3.2.2將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

3.2基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第一步第二步第三步第四步目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序閱讀課本P81，總結(jié)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些，各個(gè)方法的原理是什么？各自適用于什么生物？三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.花粉管通道法①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；受體細(xì)胞：②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。受精卵十分簡便，但轉(zhuǎn)化效率不高，并不常用。（一）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）轉(zhuǎn)化：（2）特點(diǎn)：

實(shí)質(zhì)：①在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，也能侵染單子葉植物。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程?；蛑亟M（一）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建

基因表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞目的基因插入染色體DNA中植物細(xì)胞植物組織培養(yǎng)表現(xiàn)出新性狀的植株（3）過程三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關(guān)系？T-DNA不是目的基因，但它將來會(huì)被整合到宿主細(xì)胞染色體的DNA上；要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞并整合到宿主細(xì)胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進(jìn)入植物的一個(gè)體細(xì)胞，但基因工程最終要的是一個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，如何實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)？得到含有目的基因的植物細(xì)胞后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞顯微注射法1.導(dǎo)入方法：（二）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞2.受體細(xì)胞:受精卵為什么常選用受精卵作為受體細(xì)胞呢？3、過程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物①體積大，易操作②易表現(xiàn)出全能性三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（三）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞——Ca2+處理法常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌最廣泛2、過程：1、受體細(xì)胞：繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)。原因：一般先用Ca2+處理大腸桿菌增加細(xì)胞壁的通透性這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)Ca2+的作用：再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中思考：如何篩選含重組質(zhì)粒的目的菌？1.“影印法”篩選重組質(zhì)粒（抗性篩選）Ampr：氨芐青霉素抗性基因Tetr：四環(huán)素抗性基因三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞氨芐青霉素的培養(yǎng)基四環(huán)素的培養(yǎng)基①氨芐青霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)所有細(xì)胞，含普通質(zhì)粒與重組質(zhì)粒的細(xì)胞存活，不含質(zhì)粒的細(xì)胞死亡②培養(yǎng)一段時(shí)間使含質(zhì)粒的細(xì)胞形成菌落，用絨布印章印取氨芐青霉素培養(yǎng)基中細(xì)胞，再印在四環(huán)素培養(yǎng)基中③在對應(yīng)位置處，能在氨芐青霉素培養(yǎng)基中存活的而在四環(huán)素培養(yǎng)基中不能存活的即為導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞，可在氨芐青霉素培養(yǎng)基中對應(yīng)位置獲取三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞思考：如何篩選含重組質(zhì)粒的目的菌？2.“藍(lán)白斑法”篩選重組質(zhì)粒（利用基因的插入失活）①LacZ編碼的半乳糖苷酶可以將無色的X-gal變?yōu)樗{(lán)色。②選取的普通質(zhì)粒上含LacZ基因與抗性基因③受體細(xì)胞為半乳糖苷酶缺陷細(xì)胞，不能合成自主合成半乳糖苷酶含氨芐青霉素與X-gal的培養(yǎng)基白斑為含重組質(zhì)粒的細(xì)胞藍(lán)斑為不含目的基因的空載體菌落三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞思考：真核生物的基因有內(nèi)含子，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機(jī)制，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列不能被切除，因此無法表達(dá)出該蛋白。使用cDNA作為目的基因或使用酵母菌等真核生物作為受體細(xì)胞。（2）若可以獲得該蛋白，但是蛋白質(zhì)無活性，原因可能是？原核生物缺少高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，無法對真核生物的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的加工。原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。（1）當(dāng)真核生物的基因以原核生物作為受體細(xì)胞時(shí)。若無法獲得該蛋白，原因可能是什么？如何解決？四、目的基因的檢測與鑒定目的：檢測目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。（一）分子水平1.DNA水平（檢測受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因）方法：DNA（核酸）分子雜交工具：基因探針（帶有放射性同位素標(biāo)記、熒光分子標(biāo)記）2.RNA水平（檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA）3.蛋白質(zhì)水平（檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)）方法：抗原-抗體雜交技術(shù)Western雜交Northern雜交Southern雜交原理：堿基互補(bǔ)配對原則四、目的基因的檢測與鑒定（二）個(gè)體生物學(xué)水平轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實(shí)驗(yàn)）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實(shí)驗(yàn)）未出現(xiàn)病斑鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等習(xí)題鞏固1.下列有關(guān)基因工程中目的基因的檢測與鑒定的說法錯(cuò)誤的是（

）A.檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因用DNA分子雜交的方法B.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄用分子雜交的方法C.檢測目的基因是否表達(dá)用抗原-抗體雜交的方法D.目的基因的檢測與鑒定是基因工程的核心步驟D習(xí)題鞏固2.下列各項(xiàng)中能說明目的基因在受體細(xì)胞中完成表達(dá)的是（

）A.番茄葉肉細(xì)胞檢測到魚的抗凍蛋白基因B.大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNAC.山羊乳腺細(xì)胞中檢測到人抗凝血酶基因D.酵母菌細(xì)胞中提取到人白細(xì)胞介素D習(xí)題鞏固3.利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增,下列有關(guān)“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是（

）A.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理B.PCR利用了DNA的熱變性原理C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換C習(xí)題鞏固4.下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是（

）A.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B.待測樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA在電泳中的遷移速率C.進(jìn)行電泳時(shí)，帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)D.PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定C練習(xí)與應(yīng)用1.外源基因插入基因組中可能為單位點(diǎn)插入，或者同一染色體多位點(diǎn)插入，或者不同染色體多位點(diǎn)插入。大多數(shù)情況下，插入的位點(diǎn)難以做到定點(diǎn)插入；插入的拷貝數(shù)也是隨機(jī)的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。例如，科研人員在對轉(zhuǎn)GUS基因（β-葡糖醛酸糖苷酶基因）的煙草進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個(gè)拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。二、拓展應(yīng)用練習(xí)與應(yīng)用二、拓展應(yīng)用2.（1）crtⅠ基因和psy基因pmi基因?qū)⒛康幕蛩腿胨炯?xì)胞。

（2）不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷。

（3）維生素A在人體內(nèi)具有非常重要的生理功能，對視力、骨骼生長、免疫功能等都有調(diào)節(jié)作用。但是，人體不能合成維生素A，需要從食物中攝取。維生素A缺乏癥是南亞地區(qū)常見的由營養(yǎng)不良導(dǎo)致的疾病，該地區(qū)的居民一般以秈稻作為主食。β-胡蘿卜素是維生素A的前體，在人體內(nèi)它可以轉(zhuǎn)化為維生素A。因此科學(xué)家將兩個(gè)參與β-胡蘿卜素合成的酶的基因轉(zhuǎn)入了秈稻中，便其胚乳中富含β-胡蘿卜素，期望讓人們通過日常食用主食就能補(bǔ)充足夠量的維生素A，從而降低維生素A缺乏癥的患病率。關(guān)于“是否要推廣‘黃金大米’”的爭論主要圍繞其安全性、有效性等方面展開。習(xí)題鞏固1.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，導(dǎo)入目的基因的方法正確的是（

）①將毒素蛋白注射到棉受精卵中；②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入農(nóng)桿菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)④將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，借助花粉管通道進(jìn)入受精卵。

A.①②

B.③④

C.②③

D.①④B習(xí)題鞏固2.科研人員以抗四環(huán)素基因?yàn)闃?biāo)記基因，通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產(chǎn)鼠的β-珠蛋白，治療鼠的鐮狀細(xì)胞貧血。下列相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，不合理的是（

）A.構(gòu)建的表達(dá)載體除了目的基因外，還需要啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因B.用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基可以篩選出已經(jīng)導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌C.小鼠的β-珠蛋白基因可以直接轉(zhuǎn)給大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)得到β-珠蛋白D.用Ca2+處理大腸桿菌后，表達(dá)載體易于導(dǎo)入大腸桿菌中C習(xí)題鞏固3.科學(xué)家已能運(yùn)用基因工程技術(shù)，讓羊合成并由乳腺分泌抗體，相關(guān)敘述中正確的是（

）①該技術(shù)將導(dǎo)致定向變異；②DNA連接酶能把目的基因與載體黏性末端的堿基對連接起來；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)采用顯微注射技術(shù)；④受精卵是理想的受體。A.①②④B.①③④C.②③④D.①②③④B習(xí)題鞏固4.利用人胰島B細(xì)胞構(gòu)建cDNA文庫，然后通過核酸分子雜交技術(shù)從中篩選目的基因，篩選過程如下圖所示。下列說法不正確的是（

）A.cDNA文庫的構(gòu)建需要用到逆轉(zhuǎn)錄酶B.圖中的菌落是通過稀釋涂布平板法獲得的C.核酸分子雜交的原理是堿基互補(bǔ)配對D.從該文庫中可以篩選到胰高血糖素基因D習(xí)題鞏固5.研究者將蘇云金芽孢桿菌（Bt）的Cry1Ab基因?qū)胨炯?xì)胞培育成抗螟蟲的克螟稻,克螟稻與普通水稻雜交，子代抗螟蟲與不抗螟蟲的比例為1∶1。下列有關(guān)敘述正確的是（

）A.Cry1Ab基因雖已整合到克螟稻細(xì)胞的染色體上，但沒有表達(dá)B.獲取Cry1Ab基因需使用限制酶和DNA連接酶C.克螟稻和