木霉TP100726菌株固體發(fā)酵及所產(chǎn)纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

木霉TP100726菌株固體發(fā)酵及所產(chǎn)纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)的研究摘要本試驗以在木霉TP100726菌株固體發(fā)酵基質(zhì)中加入木糖渣為目的，研究其在其它條件不變的情況下木糖渣對原始配方中稻草的替換，并進一步考察木霉TP100726菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)及糖化木糖渣的情況。結(jié)果表明，木糖渣可替代20%的稻草粉。纖維素酶的最適溫度為50℃，最適pH為5.0，在50℃，pH=5.0時較穩(wěn)定。以木糖渣為底物，檸檬酸緩沖液，料液比為1:10，溫度為50℃，pH5.0時，糖化木糖渣酶活最高，為833U/ml。為利用工業(yè)廢棄物木糖渣作為原材料發(fā)酵生產(chǎn)可發(fā)酵糖提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。關(guān)鍵字：固體發(fā)酵，纖維素酶，木糖渣，酶學(xué)性質(zhì)AbstractTheexperimentsisinordertojointhexyloseresidueinthesolidfermentationsubstrateofTrichodermaTP100726strains,andstudythexyloseresidueinthecaseofotherconditionsremainunchangedonthereplacementoftheoriginalformulainthestraw,andfurtherinvestigatedtheTrichodermaTP100726straincellulaseproducedbytheenzymaticpropertiesandsaccharificationxyloseresidue.Theresultsshowthatxyloseresiduecanreplace20%ofthestrawpowder.Thecellulase'soptimaltemperatureis50°C,theoptimumpHis5.0,anditismorestableat50°C,pH=5.0.Xyloseresiduesubstrate,citratebuffersolution,solidtoliquidratioof1:10,temperature50°C,pH5.0andthehighestenzymeactivityisachieveto833u/ml.Itprovidesthebasicdataofusexyloseslagasrawmaterialstofermentationproductionoffermentablesugars.Keywords:solidfermentation,celluloseenzyme,xyloseslag,properties2木霉TP100726號菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化2.1試驗材料2.1.1試驗菌種木霉TP100726號菌株，實驗室培養(yǎng)。2.1.2發(fā)酵原料來源木糖渣：由河南濮陽研光鵬程生物制品有限公司提供。半纖維素23.5%、纖維素21.3%、木質(zhì)素6.70%、其它48.50%[12~14]。麩皮：市場購置，粉碎至40~60目，備用。稻草粉：市場購買南陽豆粉：市場購買2.1.3試驗試劑及配制（1）試驗試劑試驗所用試劑見表2.1表2.1試驗所用試劑試劑純度生產(chǎn)廠家磷酸氫二鉀A.R吳江市天源化工有限公司氫氧化鈉A.R鄭州派尼化學(xué)試劑廠生物傳感儀標(biāo)準(zhǔn)液B.R山東省科學(xué)院生物研究所3,5-二硝基水楊酸A.R國藥集團化學(xué)試劑有限公司酒石酸鉀鈉A.R天津市凱通化學(xué)試劑有限公司無水亞硫酸鈉A.R天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心苯酚A.R天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司硫酸銨A.R北京奧博星生物科技有限公司（2）試驗試劑配制[15~18]DNS溶液（3，5-二硝基水楊酸）：稱取3,5-二硝基水楊酸5g，置于300ml水中，逐漸加入NaOH5g,于45℃水浴中攪拌溶解，再加入酒石酸鉀鈉100g，苯酚0.5g，無水亞硫酸鈉2.5g，定容至500ml0.05M檸檬酸緩沖液：A液：稱7.56504g檸檬酸，溶于720ml去離子水中。B液：稱17.646g檸檬酸鈉，溶于1200ml去離子水中。A液和B液慢慢混合，制成pH=5的緩沖液。CMC試劑的配制：稱取1g羧甲基纖維素鈉于100ml檸檬酸緩沖液中，待溶解后置于冰箱中保存。1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)80℃~100℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，充分混勻后，于2.1.4試驗儀器試驗所用儀器如表2.2所示：表2.2試驗所用儀器名稱型號生產(chǎn)廠家生物傳感分析儀SBA-40c山東省科學(xué)院生物研究所電熱恒溫培養(yǎng)箱DH4000B型天津市泰斯特儀器有限公司UV-VIS分光光度計UV1700SHIMADZUCORPORATION滅菌鍋YXQ-LS-30SII上海博訊實業(yè)有限公司電子天平(普通)YP601N上海精密科學(xué)儀器有限公司冷藏陳列柜LSC-269CW星星集團有限公司純水儀Synergy?UV美國Millipore公司冰箱BCD-207AK合肥美菱股份有限公司烘箱DV-600YAMATOSCIENTIFICCO，LTD.電熱恒溫水浴鍋HSQ-3上海智誠分析儀器制造有限公司pH儀RHS-3C上海鵬順科學(xué)儀器有限公司恒溫振蕩搖床智誠ZHWY-103D上海智誠分析儀器制造有限公司離心機TGL－16B上海安亭科技儀器廠-80°C低溫冰箱MDF-U4086S日本SANYO2.1.5培養(yǎng)基活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：取200g去皮洗凈的土豆切成小塊，加水煮爛后濾出上清后定容至1000ml，加入2%葡萄糖，2%瓊脂，107℃滅菌20min基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：60%麩皮，40%稻草粉，3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4固液配比:1:1.5，裝料比:每250ml錐形瓶加6.0g固體成分。121℃高壓蒸汽滅菌25min2.1.6粗酶液的制備當(dāng)菌株培養(yǎng)一定天數(shù)后，用檸檬酸緩沖液按1:10的固液比浸提3小時，然后4000r/min離心10min，取上清即為粗酶液。2.2試驗方法2.2.1木霉TP100726菌株固體發(fā)酵配制培養(yǎng)基原始固體配比:60%麩皮，40%稻草粉，無機鹽溶液:3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4發(fā)酵培養(yǎng)基：固體基質(zhì)按正交表（表2.3）中組合進行配制，不足6.0g的用稻草來補。無機離子組成：3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4固液配比:1:1.5，裝料比:每250ml錐形瓶加6.0g固體成分（1）設(shè)計正交表表2.3正交實驗各因素與水平因素麩皮木糖渣豆粉11（20%）1（10%）1（0%）22（40%）2（20%）2（1%）33（60%）3（30%）3（2%）（2）在超凈工作臺里，將培養(yǎng)基放入，紫外滅菌15min，然后無菌操作接入一環(huán)孢子，放于28℃（3）在培養(yǎng)過程中，從第五天開始，每隔24h取發(fā)酵基質(zhì)一瓶，加入60ml緩沖液（固體裝料質(zhì)量：緩沖液體積=1:10），浸提3-5h（4）取浸提液于離心管中，4000r/min離心10min，上清液即為粗酶液。（5）根據(jù)2.2.4中酶活測定方法測定粗酶液的FPA酶活和CMC酶活。2.2.2觀察表面觀察用PDA培養(yǎng)基活化保存的菌株，并在培養(yǎng)過程中觀察木霉TP100726菌株菌落形態(tài)隨時間變化的情況。霉菌形態(tài)觀察用乳酸石碳酸棉蘭染色液對木霉TP100726菌株進行染色并觀察，首先于潔凈載玻片上滴一滴乳酸碳酸棉蘭染色液，再用解剖針從霉菌菌落的邊緣取少量帶有孢子的菌絲置于染色液中。細(xì)心地將菌絲挑散開，小心地蓋上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡。最后置顯微鏡下進行觀察。2.2.3制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線取5支試管，按表2.4加入1000μg/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液及去離子水，得到從100μg/mL~800μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)管。分別吸取上述不同濃度的葡萄糖溶液1ml，DNS試劑1ml，混合均勻，沸水浴加熱7min，取出，用水冷卻，用去離子水定容至10ml，置分光光度計上540nm處測定光密度值，以空白管(0管)做對照。表2.4標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液配比管號1000μg/ml葡萄糖（ml）H2O（ml）葡萄糖濃度C（g/L）001001190.12280.23460.44640.65820.82.2.4酶活測定方法[19~21]FPA測定：取0.5ml適當(dāng)稀釋的粗酶液，加入pH5.0的0.05mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液0.5ml，混勻后加入1×6cm新華濾紙條，空白對照中加入1mlDNS，于50℃保溫1h（先預(yù)熱5min），然后加入1mlDNS沸水浴7min，流水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至10ml，在540nm處測定ODCMC酶活測定：取0.5ml適當(dāng)稀釋粗酶液，加入0.5ml由pH5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制而成的1%CMC-緩沖液，空白對照中加入1mlDNS，50℃保溫30min（先預(yù)熱5min），然后加入1mlDNS沸水浴7min，流水冷卻至室溫，定容至10ml，540nm處測定OD實驗中酶活力定義（IU）：每克培養(yǎng)基中木霉TP100726號菌株每分鐘產(chǎn)生的葡萄糖的微摩爾數(shù)。即每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生葡萄糖的微摩爾數(shù)乘以緩沖液浸提比。2.3實驗結(jié)果2.3.1觀察結(jié)果菌株長勢觀察菌落（如圖2.1）初為白色，致密，圓形，向四周擴展，后從菌落中央產(chǎn)生綠色孢子，中央變成綠色。菌落周圍有白色菌絲的生長帶。分生孢子（如圖2.2）呈綠色，為橢圓球狀，菌絲呈不規(guī)則分枝形狀。表2.5為木霉TP100726菌株隨時間變化的生長情況：表2.5木霉TP100726菌株生長情況培養(yǎng)時間生長情況24h局部有極少量白色菌絲，大部分培養(yǎng)基裸露48h白色菌絲量增加，形成塊狀，但菌絲量仍較少，無孢子72h白色菌絲布滿培養(yǎng)基表面，呈棉絮狀，其上長有一層綠色孢子96h培養(yǎng)及表面布滿綠色孢子，只可見少量白色菌絲96h以后培養(yǎng)基中滿是綠色孢子，無菌絲圖2.1木霉TP100726菌株生長情況圖2.2菌絲及孢子形態(tài)2.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作以葡萄糖濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2.3所示：圖2.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（公式1）x為OD值，y為葡萄糖含量，單位為g/L。2.3.3酶活計算公式（公式2）y為葡萄糖含量的數(shù)值（由標(biāo)準(zhǔn)曲線和所測OD值計算可得），N為粗酶液稀釋倍數(shù)，n為微摩爾數(shù)與摩爾數(shù)之間換算關(guān)系，為106，10為緩沖液所用體積與固體質(zhì)量之間比值，180.0為葡萄糖的摩爾質(zhì)量，60為反應(yīng)時間60min，1000為y的單位從g/L換算成g/ml。由以上可得OD值和酶活的直接計算公式(公式3）2.3.4正交實驗結(jié)果本次正交實驗?zāi)康氖谴_定培養(yǎng)基中麩皮、木糖渣、豆粉和稻草粉這幾種物質(zhì)的最優(yōu)配比，以得出木糖渣代替稻草粉的最大量。表2.6和表2.7分別為本實驗測定的濾紙酶活和CMC酶活。表2.6濾紙酶活編號麩皮木糖渣豆粉結(jié)果11（20%）1（10%）1（0%）38.264212（20%）2（1%）38.551313（30%）3（2%）31.60342（40%）1240.848522343.545623137.23073（60%）1341.939832142.398933241.652K136.13940.35039.297K240.54141.49840.350K341.99636.82839.029R5.8574.6701.32110（原始配方）60%0044.350表2.7CMC酶活編號麩皮木糖渣豆粉結(jié)果11（20%）1（10%）1（0%）39.355212（20%）2（1%）41.996313（30%）3（2%）38.09242（40%）1238.379522341.250623137.28873（60%）1339.125832141.422933240.618K139.81438.95339.355K238.97241.55640.331K340.38838.66639.489R1.4162.8900.97610（原始配方）60%0041.996從以上兩表中可以看出，麩皮、木糖渣、豆粉三因素對纖維素酶活的影響因素大小順序為：濾紙酶活中，麩皮>木糖渣>豆粉，CMC酶活中，木糖渣>麩皮>豆粉。由此可見，豆粉對纖維素酶活的影響較小。從均值來看，兩種酶活中均表現(xiàn)出培養(yǎng)基固體物質(zhì)最優(yōu)配比為麩皮60%，木糖渣20%，豆粉1%?？梢猿醪秸J(rèn)為木糖渣可以代替20%的稻草粉。但原配方中沒有這種組合，為了能更準(zhǔn)確的確定最佳配比，仍需再次做一組培養(yǎng)實驗來進行對比。但由于各種原因，本實驗來不及做重復(fù)實驗了，這些數(shù)據(jù)只有留待下屆學(xué)生繼續(xù)完成。3纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)的研究3.1實驗材料3.1.1實驗原料木霉TP100726菌株所產(chǎn)纖維素酶粗酶液，由所有發(fā)酵料混合浸取所得。3.1.2實驗試劑及儀器見表2.1及表緩沖液配制不同pH的檸檬酸緩沖液，配制方法如表3.1。表3.1不同pH的檸檬酸緩沖液pH0.05M檸檬酸(ml)0.05M檸檬酸三鈉(ml)4.560605.040805.526946.0131073.2實驗方法3.2.1測定方法FPA及CMC酶活測定方法見2.2.3.葡萄糖測定方法：水解液中葡萄糖的測定采用由山東科學(xué)院生物研究所研發(fā)的SBA-40E生物傳感分析儀進行測定。測定方法如下：準(zhǔn)確吸取稀釋適當(dāng)?shù)臉悠?5μL注入到已經(jīng)定好標(biāo)的生物傳感分析儀中，數(shù)據(jù)結(jié)果換算成樣品中葡萄糖再乘以稀釋倍數(shù)，計算出水解液中葡萄糖。木糖渣酶活：木糖渣為底物的酶活定義：每克培養(yǎng)基中木霉TP100726菌株每小時產(chǎn)生的葡萄糖的微摩爾數(shù)。即每毫升酶液每小時產(chǎn)生葡萄糖的微摩爾數(shù)乘以浸提比。計算方法：（公式4）T為SBA-40E生物傳感分析儀制定的數(shù)值N為稀釋倍數(shù)。纖維素轉(zhuǎn)化率：定義為糖化木糖渣中所產(chǎn)生的葡萄糖的質(zhì)量占所加木質(zhì)纖維素的量的百分率。計算方法：纖維素轉(zhuǎn)化率=葡萄糖質(zhì)量*100/木質(zhì)素質(zhì)量（公式5）3.2.2粗酶液稀釋倍數(shù)的確定將粗酶液稀釋至50倍、100倍、200倍、400倍，按照2.2.3中的方法測定FPA及CMC酶活。3.2.3酶學(xué)性質(zhì)研究（1）酶液最適溫度將合適稀釋倍數(shù)的酶液分別在45°C、50°C、55°C、60°C下測定酶液的FPA和CMC酶活。（2）酶的熱穩(wěn)定性取40ml稀釋后的酶液，分裝于5個試管中，分別置于45°C、50°C、55°C、60°C恒溫水浴鍋中進行保溫3h，從各個試管中取出0.5ml酶液，測定在各個溫度下保溫過的酶的FPA和CMC酶活。以酶活最高的那個溫度下所得到的測定值為參照，其他溫度下測得的酶活力與最高值相比。（3）酶最適pH值在室溫條件下，配置不同pH值的緩沖液，pH值設(shè)定為4.5、5.0、5.5、6.0，在最適的反應(yīng)溫度下，測定不同pH值對酶活力的影響。（4）酶的pH值穩(wěn)定性將粗酶液放入不同pH值的緩沖液中，混勻后封口于50°C下恒溫水浴3h，測定在不同pH條件下剩余的酶活，以酶活最高的那個pH值條件下所得到的測定值為參照，其他pH值條件下測得的酶活力與最高值相比。3.2.4粗酶液糖化木糖渣條件初步研究（1）木糖渣糖化的最適pH檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液摩爾濃度為0.05mol/L，料液比1:10，酶解溫度50°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min。考察水解pH對酶解的影響。pH分別設(shè)置為4.5、5.0、5.5、6.0。酶解48h后取樣測定水解液中葡萄糖濃度。（2）木糖渣糖化的最適溫度在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液濃度為0.05mol/L，料液比1:10，水解pH5.0，搖床轉(zhuǎn)速180r/min下，考察溫度對酶解的影響。溫度分別設(shè)置為45°C、50°C、55°C、60°C。酶解48h后取樣測定水解液中葡萄糖濃度。（3）料液比對酶解的影響為考察不同料液比（1:20、1:15、1:10、1:8）對木糖渣糖化的影響，在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液摩爾濃度為0.05mol/L，酶解溫度50°C，pH5.0搖床轉(zhuǎn)速180r/min下，48h后測定水解液中葡萄糖濃度，計算木糖渣中纖維素轉(zhuǎn)化率。（4）粗酶液糖化不同木質(zhì)纖維素檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液摩爾濃度為0.05mol/L，料液比1:10，水解pH為5.0，酶解溫度50°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，選用木糖渣，玉米芯，稻草粉，酶解48h后測定水解液中葡萄糖濃度。（5）糖化木糖渣最適緩沖液選擇配制0.05mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，磷酸緩沖液，乙酸-乙酸鈉緩沖液，按照木糖渣與混合液比例為1:10與50°C，180r/min下酶解48h，測定水解液中葡萄糖濃度。3.3結(jié)果與分析3.3.1酶液稀釋倍數(shù)的確定粗酶液進行反應(yīng)時，如果酶液濃度過高，就會使大部分酶分子不能接觸到底物，從而影響酶活的準(zhǔn)確度；如果酶液濃度過低，則會使酶分子不能與底物良好接觸，同樣會影響酶活的準(zhǔn)確度。因此，需要在實驗前確定好酶液的稀釋倍數(shù)，使其能最好的與底物進行反應(yīng)，盡量減小實驗誤差。圖3.1粗酶液稀釋倍數(shù)實驗數(shù)據(jù)根據(jù)圖3.1所示及所測吸光度值的大小分析可得，濾紙酶活在酶液稀釋50倍~100倍區(qū)間稀釋倍數(shù)最佳，CMC酶活在酶液稀釋100倍~200倍區(qū)間稀釋倍數(shù)最佳。3.3.2酶學(xué)性質(zhì)研究（1）纖維素酶最適溫度溫度是影響酶活性及酶穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)。一般說來，酶在一定的溫度范圍內(nèi)，催化反應(yīng)的速率和溫度成正比，溫度越高，反應(yīng)速率越快。但在超出一定范圍后，高溫可使酶蛋白失活，酶的反應(yīng)速率就會迅速下降。如圖3.2所示，木霉TP100726號菌株所產(chǎn)粗酶液在45~50°C時，其CMC酶活與FPA均隨溫度的升高而增加，50~60°C時，其CMC酶活與FPA則下降。故纖維素酶的最適溫度為50℃，其濾紙酶活為48IU，CMC酶活為63IU圖3.2粗酶液最適反應(yīng)溫度（2）纖維素酶最適pH纖維素酶活力與pH值密切相關(guān)，影響酶活的原理可能有以下幾個方面：過酸、過堿會影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至使酶變性而失活；同時pH還會影響底物分子與酶分子的中間產(chǎn)物解離狀態(tài)，這些中間產(chǎn)物的離子化狀態(tài)與酶的專一性及酶分子的活力中心的構(gòu)象有關(guān)。一般情況下，木霉屬所產(chǎn)纖維素酶多為酸性纖維素酶，如圖3.3所示，纖維素酶受pH的影響較大，pH在4.5~5.0時，纖維素酶活性逐漸升高，而在5.0~6.0時纖維素酶活性則下降較快，可見該纖維素酶并不能在中堿性條件下發(fā)揮作用。所以木霉TP100726菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶促反應(yīng)最適pH為5.0，其濾紙酶活為25IU，CMC酶活為106IU。圖3.3粗酶液最適反應(yīng)pH（3）纖維素酶的熱穩(wěn)定性纖維素酶在一定的溫度下可達(dá)到較高酶活，但是在該溫度下并不一定是穩(wěn)定的，長時間保溫下容易變性失活，因此在不同溫度下考察其剩余酶活力情況，對纖維素酶的保存及纖維素酶用于長期水解木質(zhì)纖維素都有重要的意義。如圖3.4所示，在45~50°C保溫3h后其酶活力損失較少，而在50~60°C時，纖維素酶酶活力則迅速下降，此時可以看到大量的酶蛋白沉淀。所以纖維素酶可在50℃圖3.4纖維素酶粗酶液熱穩(wěn)定性（4）纖維素酶的酸堿穩(wěn)定性在一定溫度下，pH值對酶穩(wěn)定性會產(chǎn)生很大的影響，通過研究不同pH值條件下酶的酸堿穩(wěn)定性以期找出最大限度發(fā)揮酶的催化活性的pH值。從圖3.5中可知，木霉TP100726菌株所產(chǎn)纖維素酶酶50°C時，pH在5.0左右時較為穩(wěn)定，pH低于5.0或高于5.5均導(dǎo)致纖維素酶活力下降。圖3.5纖維素酶粗酶液酸堿穩(wěn)定性3.3.3粗酶液糖化木糖渣研究（1）糖化木糖渣的最適pH酶解中的pH對木糖渣的糖化效果的影響從圖3.6可以看出，粗酶液糖化木糖渣的效果受糖化過程中pH變化的影響較小。pH在4.5提高至5.0時，葡萄糖量由3.2%（%為1ml粗酶液中葡萄糖所占的百分量）提高至3.3%。將pH提高至5.0后，葡萄糖量迅速下降，由3.3%降至3.0%。由此可知pH在5.0時效果最佳。圖3.6糖化木糖渣最適酶解pH（2）糖化木糖渣的最適溫度最適的酶解溫度有利于提高酶解效果，提高水解液中葡萄糖的含量，溫度過高或過低都會影響酶解反應(yīng)的效果。木霉多產(chǎn)粗酶液酶解纖維素的最適溫度多在45~50°C之間。由圖3.7可知木霉TP100726菌株所產(chǎn)粗酶液在50°C左右均能夠很好的糖化木糖渣，但以50°C時最佳，此時葡萄糖濃度為3.4%。圖3.7糖化木糖渣最適溫度選擇（3）料液比對木糖渣糖化的影響料液比對酶解的影響結(jié)果從圖3.8可以看出，隨著料液比的提高，葡萄糖量逐漸增加，纖維素轉(zhuǎn)化率逐漸降低。料液比從1:20增加到1:10時，葡萄糖量明顯提高，從1:10增加至1:8時，葡萄糖量增幅并不明顯，纖維素轉(zhuǎn)化率明顯下降。酶解液中糖濃度過低不利于發(fā)酵實驗，故選1:10作為最佳料液比，此時葡萄糖含量為3.6%。圖3.8不同料液比對糖化木糖渣的影響（4）粗酶液糖化不同木質(zhì)纖維素情況以木糖渣、玉米芯、稻草為水解對象，考察木霉TP100726菌株所產(chǎn)粗酶液對不同的木質(zhì)纖維素水解情況。由圖3.9可知，在酶解48h后，酶解木糖渣所得葡萄糖量為3.8%。酶解稻草粉所得葡萄糖量為3.1%，玉米芯為3.0%。由此可見，糖化木糖渣水解的最佳底物為木糖渣。圖3.9不同種類木質(zhì)纖維素水解情況（5）緩沖液體系選擇pH緩沖系統(tǒng)對維持生物的正常pH值、正常生理環(huán)境起重要作用。不同的緩沖體系使所產(chǎn)酶產(chǎn)生不同的酶解效果。由圖3.10可知，三種緩沖體系對糖化木糖渣影響中以檸檬酸-檸檬酸鈉為宜，此時葡萄糖含量為3.8%。圖3.10不同緩沖液體系對糖化木糖渣的影響4結(jié)論與討論木霉TP100726菌株原始配方中沒有木糖渣，本實驗將木糖渣添加進去，考察了木糖渣對稻草粉替代的可能，并對改良后發(fā)酵的纖維素酶粗酶液水解木糖渣進行探所，結(jié)果如下：1、木霉TP100726菌株固體培養(yǎng)基中固體物質(zhì)配比為麩皮60%，木糖渣20%，豆粉1%，稻草粉20%。木糖渣可替代原始配方中稻草粉含量的20%左右。2、木霉TP100726菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為5.0，在50℃，3、以木糖渣為底物，檸檬酸緩沖液，料液比為1:10，溫度為50℃，pH5.0但是，由于時間的關(guān)系，本實驗還有很多方面需要改進。培養(yǎng)基固體配比實驗中只是優(yōu)化了一步，還需做進一步的優(yōu)化實驗。如對本實驗所得配比結(jié)果與其它幾組酶活較高的實驗組進行對比，進一步確定最優(yōu)的配比方案。影響酶活性質(zhì)的因素除了溫度和pH外，還有很多其他因素對纖維素酶的酶活有較大影響。如：金屬離子、酶解反應(yīng)時間、底物濃度等，這些均需要做進一步的研究。參考文獻[1]劉燕,張宏福,孫哲.纖維素酶的分子生物學(xué)與基因工程研究進展[J].飼料工業(yè),2007,28(18):11--14.[2]高培基.纖維素酶降解機制及纖維素酶分子結(jié)構(gòu)與功能研究進展[J].自然科學(xué)進展,2003,13(1):21--29.[3]顧方媛,陳朝銀,石家驥等.纖維素酶的研究進展與發(fā)展趨勢[J].微生物學(xué)雜志,2008,28(1):83--86.[4]SukumaranRK,SinghaniaRR,PandeyA.Microbialcullulasesproduction,applicationsandchallenges[J].Sci[5]WheelerMarshaM,ZhouXG,ScharfMichaelE,etal.MoLecularandbiochemicalmarkersformonitoringdynamicshiftsofcelluolyticprotozoainReticulitermesflavipes[J].InsectBiochemistryandMolecularBiology,2007,37(12):1366-1374.[6]陳小堅.纖維素酶的分子生物學(xué)研究及應(yīng)用進展[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報,2006,23(4):48--51.[7]龐宗文,董志剛,梁靜等.高溫放線菌6PL1纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].現(xiàn)代食品科技,2006,22(2):20~23.[8]Zhang,Y.H.P,Lynd,L.R.Afunctionallybasedmodelforhydrolysisofcullulosebyfungalcullulase[J].Biotechnol.Bioeng,2006,94(5):888–898.[9]吳翔,陳強,徐麗華.一株降解纖維素的高溫放線菌的篩選及其產(chǎn)酶條件研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2007,26(增刊):101--104.[10]李師翁,孔凱,馮佳麗.產(chǎn)低溫纖維素酶放線菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究[J].生物技術(shù)通報,2010,7:216--220.[11]徐揚.纖維素酶高產(chǎn)菌的誘變選育及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[D].吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.[12]KrisztinaKovács,GeorgeSzakacs,GuidoZacchi.Comparativeenzymatichydrolysisofpre-treatedsprucebysupernatants,wholefermentationbrothsandwashedmyceliaofTrichodermareeseiandTrichodermaatroviride[