重組DNA技術(shù)的基本工具課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具

基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。（1）原理：（2）操作水平：（3）操作環(huán)境：（4）操作對象：（5）結(jié)果：基因重組分子水平生物體外基因賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。什么是基因工程？基因工程理論基礎(chǔ)的分析【問題探究1】為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？（1）DNA的基本組成單位都是

。（2）DNA分子都遵循

配對原則。（3）雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是

?！締栴}探究2】為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？（1）

是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位。（2）遺傳信息的傳遞和表達(dá)都遵循

。（3）生物界共用一套

。四種脫氧核苷酸規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)基因中心法則遺傳密碼堿基互補(bǔ)

番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降?？茖W(xué)家通過精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。

DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？

這些“分子工具”各具有什么特征呢？

到社會(huì)中去那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運(yùn)輸車限制性內(nèi)切核酸酶：DNA連接酶：載體：準(zhǔn)確切割DNA分子將DNA片段連接起來

將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”閱讀教材P71，回答下列問題：

1.限制酶的來源？2.限制酶的特點(diǎn)？3.限制酶的作用部位？4.限制酶的識別序列長度？5.限制酶的切割結(jié)果？簡稱限制酶

限制酶是用生物屬名的頭一個(gè)字母與種加詞的頭兩個(gè)字母，組成了3個(gè)字母的略語，以此來表示這個(gè)酶是從哪種生物中分離出來的。限制酶的命名是根據(jù)細(xì)菌種類而定，以EcoRI為例：

E：Escherichia

（屬名）

co：coli

（種加詞）

R：RY13（品系）

I：分離出的第一種限制酶資料卡

限制酶名字的由來EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個(gè)字母R型菌株從中分離的第一種限制酶EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一種限制酶。SmaⅠ：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一種限制酶。流感嗜血桿菌的d菌株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為：

。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ資料卡

限制酶名字的由來【思考】你能根據(jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。3.特點(diǎn)：

4.作用部位:能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。特定部位的磷酸二酯鍵還記得磷酸二酯鍵在哪嗎

1.來源：

主要從原核生物中分離純化出來的

2.種類：

數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”TACGGCATGCGCAT5′3′5′3′相鄰兩個(gè)核苷酸之間的鍵：磷酸二酯鍵CH2

HOHHHHH堿基

磷酸

5’4’3’2’1’脫氧核苷酸5.識別序列長度？大多數(shù)限制酶的識別序列由6個(gè)核苷酸組成；EcoRⅠSmaⅠTaqⅠ5’…T-C-G-A…3’3’…A-G-C-T…5’也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。特點(diǎn)1：都可以找到一條中心軸線；特點(diǎn)2：中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。（1）實(shí)例1——EcoRⅠ限制酶切割*EcoRⅠ識別序列為GAATTC*EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端（2）實(shí)例2——SmaⅠ限制酶切割*SmaⅠ識別序列為CCCGGG*SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵平末端6.切割結(jié)果:【練習(xí)1】：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATCAATTAGCTGATC思考：同種限制酶切割的黏性末端一定相同嗎？不同種限制酶切出的黏性末端一

定不同嗎？

不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G用DNA連接酶連接兩個(gè)片段之間的磷酸二酯鍵2025/3/7將兩個(gè)雙鏈DNA片段“連接”起來的酶1.概念：二、DNA連接酶——“分子縫合針”2.作用：

3.種類：

（1）E.coliDNA連接酶：來源于大腸桿菌，只連接黏性末端AGTCATTCGATATCGATC兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來。將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的

。磷酸二酯鍵3.種類：

（2）T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，既能連接黏性末端，又能連接平末端（但連接平末端的效率相對較低）。*基因工程中通常形成黏性末端類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源

功能只能將具有互補(bǔ)__________

的DNA片段連接起來“縫合”兩種末端，但連接

_________的效率相對較低結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的

。大腸桿菌T4噬菌體黏性末端平末端磷酸二酯鍵注意：DNA連接酶沒有識別序列的特異性、只與末端類型有關(guān)

【新舊銜接】DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？種類DNA聚合酶DNA連接酶不同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)作用結(jié)果模板相同點(diǎn)催化單個(gè)核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵催化形成與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈，形成新的雙鏈DNA分子催化具有互補(bǔ)黏性末端或平末端的DNA片段連接起來，形成重組DNA分子需要不需要①化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)②都是催化形成磷酸二酯鍵與DNA相關(guān)的五種酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個(gè)片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈練習(xí)2：根據(jù)所學(xué)知識，完成以下填空：

①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④⑤②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵怎樣才能將外源基因送入細(xì)胞呢？通常是利用質(zhì)粒作為載體，將基因送入細(xì)胞。為什么不能直接將外源基因送入細(xì)胞呢？

游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)、游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。若將目的基因插入載體，由于載體可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，隨著細(xì)胞分裂，載體會(huì)帶著目的基因存在于每個(gè)子代細(xì)胞中。這樣，基因工程才有意義。質(zhì)粒:將外源基因送入受體細(xì)胞,

在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。1.作用：動(dòng)植物病毒:噬菌體:2.種類：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物病毒噬菌體三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體—“分子運(yùn)輸車”2.最常用的載體——質(zhì)粒終止子:

轉(zhuǎn)錄的終點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)控作用。啟動(dòng)子:

RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的序列復(fù)制原點(diǎn):

DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)標(biāo)記基因:便于重組DNA的篩選與鑒定其基因?qū)儆诩?xì)胞質(zhì)基因問題1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？問題2：要使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，載體需要具備什么條件？問題3：我們用肉眼看不到載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？條件①：具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；條件②：能在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制；條件③：具有標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。條件④：載體DNA必須是安全的，不會(huì)對受體細(xì)胞有害?！咎骄俊糠治鰵w納載體需要具備的條件抗蟲棉Bt抗蟲蛋白蘇云金桿菌取出轉(zhuǎn)移通過本節(jié)的學(xué)習(xí)，現(xiàn)在你能描述如何使用這三種工具來獲得抗蟲棉嗎？1.實(shí)驗(yàn)原理DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對它們進(jìn)行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精DNA能溶于物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液在一定溫度下（沸水?。珼NA被二苯胺試劑染成藍(lán)色初步分離DNA和蛋白質(zhì)溶解DNA鑒定DNA00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度四、實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。

（注意：不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）(1)選材：(2)試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用2.材料用具研磨液、二苯胺的配制方法課本P117取材、研磨過濾分離鑒定結(jié)果觀察稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨。SDS（十二烷基疏酸鈉）可使蛋白質(zhì)變性與DNA分離EDTA（乙二胺四乙酸）DNA酶抑制劑，可防止細(xì)胞破碎后DNA降解DNATris（三羥甲基氨基甲烷）提供緩沖體系，使DNA在緩沖體系中呈穩(wěn)定狀態(tài)研磨液3.方法步驟

(1)研磨的目的

破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中(2)研磨時(shí)間不宜太長

防止研磨時(shí)產(chǎn)生的熱量影響DNA的提取量(3)有條件的可以在材料處理的過程中加入纖維素酶、果膠酶

研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力取材、研磨過濾分離鑒定結(jié)果觀察

在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。取材、研磨過濾分離鑒定結(jié)果觀察(1)研磨的目的破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中(2)研磨時(shí)間不宜太長防止研磨時(shí)產(chǎn)生的熱量影響DNA的提取量(3)有條件的可以在材料處理的過程中加入纖維素酶、果膠酶研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力①上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質(zhì)？

可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)②低溫放置幾分鐘的作用

可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；

抑制DNA分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出；

低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少其斷裂；取材、研磨過濾分離鑒定結(jié)果觀察

在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。(1)攪拌時(shí)應(yīng)輕緩、并沿一個(gè)方向

減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子(2)酒精預(yù)冷的作用:

同“低溫放置的作用”取材、研磨過濾分離鑒定結(jié)果觀察

取兩支20mL的