)等電聚焦能抵消擴(kuò)散作用，使區(qū)帶越走越窄；3)樣品不管加在什么部位，都可聚焦到其等電點(diǎn)，而且很稀的樣品也可進(jìn)行分離。4）可以測(cè)量被測(cè)物質(zhì)的等電點(diǎn)3、pH梯度的形成（1）人工pH梯度：

當(dāng)兩個(gè)不同pH的緩沖液互相擴(kuò)散時(shí)，在其混合區(qū)間即形成pH梯度，稱為“人工pH梯度”。因?yàn)榫彌_液是電解質(zhì)，在電場(chǎng)中它的離子移動(dòng)會(huì)引起pH梯度的改變，所以不穩(wěn)定。（2）天然pH梯度：

是在正負(fù)極間引入等電點(diǎn)彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，這種梯度是由電流本身所引起并保持的，因此比較穩(wěn)定。pH梯度的選擇常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長(zhǎng)，預(yù)試驗(yàn)確定。4、兩性電解質(zhì)載體與支持介質(zhì)

1）兩性電解質(zhì)介質(zhì)

理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個(gè)體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。

2）常用的支持載體

聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠為最為常用。電泳后，不可用染色劑直接染色，因?yàn)槌Ｓ玫牡鞍踪|(zhì)染色劑也能和兩性電解質(zhì)結(jié)合，因此應(yīng)先將凝膠浸泡在5%的三氯醋酸中去除兩性電解質(zhì)，然后再以適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ旧?/p>

兩維間的平衡

一維結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS是電泳能順利進(jìn)行。建議方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。（二）、聚丙烯酰胺凝膠電泳

（Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）

一）基本原理聚丙烯酰胺凝膠由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2

Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成.化學(xué)聚合和光聚合化學(xué)聚合通常是加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基：以R

代表自由基，M代表丙烯酰胺單體，則聚合過程可以表示為：

單體和雙體在凝膠中的總濃度（T）a代表單體的重量（g）；b代表雙體的重量（g）；m代表溶液中的體積（ml）交聯(lián)度（c）雙體占總濃度的百分含量PAG濃度T%Ｃ=2-6%分離物分子量范圍（KDa）PAG濃度Ｔ％Ｃ＝５％分離物分子量范圍（KDa）530-200５60-7001015-1001022-2801510-501510-200202-15205-150表PAG濃度與蛋白質(zhì)分離物分子量之間的關(guān)系二）聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)：可以隨意控制“T”和“C”，從而得到不同的有效孔徑。高的靈敏度：10－9

～10－12

mol/L。電泳時(shí)不會(huì)產(chǎn)生“電滲”。使用高純度的單體原料，因而電泳分離的重復(fù)性好。透明度好，便于照相和復(fù)印。機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長(zhǎng)的凝膠掃描作定量分析。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

1967年，Shapiro等人首先發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大小。電泳的樣品中加入含有SDS和

-巰基乙醇的樣品處理液，SDS即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+），是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑

-巰基乙醇可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子，這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。這樣就消除了各種蛋白質(zhì)本身電荷上的差異。電泳樣品加入樣品處理液后，要在沸水浴中煮3-5min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15，000－200，000之間時(shí)，樣品的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合如下方程式：lgMW=－b

mR+K

其中，MW為蛋白質(zhì)的分子量，mR為相對(duì)遷移率，b為斜率，K為截距。當(dāng)條件一定時(shí)，b與K均為常數(shù)。因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可以得出未知蛋白的分子量。

雙向電泳實(shí)驗(yàn)流程

樣品制備（Samplepreparation）

固相預(yù)制膠條的水化（IPGstriprehydration）

第一向等電聚焦（IEF）

膠條的平衡（IPGstripequilibration）

第二向SDS電泳（SDSelectrophresis