（高清版）DB51∕T 1546-2012 植物檢疫實驗室常規(guī)檢驗技術 真菌　

DB51DB51/T1546—2012植物檢疫實驗室常規(guī)檢驗技術真菌2012-12-20發(fā)布2013-03-01實施四川省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I前言 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 1 25試劑與材料 26儀器與用具 27取樣及送樣要求 28檢測方法 39結果判定 3附錄A(資料性附錄)真菌病害主要癥狀特征 4附錄B(資料性附錄)真菌病害顯微鏡檢查 6附錄C(資料性附錄)真菌病害染色檢驗 7附錄D(資料性附錄)真菌病害分離培養(yǎng)檢驗 8本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則進行編寫。本標準由四川省農業(yè)廳提出并歸口。本標準由四川省質量技術監(jiān)督局發(fā)布。本標準起草單位：四川省農業(yè)廳植物檢疫站。本標準主要起草人：寧紅、李小松、劉可、趙蘭鸰、帥波、黃玲、熊玉蘭、楊重渝、袁曦。1植物檢疫實驗室常規(guī)檢驗技術真菌件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。3.1病原真菌plantpathogenicfungi植株受病原菌侵染后，內部生理活動和外觀上的生長發(fā)育呈現(xiàn)出某種異常狀態(tài)。病原菌在植物受害部位產生的結構特征。3.4菌絲和菌絲體hyphaan真菌的典型營養(yǎng)體，通常呈絲狀，單根的叫菌絲，菌絲的集合體叫菌絲體。真菌產生孢子的結構，如子囊果、擔子果、分生孢子器、分生孢子盤、子座等，統(tǒng)稱為子實體。23.9柯赫氏法則Koch'sRule如發(fā)現(xiàn)一種不熟悉的或新的病害時，應按柯赫氏法則的四個步驟來完成對具有典型癥狀的真菌病害，可根據特有的癥狀和鏡檢觀察菌絲及孢子形態(tài)進行鑒定；對癥狀不行鑒定；對通過分離培養(yǎng)仍不能確定病原菌的病害，需按照柯赫氏法則進行鑒定?！榉佑?苯酚結晶20mL,乳酸20mL,甘油40mL,蒸餾水20mL)——酒精(70%、95%)——龍膽紫(0.04%)——酒精冰醋酸混合液(95%酒精20mL,冰醋酸20mL)——苯胺藍水溶液(苯胺藍0.1g,蒸餾水100mL)—水合氯醛水溶液(水合氯醛5g,蒸餾水2mL)——升汞水溶液(升汞1g,濃鹽酸2.5mL,蒸餾水1000mL)——福爾馬林醋酸酒精固定液(FAA)(95%酒精20mL,福爾馬林5mL,冰醋酸5mL,蒸餾顯微鏡、擴大鏡、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)皿、三角瓶、載玻片(蓋玻片)、調運檢疫樣品按照GB15569-2009附錄D和E相關規(guī)定進行取樣，產地檢疫樣品按照各種檢疫性在調運檢疫和產地檢疫過程中，采集具有可疑癥狀的葉片、枝3在保證不腐爛的前提下及時送檢。8檢測方法8.1癥狀觀察觀察樣品有無異樣，初步判斷是否具有真菌病害的表現(xiàn)特征(見附錄A),持擴大鏡觀察感病植株癥狀，檢查有無孢子或子實體等病征。8.2顯微鏡檢查見附錄B。8.3染色檢驗見附錄C。8.4保濕培養(yǎng)在滅菌培養(yǎng)皿內放入滅菌濾紙數張，吸足無菌水，上面放兩根細玻棒，將表面消毒或用消毒解剖刀切取的培養(yǎng)物放在玻棒上，置于25℃~28℃恒溫箱中培養(yǎng)一定時間，待培養(yǎng)物長出菌絲或子實體進行鏡檢鑒定。8.5分離培養(yǎng)見附錄D。8.6柯赫氏法則鑒定將分離得到的純培養(yǎng)物制成孢子(或菌絲)懸浮液，通過噴霧、涂抹或針刺的方法將病原菌接種到相同品種的健株上，保濕約24h~48h,誘發(fā)寄主發(fā)病。然后再從接種發(fā)病的植株上再次分離得到其純培養(yǎng)物，比較接種物與純培養(yǎng)物性狀。9結果判定9.1通過癥狀觀察，符合某種病害的典型癥狀描述特征，并結合病原菌鏡檢結果，可判定為該類病害。9.2根據染色檢驗、保濕培養(yǎng)或分離培養(yǎng)，鏡檢觀察病原菌的形態(tài)學特征，符合某種病害的病原菌特征，可判定為該類病害。9.3采用柯赫氏法則判定，如寄主在接種后產生與原發(fā)病害一致的典型癥狀，并能從典型癥狀上再次分離到與接種物性狀一致的病原菌，根據病原菌形態(tài)學特征，可判定為該類病害。4(資料性附錄)花、果、葉及嫩枝上覆蓋白色粉狀物，后期在白粉物上出現(xiàn)散生狀針頭大的顆粒，顆粒由白變黃，最后變黑。葉、枝、果實表面覆蓋一層煤煙狀物，用手容易擦掉，這種病害的發(fā)生通常與蚜蟲和植物受害部位變大或縮小，生長不勻，失去原來形狀，后期在受害部位出現(xiàn)病征。發(fā)生在枝干皮層，病斑形狀有圓形、近圓形、長形，通常病斑周圍稍隆起，中間組織干裂，后期常產生小黑點或盤狀物。A.10腐朽5發(fā)生在喬灌木的枝干或根部木質部，使木質部變質、變色、腐朽，樹干內因木質部腐朽出現(xiàn)空洞，受害部位表面后期往往出現(xiàn)大型真菌繁殖體，如木耳、蘑菇或馬蹄狀等各種形狀繁殖體。A.11腐爛分為濕腐和干腐。多汁部位破壞解體后產生濕腐或軟腐癥狀；含水量低的植物組織軟硬部位病死后產生的組織死亡稱為干腐，在枝干上常與潰瘍相似。A.12猝倒和立枯大多出現(xiàn)在播種育苗的苗木上。小幼苗根莖部發(fā)生腐爛使植物猝然倒伏，由于發(fā)生過程迅速，地上部分仍維持正常狀態(tài)，稱為猝倒；若幼苗根莖已木質化，莖部腐爛后不倒伏，地上葉子干枯，稱為立枯。6(資料性附錄)真菌病害顯微鏡檢查B.1菌絲體和子實體的挑取檢視顯微鏡下檢視，常用浮載劑有蒸餾水、乳酚油和甘油乳酸等。檢查葉片表面的真菌(如白粉菌、銹菌或其它霉菌等),采用粘貼檢視的方法。將小段透明膠帶粘貼在有真菌生長部位的葉面上，將膠帶取下放在載玻片上的一滴甘油乳酸中，上面再加一滴甘油乳酸，加蓋玻片進行檢視。將小塊病組織放在等量的酒精冰醋酸混合液中固定24h,再浸在飽和的水合氯醛水溶液中，待組織透明后取出用水洗凈，經稀苯胺藍水溶液染色，用甘油乳酸作浮載劑鏡檢。選擇軟硬適中的植物器官或組織為材料，直5mm2。對于柔嫩的器官組織(如幼葉),可夾在通草、木髓和胡蘿卜中進行切片。切片前先準備好一個盛有清水的培養(yǎng)皿；切片時用左手的拇指、食指與中指捏住材料，使材料突材料和刀片的濕潤。7(資料性附錄)挑取少量菌絲置于載玻片上，用加有0.1%苯胺藍的乳酚油作浮載劑，將載玻片微微加熱，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察真菌孢子或菌絲隔膜。如果染色太深，可用未加染料的染色25min~45min,用水沖洗后制片觀察。8D.1.1.2馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基葡萄糖(或蔗糖)10g在1000mL沸水中，加瓊膠熔化后根據需要分裝滅菌保存。D.1.2.2馬鈴薯葡萄糖瓊膠培將洗凈后去皮的馬鈴薯切碎，加水1000mL煮沸半小時，用紗布濾去馬鈴薯，加水補足1000mL,然后加糖和瓊膠，加熱使瓊膠完全熔化后，趁熱用紗布過濾，根據需要分裝三角瓶或試管滅菌保存。D.1.2.3燕麥片瓊膠培養(yǎng)基制備方法將燕麥片加水1000mL,在沸水浴上加熱1h,紗布過濾后加水補足1000mL,加瓊膠熔化后根據需打開超凈工作臺通風20min以上，用70%酒精擦拭手、臺面和工作臺出風口進行消毒，分離培養(yǎng)所需的用具用95%酒精擦拭后用火焰灼燒滅菌。9D.2.2.1葉斑病害——從病健交界處切取邊長約5mm的小塊病組織備用。D.2.2.2維管束組織病害——小材料可參照D.2.2.1,大材料可參照D.2.2.2?！≌７N子或種子的一部分備用。將培養(yǎng)基加熱融化，取出搖勻，在超凈工作臺上經無菌操作將培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，厚度2mm~3mm,搖勻，靜置冷卻。可在10mL培養(yǎng)基中加入3滴25%乳酸，或加入40ug/mL鏈霉素防將分離的材料置于已滅菌的培養(yǎng)皿內，先在70%酒精中浸2s~3s,再放入0.1%升汞溶液處理30s~10min(根據材料大小、堅實程度不同有所差異),再用滅菌水清洗3～4次，用滅菌濾紙