T-GRM 101-2024 深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范

ICS13.020.01CCSD00/09GRM范ProductionProcessSpecificationsforDarkSeptateEndophytesExtraceIT/GRM101—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 3.1深色有隔內(nèi)生真菌darkseptateendophytes 3.2胞外代謝物extracellularmetabolite 4產(chǎn)品分類 5要求 5.1人員 5.2生產(chǎn)環(huán)境 5.3生產(chǎn)設(shè)施與設(shè)備 5.4產(chǎn)品外觀（感官） 25.5產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo) 25.6成分組成要求 26生產(chǎn)技術(shù) 26.1菌種要求 26.2母種培養(yǎng) 26.3液體菌劑搖瓶培養(yǎng) 36.4液體菌劑發(fā)酵培養(yǎng) 36.5胞外代謝物制備 36.6胞外代謝物粉劑制備 36.7胞外代謝物膠囊制備 37產(chǎn)品參數(shù)檢測 37.1外觀測定 37.2濃度測定 37.3水分測定 37.4pH值測定 47.5粘度測定 47.6生長素測定 47.7保質(zhì)期 47.8胞外代謝物化合物組分測定 48檢驗(yàn)規(guī)則 48.1組批規(guī)則 48.2取樣方法 48.3檢驗(yàn)項目 48.4檢查與驗(yàn)收 48.5判定規(guī)則 4T/GRM101—20249包裝、標(biāo)識、運(yùn)輸和貯存 49.1包裝 49.2標(biāo)識 59.3運(yùn)輸 59.4貯存 5附錄A（規(guī)范性）胞外代謝物生長素含量測定比色法 6A.1方法提要 6A.2試劑和溶液 6A.3儀器 6A.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 6A.5測定步驟 6A.6結(jié)果計算 6A.7允許誤差 6附錄B（規(guī)范性）胞外代謝物代謝組測定高效液相色譜質(zhì)譜法 7B.1方法提要 7B.2試劑和材料 7B.3儀器設(shè)備 7B.4樣品制備 7B.5高效液相色譜參考條件 7B.6質(zhì)譜參考條件 7B.7結(jié)果分析 8B.8允許誤差 8T/GRM101—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。為使我國礦區(qū)生態(tài)修復(fù)菌劑的生產(chǎn)工藝和應(yīng)用技術(shù)走上科學(xué)化，規(guī)范化軌道，指導(dǎo)礦區(qū)微生物復(fù)墾工程建設(shè)，促進(jìn)礦區(qū)生態(tài)環(huán)境的恢復(fù)與可持續(xù)發(fā)展，特制定《深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范》標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)主要規(guī)定了深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物的術(shù)語和定義、產(chǎn)品分類、要求、生產(chǎn)技術(shù)、產(chǎn)品參數(shù)檢測、檢驗(yàn)規(guī)則、包裝、標(biāo)識、運(yùn)輸和貯存。本文件由中關(guān)村綠色礦山產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟提出并歸口。本文件起草單位：中國礦業(yè)大學(xué)（北京）礦山生態(tài)修復(fù)研究院、西安科技大學(xué)西部礦山生態(tài)環(huán)境修復(fù)研究院、天山實(shí)驗(yàn)室、北京合生元生態(tài)環(huán)境工程技術(shù)有限公司。本文件主要起草人：畢銀麗、彭蘇萍、王淑惠、解琳琳、張延旭、王坤、全文智、肖禮、武超、柯增鳴、白雪蕊1T/GRM101—2024深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物的術(shù)語和定義、產(chǎn)品分類、要求、生產(chǎn)技術(shù)、產(chǎn)品參數(shù)檢測、檢驗(yàn)規(guī)則、包裝、標(biāo)識、運(yùn)輸和貯存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于礦區(qū)生態(tài)修復(fù)深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物產(chǎn)品。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB20287-2006農(nóng)用微生物菌劑GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T8170-2008數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T603-2023化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1深色有隔內(nèi)生真菌darkseptateendophytes一類定殖于宿主植物根表皮、皮層，甚至維管束組織細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙，形成深色有隔菌絲和微菌核特征結(jié)構(gòu)的內(nèi)生真菌。3.2胞外代謝物extracellularmetabolite活菌在代謝過程中產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的低分子量物質(zhì)。4產(chǎn)品分類按劑型分為液體、粉劑和膠囊型。5要求5.1人員工作人員應(yīng)熟練掌握菌種生產(chǎn)所需的專業(yè)技術(shù)，并注意保持個人衛(wèi)生。進(jìn)入生產(chǎn)場地應(yīng)穿戴經(jīng)清洗干凈且消毒處理的工作服、口罩、鞋、帽等。5.2生產(chǎn)環(huán)境環(huán)境空氣質(zhì)量應(yīng)符合GB3095-2012環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。水電安裝合理，通風(fēng)良好，排氣通暢，無菌區(qū)與有菌區(qū)有效隔離。5.3生產(chǎn)設(shè)施與設(shè)備生產(chǎn)應(yīng)具備NY/T528-2010食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程規(guī)定的相關(guān)設(shè)施設(shè)備。應(yīng)具有天平、高壓滅菌鍋、凈化工作臺或接種箱、調(diào)溫設(shè)備、除濕設(shè)備、恒溫、冰箱、顯微鏡等常規(guī)用具。高壓滅菌鍋應(yīng)使用經(jīng)有資質(zhì)部門生產(chǎn)與檢驗(yàn)的安全合格產(chǎn)品。壓力容器應(yīng)符合GB/T150-2024壓力容器的規(guī)定。配料、2T/GRM101—2024分裝、滅菌、冷卻、接種、培養(yǎng)等各環(huán)節(jié)的設(shè)施應(yīng)配套。冷卻室、接種室、培養(yǎng)室和貯存室都要有滿足其功能的基本配套設(shè)施，如控溫設(shè)施、消毒設(shè)施。5.4產(chǎn)品外觀（感官）液體菌劑應(yīng)為澄清溶液，顏色為深褐色或深棕色；固體粉劑產(chǎn)品應(yīng)松散，灰白色粉末狀，具有吸水性；膠囊菌劑由食用級藥用明膠和淀粉制成的紅黃、藍(lán)白、透明等膠囊殼包裝固體粉劑。5.5產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物的技術(shù)指標(biāo)應(yīng)符合表1規(guī)定。表1深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝的技術(shù)指標(biāo)———55——1665.6成分組成要求深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物含有有機(jī)酸及其衍生物、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子、有機(jī)雜環(huán)化合物、有機(jī)氧化合物、有機(jī)氮化合物等11種化合物。成分占比應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物中不同類型化合物組分含量占比6生產(chǎn)技術(shù)6.1菌種要求采集礦區(qū)本土的深色有隔內(nèi)生真菌菌種，篩選活性強(qiáng)、植物促生效果好、抗脅迫能力強(qiáng)的菌種。6.2母種培養(yǎng)6.2.1培養(yǎng)基配制PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉3.0g，葡萄糖20.0g和瓊脂粉15.0g混合，加入蒸餾水并定容至1L，加熱溶解，分裝，pH6.0，121℃高壓滅菌15min。6.2.2接種培養(yǎng)在無菌條件下，取直徑5mm的菌餅于PDA固體培養(yǎng)基，28℃黑暗倒置培養(yǎng)12-16天，確保菌餅長滿整個培養(yǎng)皿。3T/GRM101—20246.3液體菌劑搖瓶培養(yǎng)6.3.1培養(yǎng)基配制MMN培養(yǎng)基：氯化鈣0.05g、硫酸鎂0.15g、氯化鈉0.025g、氯化鐵0.01g、磷酸二氫鉀0.5g、維生素B10.0001g、磷酸氫二銨0.25g、葡萄糖10g、檸檬酸0.2g和麥芽提取物10g混合，得到混合物，加入蒸餾水并定容至1L，分裝，pH5.5，121℃高壓滅菌30min。6.3.2接種培養(yǎng)在無菌條件下，取直徑5mm的菌餅接種于裝有200mLMMN培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，28℃,180rpm振蕩培養(yǎng)6-10天，使該菌株生長至對數(shù)生長期。6.4液體菌劑發(fā)酵培養(yǎng)6.4.1培養(yǎng)基配制蔗糖30g、麥芽提取物25g、磷酸氫二鉀2g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.45g和維生素B10.02g，加入蒸餾水并定容至1L，pH7.0，121℃高壓滅菌20min。6.4.2接種培養(yǎng)將培養(yǎng)好的母種接種于裝有7L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，接種量為10%，初始攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，6h-120h攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)置為300rpm，罐體壓力為0.05MPa，共培養(yǎng)4-6天，可采用分批發(fā)酵、流加發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵工藝，具體選擇視規(guī)模和生產(chǎn)需求而定。6.5胞外代謝物制備將DSE菌液分裝至10mL無菌離心管，10000rpm，4℃,離心5min，收集胞外代謝物（上清液）。胞外代謝物用無菌注射器通過0.22μm無菌水系醋酸纖維素濾頭進(jìn)行過濾。根據(jù)應(yīng)用需求確定純化程度。6.6胞外代謝物粉劑制備6.6.1烘干法將提純后的胞外代謝物放置于烘箱中，60℃烘干至恒重，并通過破碎機(jī)破碎為粉末狀，便于溶解使6.6.2凍干法將提純后的胞外代謝物放置于冷凍干燥機(jī)中，冷凝器設(shè)置溫度為-80℃,真空度小于10Pa，脫水24h-48h后使用破碎機(jī)破碎為粉末。6.7胞外代謝物膠囊制備將烘干或凍干研磨后的胞外代謝物粉劑使用膠囊機(jī)制成胞外代謝物粉劑膠囊，膠囊遇水可以降解，緩釋出胞外代謝物，每個膠囊胞外代謝物粉劑含量約0.2g，密封防潮吸水。7產(chǎn)品參數(shù)檢測7.1外觀測定取少量樣品放到白色塑料盤中，仔細(xì)觀察樣品的顏色、形狀、質(zhì)地。7.2濃度測定將DSE胞外代謝物凍干，稱重測定代謝物質(zhì)量，計算濃度。7.3水分測定參照GB20287-20066.3.5的規(guī)定執(zhí)行。4T/GRM101—20247.4pH值測定參照GB20287-20066.3.7的規(guī)定執(zhí)行。7.5粘度測定取30mLDSE胞外代謝物倒入粘度計（LC-NDJ-1T）樣品槽，采用0號轉(zhuǎn)子測定DSE胞外代謝物的粘度。7.6生長素測定深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物生長素含量測定方法參照附錄A執(zhí)行。7.7保質(zhì)期在產(chǎn)品說明書標(biāo)明的保質(zhì)期前，測定產(chǎn)品相應(yīng)指標(biāo)。7.8胞外代謝物化合物組分測定深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物化合物組測定采用高效液相色譜質(zhì)譜法參照附錄B執(zhí)行。8檢驗(yàn)規(guī)則8.1組批規(guī)則深色有隔內(nèi)生真菌胞外代謝物應(yīng)批次提交驗(yàn)收，每批應(yīng)保證同等質(zhì)量的產(chǎn)品組成。8.2取樣方法將樣品應(yīng)被分為兩份，每個試樣不少于完整規(guī)格測試所需數(shù)量的兩倍，分別入帶有干燥劑的離心管中，貼上標(biāo)簽，注明試樣名稱、生產(chǎn)日期。供檢驗(yàn)和查用。8.3檢驗(yàn)項目本文件5.4、5.5和5.6中規(guī)定的所有項目均為出廠檢驗(yàn)項目。8.4檢查與驗(yàn)收產(chǎn)品需經(jīng)供方檢測，確保其符合本標(biāo)準(zhǔn)要求。需方收到產(chǎn)品后，應(yīng)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)。如檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)或合同（訂貨單）不符，需在收到產(chǎn)品后15日內(nèi)向供方提出，由雙方協(xié)商解決。8.5判定規(guī)則具下列任何一條款者，均為合格產(chǎn)品：a)檢驗(yàn)結(jié)果各項技術(shù)指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求的產(chǎn)品；b)在產(chǎn)品的外觀、水分、pH值、粘度、生長素等檢測項目中，有一項不符合要求，而其他各項技術(shù)指標(biāo)符合要求的產(chǎn)品。具下列任何一條款者，均為不合格產(chǎn)品：c)有效活菌數(shù)不符合技術(shù)指標(biāo)；d)雜菌率不符合技術(shù)指標(biāo)；e)在外觀、水分、pH值、粘度、生長素等檢測項目中，有兩項（含）以上不符合要求。本文件中產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)合格判定，采用GB/T8170-2008中修約值比較法的規(guī)定。9包裝、標(biāo)識、運(yùn)輸和貯存9.1包裝根據(jù)不同產(chǎn)品劑型選擇適當(dāng)?shù)陌b材料、容器、形式和方法，以滿足菌劑產(chǎn)品包裝的基本要求。產(chǎn)品包裝中應(yīng)有產(chǎn)品使用說明書，在使用說明書中標(biāo)明使用范圍、方法，用量及注意事項等內(nèi)容。液態(tài)菌劑可使用無菌塑料瓶灌裝；粉劑產(chǎn)品可使用無菌塑料管包裝，或者根據(jù)用量獨(dú)立包裝成膠囊，裝在瓶內(nèi)，內(nèi)置干燥劑防潮。5T/GRM101—20249.2標(biāo)識產(chǎn)品外包裝需明確標(biāo)注生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、批次、成分含量、貯存條件及適用領(lǐng)域。9.3運(yùn)輸運(yùn)輸過程中有遮蓋物，防止雨淋、日曬及高溫。保證產(chǎn)品輕裝輕卸，避免包裝破損。嚴(yán)禁與對微生物菌劑有毒、有害的其他物品混裝、混運(yùn)。9.4貯存液態(tài)菌劑應(yīng)冷藏貯存（2-8℃)。粉劑、膠囊型產(chǎn)品應(yīng)貯存在陰涼、干燥、通風(fēng)的庫房內(nèi)，應(yīng)避免高溫、高濕等不良條件的影響。6T/GRM101—2024（規(guī)范性）胞外代謝物生長素含量測定比色法A.1方法提要吲哚乙酸（IAA）與Salkowski試劑反應(yīng)生成粉紅色或紅色化合物的顯色反應(yīng)。A.2試劑和溶液a)無菌水（或生理鹽水）、蒸餾水。b)10.8mol/L硫酸溶液：取683.67mL濃硫酸（98%硫酸）于316.33mL蒸餾水。c)Salkowski試劑：稱取4.5g氯化鐵于10.8mol/L硫酸溶液，配制1L。d)3-吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：10mg黑色素溶解于100mL0.1mol/L氫氧化鈉溶液中，得到100μg/mL黑色素標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.3儀器紫外分光光度計。A.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制表A.1不同濃度標(biāo)準(zhǔn)3-吲哚乙酸溶液的制備100234567890A.5測定步驟取4mL樣品液與4mLSalkowski試劑混合。在黑暗中孵育20min，然后在540nm處進(jìn)行比色測定。之后，取4mLSalkowski試劑與4mL標(biāo)準(zhǔn)液在暗處反應(yīng)30min，用分光光度計測反應(yīng)液在540nm下的吸光度，設(shè)置3組平行，減小實(shí)驗(yàn)誤差。測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。A.6結(jié)果計算根據(jù)吸光度，將結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算生長素含量。A.7允許誤差三次平行測定結(jié)果的允許不大于0.5%。7T/GRM101—2024（規(guī)范性）胞外代謝物代謝組測定高效液相色譜質(zhì)譜法B.1方法提要將待測樣品注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用液相色譜分離，質(zhì)譜檢測器檢測，保留時間和質(zhì)譜的相對離子對豐度定性。B.2試劑和材料a)水：GB/T6682，一級。b)乙腈：色譜純。c)甲酸：色譜純。d)0.1%甲酸溶液：取1.0mL甲酸，用水稀釋至1000mL，混勻。e)0.1%甲酸乙腈溶液：取1.0mL甲酸，用乙腈稀釋至1000mL，混勻。f)微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)系。g)無菌注射器：1mL。B.3儀器設(shè)備a)高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源（ESI）。b)離心機(jī)。c)超聲波清洗儀。B.4樣品制備用3倍體積的乙腈溶液，4℃,10000rpm，15min下離心。蛋白質(zhì)沉淀，上