蛋白質(zhì)的分離純化鏡巖生物化學(xué)全

蛋白質(zhì)的分離純化鏡巖生物化學(xué)全第一節(jié)蛋白質(zhì)得酸堿性質(zhì)

蛋白質(zhì)得等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子由氨基酸組成,在蛋白質(zhì)分子中保留著游離得末端α—氨基與α—羧基以及側(cè)鏈上得各種功能團(tuán)。蛋白質(zhì)也就是一類兩性電解質(zhì),能與酸或堿發(fā)生作用。可解離基團(tuán)主要來自側(cè)鏈上得功能團(tuán)

、對某一種蛋白質(zhì)來說,在某一pH,它所帶得正電荷與負(fù)電荷恰好相等,也即凈電荷為零,這一pH稱為蛋白質(zhì)得等電點(diǎn)(與蛋白質(zhì)所含氨基酸種類有關(guān))。蛋白質(zhì)得等離子點(diǎn)就是特征常數(shù)

蛋白質(zhì)得電泳在等電點(diǎn)時(shí)(IsoelectricpointpI),蛋白質(zhì)得溶解度最小,在電場中不移動(dòng)。在不同得pH環(huán)境下,蛋白質(zhì)得電學(xué)性質(zhì)不同。在大于等電點(diǎn)得溶液中,蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動(dòng);在小于等電點(diǎn)得溶液中,蛋白質(zhì)粒子帶正電荷,在電場中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳(Electrophoresis)。電泳利用蛋白質(zhì)得電泳現(xiàn)象,可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。第二節(jié)

蛋白質(zhì)分子大小得測定常用測定方法:1、根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量2、凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量3、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量4、滲透壓法5、沉降分析法(離心)一、根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量

用化學(xué)分析方法測定出蛋白質(zhì)中某一微量元素得含量,并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中只有一個(gè)鐵原子。則可以由此計(jì)算出蛋白質(zhì)得最低相對分子質(zhì)量。例如,肌紅蛋白含鐵量為0、335％,其最低相對分子質(zhì)量可按下式算出:最低相對分子質(zhì)量=(鐵得原子量/鐵得百分含量)X100=(55、8/0、335)X100=16700二、凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量凝膠過濾原理分子篩色譜(凝膠過濾)大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)利用Andrews得實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)式:

logMr=a/b—Ve/bVoVe(elutionvolume)為某一溶質(zhì)組分得洗脫體積。它就是自加樣品開始到該組分得洗脫峰(峰頂)出現(xiàn)時(shí)所流出得體積。V0(outervolume)為外水體積,即存在于柱床中凝膠珠外孔隙得水相體積。測定出不能被凝膠滯留得大分子溶質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖—2000得洗脫體積可以決定V0。

logMr三、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量

聚丙烯酰胺凝膠電泳,(簡稱PAGE),也稱圓盤電泳,它以聚丙烯酰胺凝膠(單體丙烯酰胺Arc與交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺Bis共聚而成)為支持物。蛋白質(zhì)顆粒在各種介質(zhì)中電泳時(shí),它得遷移率決定于它所帶得電荷以及分子大小與形狀(電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng))。

如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)與少量巰基乙醇,單體蛋白質(zhì)或亞基得多肽鏈處于伸展?fàn)顟B(tài),此時(shí)SDS以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子得側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合體。結(jié)果:1、所有得SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體都具有相同得荷質(zhì)比。2、具有相同得構(gòu)象。因此蛋白質(zhì)分子得電泳遷移率主要取決于它得相對分子質(zhì)量,而與原來所帶得電荷與分子形狀無關(guān)。十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）

在聚丙烯酰胺凝膠中由于引入凝膠得分子篩效應(yīng),電泳遷移率與多肽鏈分子量得對數(shù)有下列關(guān)系:

logMr=a—bμR式中Mr為相對分子質(zhì)量,a、b都就是常數(shù),μR就是相對遷移率:

μR=樣品遷移距離/前沿(染料)遷移距離

實(shí)驗(yàn)測定時(shí),以幾種相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物蛋白質(zhì)得Mr得對數(shù)值對其μR值作圖,根據(jù)待測樣品得μR,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它得Mr。最準(zhǔn)確可靠得方法就是超離心法(Svedberg于1940年設(shè)計(jì)):蛋白質(zhì)顆粒在25~50*104g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)(s):單位(cm)離心場里得沉降速度。

s=————vω2x

v=沉降速度(dx/dt)ω=離心機(jī)轉(zhuǎn)子角速度(弧度/s)

x=蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)與轉(zhuǎn)子中心得距離(cm)沉降系數(shù)得單位常用S,1S=1×10-13(s)蛋白質(zhì)分子量(M)與沉降系數(shù)(s)得關(guān)系M=——————RTsD（1－Vρ）R—?dú)怏w常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T—絕對溫度D—擴(kuò)散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機(jī)轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計(jì)）V—蛋白質(zhì)的微分比容（m3·g-1）ρ—溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s—沉降系數(shù)第三節(jié)蛋白質(zhì)得膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)得沉淀一、蛋白質(zhì)得膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)溶液就是一種分散系統(tǒng)。蛋白質(zhì)分子顆粒就是分散相,水就是分散介質(zhì)。就其分散程度而言蛋白質(zhì)溶液屬于膠體系統(tǒng)。分散相質(zhì)點(diǎn)在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定應(yīng)具備三個(gè)條件:A、分散相得質(zhì)點(diǎn)大小在1-100nm范圍內(nèi)。動(dòng)力學(xué)上穩(wěn)定,能作不斷得布朗運(yùn)動(dòng)。真溶液(1nm)<膠體溶液<懸浮液(100nm)B、分散相得質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷,互相排斥,不易聚集成大顆粒而沉淀。C、分散相得質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層(如水化層)蛋白質(zhì)溶液性質(zhì):1、蛋白質(zhì)分子顆粒在1-100nm范圍內(nèi)。2、形成水化層:分子表面上親水基團(tuán)在水溶液中能與水分子起水化作用3、構(gòu)成穩(wěn)定得雙電層:分子表面上得可解離基團(tuán),在適當(dāng)?shù)胮H條件下,都帶有相同得凈電荷,與其周圍得反離子構(gòu)成穩(wěn)定得雙電層。++++++++++++------------+4、蛋白質(zhì)溶液也與一般得膠體系統(tǒng)一樣具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過半透膜等性質(zhì)由于膠體溶液中得蛋白質(zhì)不能通過半透膜,因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白得小分子雜質(zhì)除去。二、蛋白質(zhì)得沉淀

蛋白質(zhì)在溶液中得穩(wěn)定性與它得分子量大小、所帶得電荷與水化作用有關(guān),就是有條件得、相對得。如果條件發(fā)生改變,破壞了蛋白質(zhì)溶液得穩(wěn)定性,蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來。在溫與條件下,通過改變?nèi)芤旱胮H或電荷狀況,使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中,結(jié)構(gòu)與性質(zhì)都沒有發(fā)生變化,在適當(dāng)?shù)脳l件下,可以重新溶解形成溶液,所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。可逆沉淀就是分離與純化蛋白質(zhì)得基本方法,如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法與有機(jī)溶劑沉淀法等。可逆沉淀在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下,不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液得穩(wěn)定性,而且也破壞了蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)與性質(zhì),產(chǎn)生得蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)與性質(zhì)得變化,所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀與生物堿試劑沉淀等都屬于不可逆沉淀。不可逆沉淀沉淀蛋白質(zhì)得方法有以下幾種:(1)鹽析法:向蛋白質(zhì)溶液中加人大量得中性鹽(硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等),使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。鹽析沉淀一般不引起蛋白質(zhì)變性。當(dāng)除去鹽后,又可溶解。

(2)有機(jī)溶劑沉淀法

極性有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇或丙酮等),因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間得相互作用,致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。(3)重金屬鹽沉淀法(4)生物堿試劑與某些酸類沉淀法(5)加熱變性沉淀法

幾乎所有得蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。原因可能就是由于熱變性就是蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體,疏水基外露,因而破壞了水化層,同時(shí)由于蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)也破壞了帶電狀態(tài)(當(dāng)處于等電點(diǎn)時(shí))。

少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)得加熱凝固。(豆腐)我國很早就創(chuàng)造了將大豆蛋白質(zhì)得濃溶液加熱并點(diǎn)入少量鹽鹵(含MgCl2)得制豆腐得方法,這就是成功得應(yīng)用加熱變性沉淀蛋白質(zhì)得一個(gè)例子。

點(diǎn)鹵時(shí),由于鹽鹵就是電解質(zhì),它們在水里會(huì)分成許多帶電得小顆粒——正離子與負(fù)離子,由于這些離子得水化作用而奪取了蛋白質(zhì)得水膜,以致沒有足夠得水來溶解蛋白質(zhì)。另外,鹽得正負(fù)離子抑制了由于蛋白質(zhì)表面所帶電荷而引起得斥力,這樣使蛋白質(zhì)得溶解度降低,而顆粒相互凝聚成沉淀。這時(shí),豆?jié){里就出現(xiàn)了許多白花花得東西了。

鹽鹵里有許多電解質(zhì),主要就是鈣、鎂等金屬離子,它們會(huì)使人體內(nèi)得蛋白質(zhì)凝固,所以人如果多喝了鹽鹵,就會(huì)有生命危險(xiǎn)。

第四節(jié)蛋白質(zhì)分離純化得一般原則

分離純化某一特定蛋白質(zhì)得一般程序可以分為:

1、前處理

2、粗分級分離

3、細(xì)分級分離

1、前處理(pretreatment)

分離純化某一蛋白質(zhì),首先要求把蛋白質(zhì)從原來得組織或細(xì)胞中以溶解得狀態(tài)釋放出來,并保持原來得天然狀態(tài),不丟失生物活性。動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織與脂肪組織,種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免受雜質(zhì)得污染,油料種子最好先用低沸點(diǎn)得有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同得情況,選擇適當(dāng)?shù)梅椒?將組織與細(xì)胞破碎。動(dòng)物組織與細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。植物組織與細(xì)胞,由于具有由纖維素、半纖維素與果膠等物質(zhì)組成得細(xì)胞壁,一般需要用與石英砂或玻璃粉與適當(dāng)?shù)锰崛∫阂黄鹧心サ梅椒ㄆ扑?液氮破碎或用纖維素酶處理也能達(dá)到目得。細(xì)菌細(xì)胞得破碎得常用方法有超聲波震蕩,與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理(以分解肽聚糖)等。組織與細(xì)胞破碎以后,選擇適當(dāng)?shù)镁彌_液把所要得蛋白質(zhì)提取出來。細(xì)胞碎片等不溶物用離心或過濾等方法除去。

如果所要得蛋白質(zhì)主要集中在某一細(xì)胞組分,如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性得細(xì)胞質(zhì)等,則可利用差速離心方法將它們分開如果碰上所要蛋白質(zhì)就是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合得,則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚,然后用適當(dāng)?shù)媒橘|(zhì)提取。2、粗分級分離(roughfractionation)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液(有時(shí)還雜有核酸、多糖之類)獲得后,選用一套適當(dāng)?shù)梅椒?將所要得蛋白質(zhì)與其她雜蛋白分離開來。一般這一步得分級分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀與有機(jī)溶劑分級分離等方法。這些方法得特點(diǎn)就是簡便、處理量大,既能除去大量雜質(zhì)(包括脫鹽),又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。有些蛋白質(zhì)提取液體積較大,又不適于用沉淀或鹽析法濃縮,則可采用超過濾、冷凍真空干燥或其她方法(如聚乙二醇濃縮法)進(jìn)行濃縮。3、細(xì)分級分離(finefractionation)

進(jìn)一步純化,一般使用層析法包括凝膠過濾,離子交換層析,吸附層析以及親與層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法,包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等作為最后得純化步驟。用于細(xì)分級分離得方法一般規(guī)模較小,但分辨率很高。

4、結(jié)晶

結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度得純化,蛋白質(zhì)純度愈高,溶液愈濃就愈容易結(jié)晶。盡管結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定就是均一得,但只有某種蛋白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢時(shí)才能形成結(jié)晶。由于結(jié)晶中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)得結(jié)晶不僅就是純度得一個(gè)標(biāo)志,也就是斷定制品處于天然狀態(tài)得有力指標(biāo)。結(jié)晶也就是進(jìn)行X射線晶體學(xué)分析所要求得,結(jié)晶得最佳條件就是使溶液略處于過飽與狀態(tài),此時(shí)較易得到結(jié)晶。接入晶種常能加速結(jié)晶過程。

第五節(jié)蛋白質(zhì)得分離純化方法

幾種常用得蛋白質(zhì)純化方法:根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中得性質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)得方法:①分子大小;②溶解度;③電荷;④吸附性質(zhì);⑤對配體分子得生物學(xué)親與力等。

一、根據(jù)分子大小不同得純化方法

1、透析與超過濾透析(dialysis)就是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜得性質(zhì),使蛋白質(zhì)與其她小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖等分開。常用得半透膜就是玻璃紙與其她改型得纖維素材料。

超濾就是利用壓力或離心力,強(qiáng)行使水與其她小分子溶質(zhì)通過半透膜,而蛋白質(zhì)被截留在膜上,以達(dá)到濃縮與脫鹽得目得。2、密度梯度(區(qū)帶)離心

蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度得介質(zhì)中離心時(shí),質(zhì)量與密度大得顆粒比質(zhì)量與密度小得顆粒沉降得快,并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等得介質(zhì)密度梯度時(shí),即停止不前,最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成獨(dú)立得區(qū)帶,

密度梯度常用得密度梯度有蔗糖梯度,聚蔗糖梯度。蔗糖便宜,純度高,濃溶液(60％,W／W)密度可達(dá)1、28g／cm3。聚蔗糖得商品名就是Ficoll,它就是由蔗糖與1—氯—2,3—環(huán)氧丙烷合成得高聚物,Mr約400000。密度梯度在離心管內(nèi)得分布就是管底得密度最大,向上逐漸減小

3、凝膠過濾層析(分子排阻

)(1)凝膠過濾得介質(zhì)

凝膠過濾所用得介質(zhì)就是凝膠顆粒,其內(nèi)部就是多孔得網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),

經(jīng)常使用得凝膠種類:(1)葡聚糖凝膠,就是由線形得α—1,6葡聚糖與1—氯—2,3葡聚糖—環(huán)氧丙烷反應(yīng)而成得化合物,它得商品名稱為Sephadex。不同型號(hào)得Sephadex用G來表示。G后面得數(shù)字-10、200表示吸水量為1、20克/克干膠。如SephadexG-100交聯(lián)葡聚糖凝膠得種類有G-10,G-15,G-25,G-50,G-75,G-100,G-150,與G-200。因此,“G”反映凝膠得交聯(lián)程度,膨脹程度及分部范圍。交聯(lián)度越高,凝膠孔徑越小。G10、15、25分離范圍<5000適用于脫鹽、肽與其它小分子得分離,膠柱長要求15-25厘米。G-50分離范圍1500-30000G-75分離范圍3000-80000G-100分離范圍4000-150000G-200分離范圍5000-600000適用于各類生物分子得分離,膠柱長要求80厘米以上。(2)聚丙烯酰胺凝膠

(商品名稱為Bio-gelP)就是一種人工合成得凝膠,它就是由單體丙烯酰胺(Acr)與交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)共聚而成得。不同型號(hào)得Bio-gel用P來表示。P后面得數(shù)字再乘以1000為該型號(hào)得排阻極限,表示當(dāng)某一物質(zhì)得分子量大于或等于某一值時(shí),完全不進(jìn)入凝膠。如Bio-gelP-60(3)瓊脂糖凝膠商品名稱為Sepharose或Bio-GelA,瓊脂糖就是從瓊脂中分離制得得,這種凝膠得優(yōu)點(diǎn)就是孔徑大,排阻極限高。不同型號(hào)得Sepharose用B來表示。B前面得數(shù)字表示凝膠中含干膠得量,如Sepharose6B二、利用溶解度差別得純化方法

影響蛋白質(zhì)溶解度有:自身因素:在同一得外部條件下,不同蛋白質(zhì)具有不同得溶解度,這就是因?yàn)槿芙舛葰w根結(jié)底取決于它們本身得分子結(jié)構(gòu),例如分子所帶電荷得性質(zhì)與數(shù)量、親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)得比例,它們在蛋白質(zhì)分子表面得排列以及由此而產(chǎn)生得偶極矩等。外部因素:很多,其中主要有:①溶液得pH,②離子強(qiáng)度,③介電常數(shù),④溫度。1、pH控制蛋白質(zhì)得沉淀蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí),其靜電荷為零,由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。不同得蛋白質(zhì)具有不同得等電點(diǎn),利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低得原理,可以把蛋白質(zhì)混合物分開。

2、蛋白質(zhì)得鹽溶與鹽析

鹽溶:低濃度時(shí),中性鹽可以增加蛋白質(zhì)得溶解度,這種現(xiàn)象稱為鹽溶。由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后,帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥,而蛋白質(zhì)分子與水分子間得相互作用卻加強(qiáng),因而溶解度增高鹽溶

鹽析:當(dāng)溶液得離子強(qiáng)度增加到一定數(shù)值時(shí),蛋白質(zhì)溶解度開始下降。當(dāng)離子強(qiáng)度增加到足夠高時(shí),例如飽與或半飽與得程度,很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來,這種現(xiàn)象稱為鹽析(saltingout)。大量中性鹽得加入使水得活度降低,原來溶液中得大部分甚至全部得自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子得水化水。導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面得疏水基團(tuán)得暴露鹽析((NH4)2SO4、Na2SO4

)3、有機(jī)溶劑分級分離法

與水互溶得有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇與丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中得溶解度顯著降低。在室溫下,這些有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)沉淀,而且伴隨著變性。有機(jī)溶劑分級分離得機(jī)理有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀得主要原因之一就是改變了介質(zhì)得介電常數(shù)。水就是高介電常數(shù)物質(zhì)(20℃時(shí),80),有機(jī)溶劑就是低介電常數(shù)物質(zhì)(20℃時(shí),甲醇33,乙醇24,丙酮21、4),因此有機(jī)溶劑得加入使水溶液得介電常數(shù)降低。這樣,蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)得離子化程度減弱,水化程度降低,因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子得聚集與沉淀。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀得另一重要方式可能與鹽析相似,與蛋白質(zhì)直接爭奪水化水,致使蛋白質(zhì)聚集而沉淀。4、溫度對蛋白質(zhì)溶解度得影響

在一定溫度范圍內(nèi),約0～40℃之間,大部分球狀蛋白質(zhì)得溶解度隨溫度升高而增加,

在40～50℃以上,大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性,一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解能力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定,因此蛋白質(zhì)得分級分離操作一般都在0℃或更低得溫度下進(jìn)行。

三、根據(jù)電荷不同得純化方法

根據(jù)蛋白質(zhì)得電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物得方法有電泳與離子交換層析兩類

一、電泳(electrophoresis)在外電場得作用下,帶電顆粒,向著與其電性相反得電極移動(dòng),這種現(xiàn)象稱為電泳。

蛋白質(zhì)電泳分離原理:分子大小不同得蛋白質(zhì)所帶電種類不同,凈電荷密度不同,遷移率不同,因此,在電泳時(shí)可以分開。1、電泳得類型

目前電泳得類型很多,最常見得就是區(qū)帶電泳,由于在支持物上電泳時(shí)蛋白質(zhì)混合物被分離成若干區(qū)帶而得名。區(qū)帶電泳按其支持物得物理性狀不同可以分成4類:①濾紙電泳與薄膜電泳(如醋酸纖維薄膜電泳與聚酰胺薄膜電泳);②粉末電泳,支持介質(zhì)就是淀粉、纖維素粉或硅膠粉等,粉末與適當(dāng)?shù)萌軇┱{(diào)與,鋪設(shè)成平板;③細(xì)絲電泳,如尼龍絲與其她人造絲電泳,這就是一類微量電泳;④凝膠電泳,最常用得支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺與瓊脂糖凝膠,前者適于分離蛋白質(zhì)與多核苷酸,后者適于分離核酸,這兩種凝膠電泳得分辨率都很高,

-++—2、聚丙烯酰胺凝膠電泳

(polyacrylamindegelelectrophoresis,簡稱PAGE)也稱圓盤電泳,它就是在區(qū)帶電泳得基礎(chǔ)上發(fā)展起來得。它以聚丙烯酰胺凝膠為支持物,一般制作成凝膠柱或凝膠板,垂直板電泳得優(yōu)越性:①表面積大而薄,便于通冷卻水以降低熱效應(yīng),條帶更清晰;②在同一塊膠板上,可同時(shí)進(jìn)行10個(gè)以上樣品得電泳,便于在同一條件下比較分析鑒定,還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影;③膠板制作方便,易剝離,樣品用量少,分辨率高,不僅可用于分析,可用于制備;④膠板薄而透明,電泳染色后可制成干板,便于長期保存與掃描;⑤可進(jìn)行雙向電泳。按其凝膠得組成系統(tǒng)可分成四種:(1)連續(xù)凝膠電泳:只用一層凝膠,采用相同得pH值與相同得緩沖液。(2)不連續(xù)凝膠電泳:采用二層或三層性質(zhì)不同得凝膠(即:樣品膠、濃縮膠與分離膠)重疊起來,使用兩種不同得pH值(6、7與8、3)與不同得緩沖液(Tris-HCl與Tris-Gly)(3)孔梯度凝膠電泳:采用梯度混合裝置,使制得得凝膠由上至下孔徑逐漸減小(即凝膠濃度由上至下逐漸增高)。梯度凝膠電泳主要適宜于測定球蛋白得相對分子質(zhì)量。(4)SDS—凝膠電泳:在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS(十二烷基硫酸鈉)

(5)等電聚焦凝膠電泳:(IEF)

在電泳支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes),通以直流電后在正負(fù)極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)與線性得pH梯度,蛋白質(zhì)在pH梯度凝膠中受電場力作用下泳動(dòng),它得分離僅僅決定于其本身得等電點(diǎn)。3、凝膠聚合得原理及有關(guān)特性

1、聚合反應(yīng)

凝膠得聚合單體:丙烯酰胺(Acr)與交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis);常用過硫酸銨(AP)為催化劑,四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。TEMED得堿基可催化AP水溶液產(chǎn)生游離氧原子,激活A(yù)cr單體,使其聚合成單體長鏈,在Bis作用下,聚合成網(wǎng)狀凝膠(化學(xué)聚合)。堿性條件下凝膠易聚合,室溫下7、5％得凝膠在pH8、8時(shí)30min聚合,在pH4、3時(shí)約需90min。此外,核黃素亦可為催化劑,聚合需光照(光聚合),故使用不多。

凝膠得孔徑隨著Acr得濃度得變化而變化,也跟Bis得濃度有關(guān)T％=(a+b)/m×l00％c％=b/(a+b)×100％式中a:Acr克數(shù);b:Bis克數(shù);

m:緩沖液體積(ml)。

T:Acr與Bis總濃度

c:交聯(lián)劑百分比再按要求配制不同濃度得凝膠。注意點(diǎn):1、Acr-Bis貯液在自然光、Υ射線、超聲波得引發(fā)下會(huì)發(fā)生聚合,故應(yīng)放在棕色瓶中避光保存。30%得貯液4℃下只能保存一個(gè)月。2、Acr、Bis均為神經(jīng)毒性,勿觸及皮膚與粘膜。3、過硫酸銨應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。定溶至100毫升得T=30%C=2.6%的貯液Acr29.2克Bis0.8克凝膠濃度與被分離物相對分子質(zhì)量得關(guān)系T％

凝膠得孔徑與樣品得遷移率有關(guān)ABT%遷移率分子量：A〈B

電荷：A〈B遷移率隨著凝膠濃度得變化而變化單一條帶不能說明就是一種組分

連續(xù)系統(tǒng):

電泳體系中緩沖液、pH值及凝膠濃度相同,即只有分離膠。帶電顆粒在電場作用下,主要靠電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng),無濃縮效應(yīng)。

4、連續(xù)凝膠系統(tǒng)與不連續(xù)凝膠系統(tǒng)

不連續(xù)系統(tǒng):一般常用二層或三層。由上而下分為:1、樣品膠

2、濃縮膠

3、分離膠電泳體系中各層膠中緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度都不同。

樣品膠:T=3％,c=2、6％,緩沖液為pH6、8得Tris-HCl,其作用就是防止對流,促使樣品濃縮以免被電極緩沖溶稀釋。目前,一般不用樣品膠,直接將樣品加入蔗糖或甘油后加在濃縮膠得表面,同樣具有防止對流及樣品被稀釋得作用。

濃縮膠:

T=5％,c=2、6％得大孔膠,緩沖液為pH6、8得Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷),其作用就是使樣品進(jìn)入分離膠前,被濃縮成窄得區(qū)帶,從而提高分離效果。濃縮效應(yīng)

分離膠:T=7、0％一20%,c=2、5％得小孔膠,緩沖液為pH8、9得Tris-HCl,大部分蛋白質(zhì)在此pH條件下帶負(fù)電荷,樣品在該層被分離。電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng),不連續(xù)PAGE電泳得3種物理效應(yīng):①樣品得濃縮效應(yīng);②凝膠對被分離分子得篩選效應(yīng)(顆粒小得移動(dòng)快,顆粒大得移動(dòng)慢);③一般電泳分離得電荷效應(yīng)。由于這3種物理效應(yīng),使樣品分離效果好,分辨率高。人血清用紙電泳只能分成5～7個(gè)組分,而圓盤電泳則可分成幾十個(gè)清晰得條帶。

①樣品濃縮效應(yīng)(由三種不連續(xù)性造成)

(1)凝膠孔徑得不連續(xù)性

上述三層凝膠中,樣品膠及濃縮膠為大孔膠;分離膠為小孔膠。在電場作用下,樣品顆粒在大孔膠中泳動(dòng)得阻力小,移動(dòng)速度快;當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí),受到得阻力大,移動(dòng)速度減慢。因而在兩層凝膠交界處,樣品遷移受阻而壓縮成很窄得區(qū)帶。濃縮膠分離膠(2)緩沖體系離子成分及pH值得不連續(xù)性

HCl在任何pH溶液中均易解離出Cl—,在電場中遷移率快,走在最前面稱為快離子。在電極緩沖液中,除有Tris外,還有甘氨酸,其pI=6、0,在pH8、9得電極緩沖液中,易解離出甘氨酸根(NH2CH2COO—),而在pH6、7得凝膠緩沖體系中,甘氨酸解離度僅有0、1％～1％,因而在電場中遷移很慢,稱為慢離子。Tris-HClpH=6、7pH=8、9GlyCl-Gly-Tris-HCl帶負(fù)電得蛋白質(zhì),遷移率介于快離子與慢離子之間—+電泳緩沖體系,Tris-Gly,pH=8、3(3)電位梯度得不連續(xù)性

電泳開始后,快離子得快速移動(dòng)會(huì)在其后形成一個(gè)離子強(qiáng)度很低得低電導(dǎo)區(qū),使局部電位梯度增高,將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄得區(qū)帶。②分子篩效應(yīng)

大小與形狀不同得蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時(shí),受阻滯得程度不同而表現(xiàn)出不同得遷移率,這就就是分子篩效應(yīng)。蛋白質(zhì)進(jìn)入pH8、9得同一孔徑得分離膠后,分子小且為球狀得蛋白質(zhì)分子所受阻力小,移動(dòng)快,走在前面;反之,則阻力大,移動(dòng)慢,走在后面,從而通過凝膠得分子篩作用將各種蛋白質(zhì)分成各自得區(qū)帶。。

這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析中得分子篩效應(yīng),后者就是大分子先從凝膠顆粒間得縫隙流出,小分子后流出。③電荷效應(yīng)

在pH8、9得分離膠中,各種帶凈電荷不同得蛋白質(zhì)有不同得遷移率。凈電荷多,則遷移快;反之,則遷移慢。因此,各種蛋白質(zhì)按電荷多少、相對分子質(zhì)量及形狀,以一定順序排成一個(gè)個(gè)區(qū)帶。4、SDS—凝膠電泳:5、等電聚焦

(isoelectricfocusing,IEF)

等電聚焦就是60年代建立得一種高分辨率得蛋白質(zhì)分離與分析技術(shù)。它就是利用蛋白質(zhì)分子或其她兩性電解質(zhì)分子具有不同得等電點(diǎn),從而在一個(gè)穩(wěn)定、連續(xù)、線性得pH梯度中得到分離。

近年來,等電聚焦電泳技術(shù)得分辨率有了很大提高,可以分辨pI只差0、01得生物大分子,這就是等電聚焦最突出得優(yōu)點(diǎn),蛋白質(zhì)等電聚焦電泳得基本原理

在電泳支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes),通以直流電后在正負(fù)極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)與線性得pH梯度,蛋白質(zhì)在pH梯度凝膠中受電場力作用下泳動(dòng),它得分離僅僅決定于其本身得等電點(diǎn)。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子一旦到達(dá)它得等電點(diǎn)位置,分子所帶凈電荷為0,就不能再遷移。如果它向等電點(diǎn)兩側(cè)擴(kuò)散,凈電荷就不再為0,都會(huì)被陰極或陽極吸引回來,直至回到凈電荷為0得位置,因此蛋白質(zhì)在與其本身pI相等得pH位置被聚焦成窄而穩(wěn)定得區(qū)帶。這種效應(yīng)稱之為“聚焦效應(yīng)”。保證了蛋白質(zhì)分離得高分辨率,就是等電聚焦最為突出得優(yōu)點(diǎn)。1、分辨率高,可以分辨pI只差0、01—0、02得生物大分子。2、隨著電泳時(shí)間得延長,區(qū)帶越來越窄。其她電泳區(qū)帶會(huì)越來越寬。3、樣品可以加在膠板得任何部位。4、很稀得樣品都可以分離,且重現(xiàn)性好。5、可以用來測定蛋白質(zhì)或多肽得等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)等電聚焦電泳得特點(diǎn)

pH梯度得產(chǎn)生方式

產(chǎn)生pH梯度得方式有兩種:(1)一種就是人工pH梯度,但由于緩沖液離子得電遷移與擴(kuò)散使pH梯度不穩(wěn)定

(2)另一種就是自然pH梯度,即在凝膠中加入載體兩性電解質(zhì),在電場作用下形成連續(xù)得pH梯度,凝膠得防對流擴(kuò)散作用使pH梯度保持穩(wěn)定。

載體兩性電解質(zhì)得合成

1961年Svensson提出得載體兩性電解質(zhì)得理論基礎(chǔ),1964年Vesterberg利用多乙烯多胺與不飽與酸合成了載體兩性電解質(zhì),它就是由脂肪族多氨基多羧基得異構(gòu)物與同系物組成,它們有連續(xù)改變得氨基與羧基比。合成反應(yīng)就是不飽與酸如丙烯酸與多乙烯多胺得加成反應(yīng),調(diào)節(jié)胺與酸得比例,就可以得到帶有不同比例氨基與羧基得脂肪族多氨基多羧酸,多乙烯多胺鏈越長,加成方式也越多,所得載體兩性電解質(zhì)得pI也越連續(xù),在電場作用下,可以形成平滑而連續(xù)得pH梯度。1966年瑞典LKB公司生產(chǎn)出第一批載體兩性電解質(zhì),商品名為Ampholine,Serva公司得Servalyte,Bio—Rad公司得Biolyte,Pharmacia公司得Pharmalyte,國內(nèi)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所生產(chǎn)得載體兩性電解質(zhì)等。

載體兩性電解質(zhì)形成pH梯度得機(jī)理

載體兩性電解質(zhì)就是一系列多氨基多羧基得混合物,其pI分布在2、5～10之間,在制備聚丙烯酰胺凝膠時(shí),將其混溶在凝膠中,電泳時(shí)在電場作用下,載體兩性電解質(zhì)分子將向正極或負(fù)極方向泳動(dòng),逐漸到達(dá)它們自己得等電點(diǎn)位置而形成一個(gè)連續(xù)得pI梯度雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis)6、毛細(xì)管電泳

(capillaryelectrophoresis)

CE

又稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE)或毛細(xì)管分離法(CESM)。毛細(xì)管電泳就是以彈性石英毛細(xì)管(內(nèi)徑為25-100微米散熱性好)為分離通道,以高壓電場(可高至30千伏)為驅(qū)動(dòng)力,依據(jù)樣品中各組分之間帶電性與分配行為上得差異而實(shí)現(xiàn)得電泳分離得分析方法。它使分析科學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平。

毛細(xì)管電泳得原理

電滲:在水性條件下大多數(shù)固體表面都帶有多余得負(fù)電荷。構(gòu)成毛細(xì)管得熔融石英由硅醇(-SiOH)組成,它在水溶液中以-SiO-形式存在,為了維持電荷平衡,溶液中得正離子吸附至石英表面形成雙電層,當(dāng)兩端施加電壓后這一層正離子趨向負(fù)極移動(dòng),并帶動(dòng)毛細(xì)管中得溶液以液流得形式移向負(fù)極,此現(xiàn)象稱為電滲或電滲流。由于電滲速度一般比樣品得電泳速度大,使得攜帶不同電荷得分子朝一個(gè)方向運(yùn)動(dòng)。不帶電荷得中性分子也能隨電滲流一起移動(dòng)。對荷正電得分子來說,電泳遷移與電滲流效果就是一致得,因而移動(dòng)最快,最先達(dá)到負(fù)極。對荷負(fù)電得分子來說,電泳遷移與電滲流效果相反,因而移動(dòng)最慢,最后達(dá)到負(fù)極。++++++++++++++++++++++++++毛細(xì)管電泳高效分離、快速分析與微量進(jìn)樣得優(yōu)勢,使其在化學(xué)、生命科學(xué)、藥物學(xué)、法醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)學(xué)及食品科學(xué)等領(lǐng)域有著十分廣泛得應(yīng)用,適合于從無機(jī)離子到生物大分子,從荷電粒子到中性分子得分離分析。HPCE最大得優(yōu)點(diǎn)之一就就是應(yīng)用范圍廣泛,可用于分析氨基酸、手性藥物、維生素、殺蟲劑、無機(jī)離子、有機(jī)酸、染料、表面活性劑、肽與蛋白質(zhì)、糖類、低聚核苷酸與DNA限制性內(nèi)切片段,甚至整個(gè)細(xì)胞與病毒顆粒。毛細(xì)管電泳得應(yīng)用離子交換層析及洗脫

(1)采用保持洗脫液成分一直不變得方式洗脫,(2)采用改變洗脫得鹽濃度或pH得方式洗脫,又可以分為兩種:一種就是跳躍式得分段洗脫另一種就是漸進(jìn)式得梯度洗脫。一般分離效果好,分辨率高,特別就是使用交換容量小,對鹽濃度敏感得離子交換劑,多采用梯度洗脫。梯度洗脫得類型通常采用得梯度形式有線性(形),凸形,凹形與復(fù)合形四種,使用最多得就是線性梯度。為獲得這些梯度設(shè)計(jì)出多種梯度混合器

K=(CR—CM)/V四、利用選擇性吸附得純化方法(吸附層析)

某些稱為吸附劑得固體物質(zhì)具有吸附能力,能夠?qū)⑵渌N類得分子吸附在自己得表面,吸附力得強(qiáng)弱因被吸物質(zhì)得性質(zhì)而異。吸附過程涉及范德華相互作用與氫鍵這些非離子吸引力。吸附層析就就是利用待純化得