實(shí)驗(yàn)DNA的瓊脂糖凝膠電泳職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)一實(shí)

職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)實(shí)驗(yàn)

DNA的瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

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二、實(shí)驗(yàn)原理1.核酸分子是兩性解離分子，pH3.5時(shí)堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有一個(gè)磷酸解離，所以分子帶正電，在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng)；而pH8.0-8.3時(shí)，堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對(duì)泳動(dòng)速度影響不大。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)2.瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小，DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。-+職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

3.瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子，含有不同濃度的瓊脂糖凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，可用于分離不同濃度范圍的核酸分子。瓊脂糖凝膠適合分離長(zhǎng)度100bp至60Kb的分子，選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小范圍的DNA分子。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)4.核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠(EB)。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間。在紫外線照射EB-DNA復(fù)合物時(shí)，可以發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度跟DNA的濃度呈正比。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)三、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：1、儀器及耗材水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、100mL或250mL錐形瓶、量筒、槍頭等2、試劑(1)50XTAE緩沖液(2MTris-乙酸，0.05MEDTA)。(2)6X上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%甘油(3)

EB替代物、低熔點(diǎn)瓊脂糖(4)DNA樣品、DNAMarker職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

溴酚蘭在0.5%~1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度大約相當(dāng)于300bp的線性DNA的泳動(dòng)速度，而二甲苯青FF的泳動(dòng)速度相當(dāng)于4Kb的雙鏈線形DNA的泳動(dòng)速度。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)四、實(shí)驗(yàn)步驟職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)1、按所分離的DNA分子的大小范圍和樣品數(shù)量，稱取適量的瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的1XTAE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。冷卻至60°C左右，在膠液內(nèi)加入適量的核酸染料（10μL/100ml）。2、取制膠板槽，膠槽四周封嚴(yán)，水平放置膠槽，在一端插好梳子，向槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60°C左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。3、待膠凝固后，將膠槽放到電泳槽內(nèi)，使加樣孔端置負(fù)極端，注入1XTAE電泳緩沖液至液面覆蓋過膠面，小心拔出梳子。4、把待檢測(cè)的樣品，按以下量（1μI加樣緩沖液(6×)+5μI待測(cè)DNA樣品）在潔凈載玻片上小心混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中，編好加樣順序。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)5、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出，電壓最高不超過5V/cm，開始電泳。6、觀察溴酚蘭的帶(藍(lán)色)的移動(dòng)。當(dāng)其移動(dòng)至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳。7、在紫外透視儀的樣品臺(tái)上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈(36