生物技術(shù)工程（解析版）3大模板-2025年高考生物答題技巧與模板構(gòu)建

專題10生物技術(shù)工程

??一一本節(jié)導(dǎo)航----??

模板01酶切位點(diǎn)的選擇-既要相同又要不同

模板02雙標(biāo)記篩選金標(biāo)準(zhǔn)一二去其一是為真

~~~藏薛

朗?答題模板答題要點(diǎn)+答題技巧+模板運(yùn)用

稼?高分突破模板綜合演練，快速技巧突破

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命題點(diǎn)真題在線常見(jiàn)設(shè)問(wèn)/關(guān)鍵詞

微生物的選

2023?山東?T152023?廣東-TIO2023?北京-T162022?全國(guó)甲?T37

擇培養(yǎng)和計(jì)

2022?全國(guó)乙?T372022?廣東-T212021?江蘇-T18

數(shù)

2023?廣東-T122023?江蘇-T132023?浙江1月選考-T24202141

植物體細(xì)胞

M-T11

雜交技術(shù)

2020?北京?T132020?山東-T13

2023?北京?T12

動(dòng)物細(xì)胞融

2023?湖北-T222022?山東-T152022?福

合和單克隆設(shè)問(wèn)關(guān)鍵詞：限制酶

建.T13

抗體的制備的選擇、目的基因的

2021?山東-T152021?江蘇1112020?全國(guó)I-T38

鑒定、PCR過(guò)程

基因工程的

2023?全國(guó)乙?T382023?全國(guó)甲?T382023?湖北?T42023?廣東-T20

基本操作程

2021?廣東?T22

序

DNA片段的

2023?江蘇-T222023?山東-T252023?浙江6月選考-T192022?遼

擴(kuò)增與電泳

寧?T122022?江蘇-T242021?山東-T252021?全國(guó)甲138

鑒定

幾種不同2023?江蘇-T222023?山東1252022?江蘇1242022?山東125

PCR的應(yīng)用2021?全國(guó)甲T382021?山東-T252020?北京-T122020?江蘇-T33

命題預(yù)測(cè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建；標(biāo)記基因的選擇

目的基因和載體的酶切和連接是設(shè)計(jì)的核心；根據(jù)題目的具體信息判斷保留和破壞的標(biāo)記基

關(guān)鍵技巧

因的類型

////////〃/〃//〃//〃〃/〃///〃////〃///〃,◎客起操板“/〃〃////〃〃〃/〃/〃/////〃〃〃//////〃"

模板01酶切位點(diǎn)的選擇-既要相同又要不同

購(gòu)答題要點(diǎn)

【核心】相同黏性末端，正確連接方向

酶切位點(diǎn)的選擇實(shí)際上有許多需要考慮的邏輯，但核心點(diǎn)是兩個(gè)：

要保證質(zhì)粒和目的基因的黏性末端相同，才能讓質(zhì)粒和目的基因的黏性末端相互連接。

要保證基因的頭對(duì)著啟動(dòng)子，尾對(duì)著終止子，才能保證正確的轉(zhuǎn)錄。

除這兩個(gè)原則之外，很多題目還會(huì)有額外的信息，如基因中間或質(zhì)粒其他位置存在相同酶切位點(diǎn)、同尾酶

等，要根據(jù)題目信息具體判斷。

【基本知識(shí)】

（1）限制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱"限制酶"）

主要來(lái)源■原核生物

種類?分離的限制酶有數(shù)千種

特占識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核的酸序列,

（專二Q使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵

限斷開(kāi)

制

酶斷開(kāi)兩個(gè)核甘酸之間的磷酸二酯鍵

［切割位置：識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)

黏性黑15-GAA；TTC3-_GAATTC

末埔|A之間3，CTT|AAG5，CTTAAG

結(jié)果〔切割）中立線

「切割位置：識(shí)別序列的中心軸線處

SmaIJ

平，|（在G與5，CCC|GGG3，CCCGGG

末端C之間if

回3'GGG|CCC5'GGGCCC

切割）\

中軸線

（2）限制酶的選擇

PstISmaIPst1

1i?I

SmaI抗病EcoRI

基因

甲

1.不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇Pst回，而不選擇Sma隊(duì)

2.保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所選擇的限制酶盡量

不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇Sma回。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因，則可合理對(duì)其中一些標(biāo)記

基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比一個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有一個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的"假陽(yáng)

性"（即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無(wú)效篩選）。

3.善用"雙酶切"，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時(shí)，一般需要選擇在目的基因

所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對(duì)目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切

法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后

形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動(dòng)子的方向（或描述為"RNA聚合酶的移動(dòng)方向"）必須是相同的,

否則目的基因?qū)牒鬅o(wú)法正常表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstI和EcoRI兩種限制酶。

4.巧用"同尾酶"：同尾酶指來(lái)源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時(shí)，可用

其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。

G答題技巧

技巧01酶切位點(diǎn)的選擇-既要相同又要不同

研究人員為尋求炎癥性疾病的高敏感檢測(cè)方法，以重組S100A8蛋白作為免疫抗原，制備了抗S100A8蛋白

的單克隆抗體。下圖是重組S100A8蛋白的制備過(guò)程，結(jié)合下表4種相關(guān)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，可

知切割質(zhì)粒的限制酶為（）

轉(zhuǎn)錄方向

（注：S100A8蛋白是炎癥反應(yīng)時(shí)高度表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，可作為炎癥性疾病診斷的重要標(biāo)志物。）

Hind回Neo團(tuán)Bg唱Xho回

5'-A^AGCTT-3*5'-CJCATGG-3'5'-A^GATCT-3'5'-CJTCGAG-3'

A.HindIII和NcoElB.BglEI和XhoEl

C.NcolB和Xho0D.Hind回和Bgl0

【技巧點(diǎn)撥】【核心】相同黏性末端，正確連接方向-要保證質(zhì)粒和目的基因的黏性末端相同，才能讓質(zhì)粒和

目的基因的黏性末端相互連接；要保證基因的頭對(duì)著啟動(dòng)子，尾對(duì)著終止子，才能保證正確的轉(zhuǎn)錄。

【思路詳解】依據(jù)題干信息，S100A8蛋白基因經(jīng)切割后所產(chǎn)生的黏性末端為6CATG3，、5TCGA3，，依據(jù)表格

中限制酶的識(shí)別序列，可知，HindEI產(chǎn)生的黏性末端為5'AGCT3',NcoEl產(chǎn)生的黏性末端為5'CATG3'（與目的

基因一端的粘性末端能堿基互補(bǔ)），BglEI產(chǎn)生的黏性末端為5,GATC3',XhoEl產(chǎn)生的黏性末端為5'TCGA3,（與

目的基因另一端的粘性末端能堿基互補(bǔ)），為了確保目的基因和質(zhì)粒的正向連接，防止自身環(huán)化，故應(yīng)選擇

兩種能產(chǎn)生不同的黏性末端的限制酶，所以可選Neo團(tuán)和Xho團(tuán)進(jìn)行切割質(zhì)粒，C正確，ABD錯(cuò)誤。

【答案】C

業(yè)模板運(yùn)用

研究人員用酶M和酶N兩種限制酶同時(shí)處理某DNA分子和質(zhì)粒，得到的DNA片段如圖所示。圖中DNA片

段只注明了黏性末端處的堿基種類，其他堿基的種類未注明。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

同時(shí)用酶M

某DNA分子犧迪匕飛和TGCACA和GCGCT

CACGTGTCGCGA

???????????_1

片段甲片段乙片段丙

盟用酶M和WN------------r------------r

由2處理GCGCTG*TGCACA

質(zhì)粒----------------->和

ACACGTGTCGCG

Iiiiiiiiiiii

片段丁片段戊

A.該DNA分子和質(zhì)粒上均含有酶M的一個(gè)切割位點(diǎn)和酶N的一個(gè)切割位點(diǎn)

B.根據(jù)圖示信息不能確定圖中形成的不同黏性末端與這兩種限制酶的對(duì)應(yīng)關(guān)系

C.用T4DNA連接酶或E.coliDNA連接酶均可以將片段乙和片段丁連接起來(lái)

D.片段乙、片段丁、片段戊可依次連接形成一個(gè)環(huán)狀DNA分子

【答案】D

【分析】1、分析圖形：圖中所示的是酶M和酶N兩種限制酶切割含有目的基因的DNA片段和質(zhì)粒的結(jié)果。

2、限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）（1）來(lái)源：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的；

（2）功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核甘酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核甘酸之

間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，因此具有專一性；

（3）結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。

【詳解】A、該DNA分子經(jīng)酶M和酶N兩種限制酶切割后，產(chǎn)生了三個(gè)DNA片段且兩個(gè)切口形成的黏性末

端不同，說(shuō)明該DNA分子含有酶M的一個(gè)切割位點(diǎn)和酶N的一個(gè)切割位點(diǎn)；質(zhì)粒為環(huán)狀DNA,其經(jīng)酶M

和酶N兩種限制酶切割后，產(chǎn)生了兩個(gè)DNA片段，觀察兩個(gè)切口形成的黏性末端，可推出質(zhì)粒含有酶M的

一個(gè)切割位點(diǎn)和酶N的一個(gè)切割位點(diǎn)，A正確；

IIIIII??IIII

AGCGCTGTGCAC

B、根據(jù)圖中黏性末端可知，酶M和酶N識(shí)別的序列可能是,但無(wú)法確定

TCGCGACACGTG

????????????

其對(duì)應(yīng)關(guān)系，B正確；

C、圖中經(jīng)酶切后形成的片段均是黏性末端，T4DNA連接酶既可以"縫合"雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，也

可以“縫合"雙鏈DNA片段的平末端，而E.coliDNA連接酶只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來(lái)，

片段乙和片段丁黏性末端互補(bǔ)，C正確；

D、根據(jù)圖中黏性末端可知，片段乙、片段丁、片段戊三個(gè)片段不能連接成環(huán)狀DNA分子，D錯(cuò)誤。

模板02雙標(biāo)記篩選金標(biāo)準(zhǔn)一二去其一是為真

姮答題要點(diǎn)

【核心】失去一個(gè)標(biāo)記基因的載體才是好載體

雙標(biāo)記讓載體具有兩個(gè)標(biāo)記性狀，如四環(huán)素抗性和青霉素抗性，在基因表達(dá)載體的構(gòu)建中會(huì)破壞其中一個(gè)，

如破壞四環(huán)素抗性，含有目的基因的基因表達(dá)載體此時(shí)只有青霉素抗性，而空載體依然具有四環(huán)素抗性和

青霉素抗性，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，可以區(qū)分出含有目的基因的載體和空載體。

1.標(biāo)記基因的作用

載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的

能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能抵抗相

應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入該種抗生素就可以只保留成功轉(zhuǎn)入載體且抗生素抗性基因表達(dá)

的受體細(xì)胞。

2.雙標(biāo)記原理

（1）單標(biāo)記的區(qū)分問(wèn)題：僅有一個(gè)標(biāo)記基因時(shí)，含有目的基因的載體和空載體都有標(biāo)記，在篩選時(shí)無(wú)法區(qū)

分。

（2）雙標(biāo)記方法：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果目的基因插入某種抗生素抗性

基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖所示，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素

抗性基因失活。

日標(biāo)南客（在合B球去妁培/皋工

不能生K說(shuō)明該標(biāo)記皋因被破冰）

福收淬,最海

篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨茉青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組載體的細(xì)菌和含空載體的細(xì)菌，

如圖中1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布將上述5個(gè)菌落影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如上圖，

能生長(zhǎng)的菌落為2、3、4,則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的即為含有目的基因的菌落，如圖中1、5菌落。

最后，可在含氨葦青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。

3.標(biāo)記基因的作用：在宏觀水平上看到微觀分子的變化，例如抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因時(shí)，可以用抗

生素篩選出具有抗藥性的菌落，從而快速對(duì)轉(zhuǎn)基因的結(jié)果進(jìn)行鑒定。標(biāo)記基因本身也是一個(gè)能正常表達(dá)的

基因，具有自己的啟動(dòng)子和終止子。

4.受體細(xì)胞不同，標(biāo)記基因種類也不同：受體細(xì)胞為細(xì)菌時(shí)，標(biāo)記基因通常是抗生素抗性基因；受體細(xì)胞

為真核細(xì)胞，尤其是動(dòng)植物細(xì)胞時(shí)，抗生素很多時(shí)候不能殺死未標(biāo)記的細(xì)胞，無(wú)法起到篩選的效果，此時(shí)

標(biāo)記基因通常選擇熒光基因等。

好答題技巧

技巧02失去一個(gè)標(biāo)記基因的載體才是好載體

（2023?湖北?高考真題）用氨芳青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetD作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒

如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并

轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

HindUI

PvuI

SphI

Seal7-Sall

A.若用Hind回酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同

B.若用Pvu國(guó)酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用Sph國(guó)酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否

D.若用Sph國(guó)酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨葦青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落

【技巧點(diǎn)撥】【核心】失去一個(gè)標(biāo)記基因的載體才是好載體-雙標(biāo)記方法：將目的基因插入含有兩種抗生素抗

性基因的載體時(shí)，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。

【思路詳解】A、若用Hind回酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正

確。

B、若用Pvu國(guó)酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因（TetR）,因此在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌

落，不一■定含有目的基因，B正確；

C、DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)

建成功與否，C正確；

D、Sph國(guó)的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，若用Sph回酶切，重組質(zhì)粒中含氨芳青霉素抗性基因（AmpR）,

因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨葦青霉素）的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成

菌落，D錯(cuò)誤。

【答案】D

財(cái)模板運(yùn)用

（2023?山西?高考真題）某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩

端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位

點(diǎn)如圖所示。

5'—GAATTC_3f5'_GGATCC—3'5'_CCCGGG—3'5'—AGATCT—3f

3'—CTTAAG—5'3'_CCTACp—5'3'_GGGCCC_5'3'_TCTAQA—5'

tttt

酶1酶2酶3酶4

下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（）

A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.DNA連接酶連接

B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接

C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接

D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接

【答案】C

【核心】失去一個(gè)標(biāo)記基因的載體才是好載體

【詳解】A、酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A錯(cuò)誤；

B、質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B錯(cuò)誤；

C、質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在

質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C正確；

D、若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少

標(biāo)記基因，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D錯(cuò)誤。

/〃〃///〃/〃〃〃/〃〃〃〃〃〃/〃〃/〃〃///旗江塞破〃/〃〃/〃/〃〃〃〃/〃/〃〃〃〃/〃〃〃/〃/,

1.Sau3Al和BamHI的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如表所示。某DNA分子經(jīng)Sau3AEI和BamHEI分別切割以后，可形

成4個(gè)和2個(gè)大小不同的片段。下列有關(guān)敘述正確的是（）

限制酶名稱識(shí)別序列和切割位點(diǎn)

BamHIGJGATCC

Sau3AI4/GATC

A.兩種限制酶切割后形成的黏性末端不相同

B.能被Sau3AI識(shí)別的DNA位點(diǎn)均能被BamHI識(shí)別

C.該DNA分子上有2個(gè)BamH因不能識(shí)別但Sau3A國(guó)能識(shí)別的酶切位點(diǎn)

D.該DNA分子經(jīng)Sau3AEI和BamHEI共同切割后可形成6個(gè)片段

【答案】C

【詳解】A、BamHI和Sau3Al兩種限制酶切割后形成的黏性末端均為GATC,A錯(cuò)誤;

B、分析表格可知，BamHI的識(shí)別序列為GGATCC,Sau3AI的識(shí)別序列為GATC,由此可知，能被BamHI識(shí)

別的序列中包含了被Sau3AI識(shí)別的序列，所以能被BamHI識(shí)別的序列也一定能被Sau3AI識(shí)別，但能被

Sau3AI識(shí)別的DNA位點(diǎn)不一定能被BamHI識(shí)別，B錯(cuò)誤；

C、分析題意，某DNA分子經(jīng)Sau3Al和BamHI分別切割以后，可形成4個(gè)和2個(gè)大小不同的片段，由此

可知，該DNA分子上有2個(gè)BamHI不能識(shí)別但Sau3AI能識(shí)別的酶切位點(diǎn)，C正確；

D、該DNA分子上有4個(gè)Sau3AI的酶切位點(diǎn)，有2個(gè)BamHI的酶切位點(diǎn)，但是BamHI識(shí)別序列中包含Sau3AI

的識(shí)別序列，所以同時(shí)用兩種酶共同處理，不會(huì)形成6個(gè)大小不同的DNA片段，D錯(cuò)誤。

2.大腸桿菌經(jīng)溶菌酶和洗滌劑處理后，擬核DNA就會(huì)纏繞在細(xì)胞壁碎片上，靜置一段時(shí)間，質(zhì)粒分布在上

清液中，利用上述原理可初步獲得質(zhì)粒DNA。用三種限制酶處理提取的產(chǎn)物，電泳結(jié)果如圖所示。下列關(guān)

于質(zhì)粒的粗提取和鑒定的敘述不正確的是（）

-邛艮制酶I

二_2限制酶n

---3限制酶田

123

A.提取DNA時(shí)可加入酒精，使溶于酒精的蛋白質(zhì)等物質(zhì)溶解

B.將提取的DNA溶于2mol/LNaCI溶液后；可用二苯胺試劑進(jìn)行鑒定

C.電泳鑒定DNA利用了DNA在電場(chǎng)中會(huì)向著它所帶電荷相反的電極移動(dòng)的原理

D.根據(jù)電泳結(jié)果，質(zhì)粒上一定沒(méi)有限制酶I和團(tuán)的切割位點(diǎn)，而有限制酶團(tuán)的切割位點(diǎn)

【答案】D

【詳解】A、由于蛋白質(zhì)可溶于酒精，而DNA在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA時(shí)加入酒精，使溶

于酒精的蛋白質(zhì)等物質(zhì)溶解，而讓DNA析出，A正確；

B、由于DNA在2moi/LNaCI溶液中溶解度較大，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，所以將提取的DNA溶于

2moi/LNaCI溶液后，可用二苯胺試劑在沸水條件進(jìn)行鑒定，B正確；

C、DNA帶負(fù)電，電泳鑒定DNA利用了DNA在電場(chǎng)中會(huì)向著它所帶電荷相反的電極移動(dòng)的原理，C正確；

D、因?yàn)橘|(zhì)粒的本質(zhì)是環(huán)狀的DNA,限制酶I和H處理后電泳只有一條條帶，可能是該質(zhì)粒上有一個(gè)切割位

點(diǎn)，也可能沒(méi)有切割位點(diǎn)，D錯(cuò)誤。

3.BamHKMboLSmal三種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)依次為5'-GJGATCC-3,、5UGATC-3,、5M：CCUGGG-3,。

下圖表示某DNA片段的部分堿基序列，已知其余序列不含這三種限制酶的識(shí)別序列。下列敘述正確的是（）

5?11111111rr',i?I'iji111r"i111111rni1111111113’

GGATCCCpPGGGCCCGGGGGATCC

CCTAGGGfcbcCCGGGCCCCCTAGG

3”1111山?11他山11?」1山邛??山111111115,

[634bp-------896bp*758bp?

A.若用Smal完全切割該DNA,則其產(chǎn)物的長(zhǎng)度為634bp、896bp、758bp

B.若虛線方框內(nèi)的堿基對(duì)被T-A替換，則用Smal完全切割該DNA可產(chǎn)生3種片段

C.若用Mbol和BamHI切割DNA,可形成相同的黏性末端

D.用Smal切割DNA產(chǎn)生的片段，可用E.coliDNA連接酶重新將其連接

【答案】C

【詳解】A、限制酶SmaI的酶切位點(diǎn)是5—CCC；GGG-3',在圖1中有兩個(gè)限制酶SmaI的酶切位點(diǎn)，DNA

將被切割成三個(gè)片段，結(jié)合圖解，三個(gè)片段的長(zhǎng)度分別是637bp、890bp、761bp,A錯(cuò)誤；

B、發(fā)生堿基對(duì)替換后，基因中只有一個(gè)限制酶Smal酶切位點(diǎn)，用Smal完全切割后出現(xiàn)長(zhǎng)度分別是

634+896-3=1527bp、761bp的兩種片段，B錯(cuò)誤；

C、由題可知，Mbol和BamHI識(shí)別序列的中間序列相同，因此若用Mbol和BamHI切害UDNA,可形成相同

的黏性末端，C正確；

D、用Smal切割DNA產(chǎn)生的片段產(chǎn)生的是平末端，E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，不能連接平末端，

4.從圖甲酶切結(jié)果分析，圖乙中目的基因（長(zhǎng)度為2Qkb）插入方向正確的重組質(zhì)粒序號(hào)和作出該判斷所

用的限制酶是（）

EcoRI

圖甲

A.②，BamHEB.①，EcoR0

C.①，EcoREI和HindEID.②，EcoRIB和HindEI

【答案】C

【詳解】分析圖1可知，重組質(zhì)粒被EcoRI酶切后，得到5.8kb的片段，說(shuō)明重組質(zhì)粒中只有一個(gè)EcoRI

的酶切位點(diǎn)；重組質(zhì)粒被BamHI酶切后產(chǎn)生3.8kb和2.0kb兩種片段，說(shuō)明重組質(zhì)粒中有2個(gè)BamHI的酶

切位點(diǎn)；重組質(zhì)粒被EcoRI和Hindlll酶切后，產(chǎn)生4.5kb和1.3kb兩種片段，說(shuō)明重組質(zhì)粒中有EcoRI和

HindHI的酶切位點(diǎn)，且二種酶切位點(diǎn)之間的片段為4.5kb和：L3kb。結(jié)合圖2分析可知，重組質(zhì)粒①符合上

述分析的結(jié)果，重組質(zhì)粒②中EcoRI和Hindlll酶切位點(diǎn)之間的片段為2.3kb和3.5kb,不符合圖1酶切的結(jié)

果。綜上所述，C正確，ABD錯(cuò)誤。

5.如圖表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制備疫苗的相關(guān)過(guò)程，SUC2是酵母菌的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，其表

達(dá)產(chǎn)物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成單糖被細(xì)胞利用，其中m、n分別是啟動(dòng)子和終止子。下表中是

可供選擇使用的限制酶及其識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)。據(jù)圖表推測(cè)，下列敘述錯(cuò)誤的是（）

,,NcoI

N>，SphI

SUC2

?NheI

.Sau3AI突變型_3蛋白

BamHI酵母菌（疫苗）

目的基因S

a鏈

GATCCAT--CGGATCG--GGC

GTA…GCCTAGC…CCGGTAC,5小鏈

限制酶BamH團(tuán)Nhe團(tuán)Neo團(tuán)Sph回Sau3A回

識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)5'-G必GATCC-3'5'-G4/CTAGC-3'5'-C必CATGG-3'5'-GCATGx|/C-3'5'->GATC-3'

A.過(guò)程①所需的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶

B.過(guò)程②所使用的兩種限制酶是Sau3AI3和Nco0

C.據(jù)圖推測(cè)，目的基因S轉(zhuǎn)錄的模板鏈最可能是b鏈

D.SUC2可作標(biāo)記基因，對(duì)導(dǎo)入B的酵母菌進(jìn)行篩選

【答案】C

【詳解】A、過(guò)程①表示RNA—DNA,是逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，A正確；

B、②過(guò)程為對(duì)DNA進(jìn)行切割形成黏性末端，需要兩種限制性內(nèi)切酶，因目的基因的黏性末端序列分別為

5'-GATC-3\3'-GATC-5',然后結(jié)合表格中給出的限制酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)，確定選用的兩種酶分別是

Sau3AI、Ncol,B正確；

C、結(jié)合質(zhì)粒上限制酶的酶切位點(diǎn)可知，目的基因a鏈位于圖中重組質(zhì)粒的內(nèi)側(cè)，b鏈位于外側(cè)；而轉(zhuǎn)錄方

向?yàn)閙-n,為確保轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從5，一3,延伸，因此轉(zhuǎn)錄只能從模板鏈的為3,端開(kāi)始，因此a鏈?zhǔn)悄０彐?，C

錯(cuò)誤；

D、SUC2作為B上的標(biāo)記基因，可以對(duì)導(dǎo)入B的酵母菌進(jìn)行篩選，D正確。

6.下列有關(guān)實(shí)驗(yàn)操作的說(shuō)法，正確的是（）

A.克隆時(shí)，用Ca2+載體或蛋白酶合成抑制劑激活重構(gòu)胚使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程

B.電泳時(shí)，將PCR產(chǎn)物與含有染色劑的凝膠載樣緩沖液混合后，加入點(diǎn)樣孔

C.提取DNA時(shí)，在研磨液中加入切碎的洋蔥，充分研磨后過(guò)濾，棄去上清液

D.體外受精時(shí)，用高濃度的ATP溶液處理采集到的精子使其獲能

【答案】A

【詳解】A、用電刺激、Ca2+載體、乙醇或蛋白酶合成抑制劑等方法激活重構(gòu)胚，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育

進(jìn)程，A正確；

B、載樣緩沖液中的指示劑不與DNA結(jié)合，起到指示電泳進(jìn)程的作用，凝膠中的DNA分子通過(guò)與核酸染料

結(jié)合，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)，B錯(cuò)誤；

C、提取DNA時(shí)，將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過(guò)濾，棄去沉淀物，收集上清液，C錯(cuò)誤；

D、精子獲能指的是獲得受精的能力，而不是獲得能量，采集到的精子需用專門的獲能液處理使其獲能，D

錯(cuò)誤。

7.由于PCR擴(kuò)增出的目的基因末端為平末端，且無(wú)合適的限制酶識(shí)別序列，需借助中間載體P將目的基因

接入載體E,圖示為兩種載體的結(jié)構(gòu)和相關(guān)限制酶的識(shí)別序列。下列敘述正確的是（）

—GGTAct—

—GAGCTp—―C^kCGTC―—GGG42CC——CpATGG—

"KPHI

XhoYPstISinaI

A.構(gòu)建重組載體P時(shí)，應(yīng)選擇EcoRV或Smal進(jìn)行酶切，再用T4DNA連接酶連接

B.要使中間載體P接入載體E,同時(shí)防止自身環(huán)化，可選用Xhol和PstI進(jìn)行酶切

C.載體P不能作為基因表達(dá)載體，因?yàn)樗缓鹗济艽a子和終止密碼子

D.若受體細(xì)胞表現(xiàn)出抗性基因的相應(yīng)性狀，表明重組載體成功導(dǎo)入受體細(xì)胞

【答案】B

【詳解】AB、由于載體E只有產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，要使中間載體P接入載體E,同時(shí)防止載體E自身

環(huán)化，需要用兩種限制酶分別切割載體E和中間載體P,據(jù)圖可知，中間載體P和載體E均含有Xhol和PstI

酶識(shí)別序列，故可選用Xhol和PstI酶進(jìn)行酶切，載體P的這兩種酶識(shí)別序列中含有EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，并且

其切割的為平末端，可以用于連接目的基因，Smal酶雖然也能切割得到平末端，但是其識(shí)別位點(diǎn)沒(méi)有位于

Xhol和PstI酶識(shí)別位點(diǎn)之間，故不能選擇其對(duì)中間載體P進(jìn)行切割，連接平末端只能用T4DNA連接酶，A

錯(cuò)誤，B正確；

C、由圖可知，不直接選擇P構(gòu)建表達(dá)載體是因?yàn)樗缓瑔?dòng)子與終止子，C錯(cuò)誤；

D、受體細(xì)胞表現(xiàn)出??抗性基因的相應(yīng)性狀，可能是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，也可能只導(dǎo)入了空質(zhì)粒（不含目的

基因的質(zhì)粒），D錯(cuò)誤。

8.如圖表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制備疫苗的相關(guān)過(guò)程，SUC2是酵母菌的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，其表

達(dá)產(chǎn)物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成單糖被細(xì)胞利用，其中m、n分別是啟動(dòng)子和終止子。下表中是

可供選擇使用的限制酶及其識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)。據(jù)圖表推測(cè)，下列敘述錯(cuò)誤的是（）

A.過(guò)程①所需的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶

B.過(guò)程②所使用的兩種限制酶是Sau3A團(tuán)和Nco0

C.據(jù)圖推測(cè)，目的基因S轉(zhuǎn)錄的模板鏈最可能是b鏈

D.SUC2可作標(biāo)記基因，對(duì)導(dǎo)入B的酵母菌進(jìn)行篩選

【答案】C

逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶

【詳解】A、過(guò)程①表示RNA-DNA雙鏈的過(guò)程，其中需經(jīng)過(guò)RNA-DNA單鏈-DNA雙鏈，所以

過(guò)程①所需的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，A正確；

B、②過(guò)程為對(duì)DNA進(jìn)行切割形成黏性末端，需要兩種限制性核酸內(nèi)切酶，從黏性末端可看出是識(shí)別序列分

別為5'-GIGATCC-375'-IGATC-3'、5'-CICATGG-3',因此選用的兩種酶分別是Nhel/Sau3AI、Ncol,B正確；

C、結(jié)合質(zhì)粒上限制酶酶切位點(diǎn)可知，目的基因的上鏈位于重組質(zhì)粒的內(nèi)側(cè)，下鏈位于外側(cè)，轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閙

-n,且轉(zhuǎn)錄只能從模板鏈的為3,端開(kāi)始，因此上鏈（a鏈）是模板鏈（3，一5,方向與m-n相同），C錯(cuò)誤;

D、SUC2是酵母菌的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，SUC2作為B上的標(biāo)記基因，可以對(duì)導(dǎo)入B的酵母菌進(jìn)行篩選，D對(duì)。

9.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉可以有效殺死棉鈴蟲(chóng)，其原理是Bt基因表達(dá)的產(chǎn)物Bt抗蟲(chóng)蛋白能與棉鈴蟲(chóng)腸道上皮細(xì)

胞表面的特異性受體結(jié)合，使細(xì)胞膜穿孔，導(dǎo)致棉鈴蟲(chóng)死亡。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）

A.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉的培育利用的原理是基因重組

B.Bt基因在抗蟲(chóng)棉細(xì)胞中表達(dá)需要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程

C.培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉時(shí)，導(dǎo)入Bt基因的受體細(xì)胞不能是棉花的葉肉細(xì)胞

D.若棉鈴蟲(chóng)腸道上皮細(xì)胞表面特異性受體發(fā)生改變，可能會(huì)影響抗蟲(chóng)效果

【答案】C

【詳解】A、轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉的培育過(guò)程，利用的是轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其原理是基因重組，A正確；

轉(zhuǎn)錄翻譯

B、Bt基因在抗蟲(chóng)棉細(xì)胞中表達(dá)需要經(jīng)過(guò)Bt基因—mRNA-Bt抗蟲(chóng)蛋白的過(guò)程，B正確；

C、培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉時(shí)，導(dǎo)入Bt基因的受體細(xì)胞可以是棉花的葉肉細(xì)胞，C錯(cuò)誤；

D、若棉鈴蟲(chóng)腸道上皮細(xì)胞表面特異性受體發(fā)生改變，則Bt抗蟲(chóng)蛋白就不能與其結(jié)合，進(jìn)而不會(huì)使細(xì)胞膜

穿孔，棉鈴蟲(chóng)不會(huì)死亡，影響抗蟲(chóng)效果，D正確。

10.某科研小組用PCR擴(kuò)增酵母菌的rRNA基因。PCR包括多個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)可以分為變性、退火、延伸

3個(gè)步驟。下列敘述正確的是（）

A.設(shè)計(jì)引物時(shí)需知道rRNA基因的部分序列

B.延伸時(shí)間取決于酵母菌基因組DNA的長(zhǎng)度

C.引物濃度大小不會(huì)影響PCR擴(kuò)增獲得酵母菌rRNA基因的數(shù)量

D.PCR反應(yīng)前常對(duì)微量離心管進(jìn)行離心以確保反應(yīng)液分散于管內(nèi)

【答案】A

【詳解】A、PCR擴(kuò)增需要引物，設(shè)計(jì)引物時(shí)需知道rRNA基因的部分序列，A正確；

B、延伸時(shí)間取決于需要擴(kuò)增部分的長(zhǎng)度，不是基因組DNA長(zhǎng)度，B錯(cuò)誤；

C、復(fù)制需要引物與模板結(jié)合，每條DNA鏈復(fù)制都需要消耗一個(gè)引物，故引物濃度大小會(huì)影響PCR擴(kuò)增獲

得酵母菌rRNA基因的數(shù)量，C錯(cuò)誤；

D、PCR反應(yīng)前常對(duì)微量離心管進(jìn)行離心以確保反應(yīng)液集中在管底部，D錯(cuò)誤。

11.利用PBR322質(zhì)粒將人胰島素基因?qū)氪竽c桿菌（如圖1）可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。為檢驗(yàn)基因表達(dá)載體是

否成功導(dǎo)入，將處理后的大腸桿菌接種在培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的四個(gè)菌落用無(wú)菌紙分別蓋印至四種不同的培養(yǎng)

基上（如圖2,菌落相對(duì)位置不變），菌落生長(zhǎng)狀況如圖所示，則成功導(dǎo)入基因表達(dá)載體的菌落是（）

“抗四環(huán)素基因

圖?

1??2

無(wú)抗生素

的培養(yǎng)基含氨羊青毒含四環(huán)素氟節(jié)青霍+四環(huán)素的埼養(yǎng)基

素的埼養(yǎng)基的埼養(yǎng)基

002

A.菌落1、2、3B.菌落1

C.菌落2、3D.菌落4

【答案】C

【詳解】從圖1看出，胰島素基因和PBR322質(zhì)粒都用了限制酶BamHI進(jìn)行切割，而質(zhì)粒上的BamHI切

割位點(diǎn)在抗四環(huán)素基因的位置，因此基因表達(dá)載體不抗四環(huán)素，但由于含有抗氨葦青霉素基因，所以該導(dǎo)

入成功的細(xì)菌可以抗氨葦青霉素，即菌落不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但能夠在含有青霉素的培養(yǎng)

基上生長(zhǎng)；

從圖2看出，菌落2和菌落3在含有氨革青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，

因此菌落2、3是成功導(dǎo)入基因表達(dá)載體的菌落。

12.乙肝病毒基因工程疫苗的生產(chǎn)和使用流程如圖，質(zhì)粒中LacZ基因可使細(xì)菌能夠利用物質(zhì)X-gal,從而使

菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，若無(wú)該基因，菌落則呈白色。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

A.過(guò)程①中目的基因和載體重組的效率與載體和目的基因的濃度及比例等有關(guān)

B.過(guò)程②需要在培養(yǎng)基中加青霉素和X-gal以獲得呈藍(lán)色的大腸桿菌菌落

C.大腸桿菌是否成功表達(dá)出乙肝病毒外殼，可用抗原一抗體雜交法進(jìn)行檢測(cè)

D.該基因工程疫苗不會(huì)出現(xiàn)乙肝病毒感染和增殖的情況，安全性高

【答案】B

【詳解】A、①獲取目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒過(guò)程中，增加載體和目的基因的濃度及比例，可以增加目的基

因與質(zhì)粒碰撞機(jī)會(huì)，提高目的基因和載體重組的效率，A正確；

B、過(guò)程表②示將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞，培養(yǎng)基中加青霉素和X-gal可以用于篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿

菌，BamHI和EcoRI由于破壞了質(zhì)粒中LacZ基因，卻保留了青霉素抗性基因，故白色的大腸桿菌菌落才為

所需菌落，B錯(cuò)誤；

C、乙肝病毒外殼為蛋白質(zhì)，可用抗原一抗體雜交法檢測(cè)大腸桿菌是否成功表達(dá)出乙肝病毒外殼，C正確；

D、基因工程疫苗由于只利用了乙肝病毒的外殼，不含其遺傳物質(zhì)，所以不能完成病毒的增殖和感染，D對(duì)。

13.在人胰島素A鏈基因前端加入甲硫氨酸編碼序列，置于B-半乳糖昔酶基因（不含終止編碼序列）末端，

插入到質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌（缺失內(nèi)源性B-半乳糖昔酶基因），經(jīng)培養(yǎng)、切割和純化等得到成熟胰島素

A鏈，回答下列問(wèn)題：

白色藍(lán)色

氨羊澳化素蛋白

青霉素切割_純化.成熟胰

島素A鏈

大腸桿菌

P-半乳糖昔酶分解

X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)

甲說(shuō)氨Si胰島素

編碼序列A鏈基因

⑴使用限制酶和對(duì)質(zhì)粒和插入DNA片段進(jìn)行切割。

(2)在轉(zhuǎn)化大腸桿菌前，一般先用處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于容易吸收重組DNA分子的生理狀態(tài)。

⑶重組DNA分子在大腸桿菌中開(kāi)始轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶首先結(jié)合的位點(diǎn)是o

⑷將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布在含氨葦青霉素和X-gal的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，若觀察到____色菌落，可以確定

大腸桿菌成功表達(dá)胰島素A鏈，原因是。另一種顏色的菌落中可能不含重組DNA分子，在不考慮突變

的情況下，這些菌落不含重組DNA分子的原因是。

⑸澳化鼠可以在甲硫氨酸殘基C端切割肽鏈，成熟的人胰島素A鏈不含甲硫氨酸殘基。使用澳化氧在甲硫

氨酸殘基C端切割的目的是。

【答案】⑴HindlllBamHI

(2)Ca2+

⑶啟動(dòng)子

(4)藍(lán)大腸桿菌缺失內(nèi)源性B-半乳糖昔酶基因，導(dǎo)入成功的大腸桿菌含有的重組質(zhì)粒中含有B-

半乳糖甘酶基因，表達(dá)出的半乳糖昔酶分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色目的基導(dǎo)入不成功

(5)切割B-半乳糖甘酶和胰島素A鏈結(jié)合而成的融合蛋白，獲得成熟的人的胰島素

【詳解】(1)據(jù)圖分析，EcoRI和EcoRV都會(huì)破壞目的基因，故不能選擇，且Sacl會(huì)破壞復(fù)制原點(diǎn)，也不能

選擇，則目的基因左側(cè)只能選擇BamHI,右側(cè)應(yīng)選擇與質(zhì)粒共同的酶，即Hindlll,故使用限制酶BamHI和

Hindlll對(duì)質(zhì)粒和插入DNA片段進(jìn)行切割。

(2)在轉(zhuǎn)化大腸桿菌前，一般先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于容易吸收重組DNA分子的生理狀態(tài)。

(3)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)，可用于驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，故重組DNA分子在大腸桿菌中開(kāi)

始轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶首先結(jié)合的位點(diǎn)是啟動(dòng)子。

(4)分析題意，大腸桿菌缺失內(nèi)源性8-半乳糖昔酶基因，若導(dǎo)入成功，則重組質(zhì)粒中含有B-半乳糖甘酶

基因，表達(dá)出的8-半乳糖普酶分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色；另一種顏色(白色)的菌落中可能不含重組DNA分子，

在不考慮突變的情況下,這些菌落不含重組DNA分子的原因是導(dǎo)入率并非100%,故可能是因?yàn)閷?dǎo)入不成功。

(5)在人胰島素A鏈基因前端加入甲硫氨酸編碼序列,置于B-半乳糖昔酶基因(不含終止編碼序列)末端，

澳化氟可以切割B-半乳糖昔酶和胰島素A鏈結(jié)合而成的融合蛋白，獲得成熟的人的胰島素。

14.科研人員利用圖1所示材料構(gòu)建重組質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌，以