T-LNEMA 019-2024 水體中抗生素原位采樣分析技術(shù)規(guī)程-薄膜擴散梯度（DGT）法

水體中抗生素原位采樣分析技術(shù)規(guī)程—薄膜擴散梯度（DGT）法TechnicalRegulationsforInSituS—DiffusiveGradientsinThinFilms(DIT/LNEMA019—2024前言 II 12規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4方法原理 5材料及試劑 6儀器和設(shè)備 48水體中抗生素的測定步驟 9結(jié)果計算 10精密度和準(zhǔn)確度 8T/LNEMA019—2024本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省大連水文局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省環(huán)境監(jiān)測協(xié)會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省大連水文局、大連理工大學(xué)、大連市生態(tài)環(huán)境事務(wù)服務(wù)中心、大連計量檢驗檢測研究院有限公司、遼寧省生態(tài)環(huán)境事務(wù)服務(wù)中心、遼寧省水資源管理和生態(tài)環(huán)保產(chǎn)業(yè)集團、遼寧省生態(tài)環(huán)境廳、遼寧省生態(tài)環(huán)境保護科技中心、遼寧省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、遼寧省撫順?biāo)木帧⑦|寧省遼陽生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、蘇州科技大學(xué)等。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：孫大明、譚峰、趙輝、王主華、王丹陽、馬芮、王陽、李崇、劉首正、原暉、邸俊強、夏春龍、唐賀、趙璐璐、白玉花、汪琛棋、屈興勝、柴浩、徐明晗、郭一冰、趙云、董淑玲、楊瑞豐、武暕、張子伯、趙德君。1T/LNEMA019—2024水體中抗生素原位采樣分析技術(shù)規(guī)程—薄膜擴散梯度（DGT）法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水體中抗生素含量的薄膜梯度擴散（DGT）法測定流程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、海水、工業(yè)廢水和生活污水中的氟喹諾酮類、磺胺增效劑甲氧芐基嘧啶以及磺胺類抗生素的原位采樣分析。2規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)引用下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。HJ495-2009水質(zhì)采樣方案設(shè)計技術(shù)規(guī)定HJ494-2009水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)GB/T14581-1993水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)GB3838-2002地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB5084-2021農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB8978-1996污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)GB5749-2022生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、GB3097-1997海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)HY/T147.1-2013海洋監(jiān)測技術(shù)規(guī)程第1部分：海水DB22/T2838-2017生活飲用水及水源水中10中抗生素的檢驗方法超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法DB21/T3286-2020水質(zhì)5種磺胺類抗生素的測定固相萃取高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法DB32/T3771-2020漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類抗生素測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法DB37/T3738-2019水質(zhì)磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的測定固相萃取/液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法DB65/T3951-2016水質(zhì)多種藥物殘留量的測定液相色譜串聯(lián)譜法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1抗生素antibiotics本標(biāo)準(zhǔn)中的抗生素主要指氟喹諾酮類抗生素、磺胺類抗生素以及磺胺增效劑甲氧芐基嘧啶等有機污染物。3.2原位測定insitumeasurement指在不擾動樣本原有狀態(tài)的前提下，獲得關(guān)于其化學(xué)、物理、生物性質(zhì)的數(shù)據(jù)，保證待測物質(zhì)的形態(tài)和濃度不發(fā)生變化。3.3薄膜擴散梯度diffusivegradientinthinfilms一種新型被動采樣技術(shù)，標(biāo)準(zhǔn)的DGT裝置由結(jié)合相，擴散相，濾膜以及固定這三層膜結(jié)構(gòu)的塑料外套組成。利用具有一定厚度的擴散相凝膠將能夠與目標(biāo)物發(fā)生不可逆結(jié)合的結(jié)合相和待測環(huán)境隔開，2T/LNEMA019—2024待測物擴散通過擴散相凝膠后被結(jié)合相吸附。在材料的有效吸附容量內(nèi)，目標(biāo)物的富集量與富集時間有關(guān)，從而可以通過測定結(jié)合相上目標(biāo)物的質(zhì)量確定外界環(huán)境中待測目標(biāo)物的濃度。3.4DGT結(jié)合相DGTbindinggelDGT結(jié)合相是指DGT方法中用于吸附待測物的薄膜，組裝到DGT結(jié)構(gòu)的最內(nèi)層，常用的結(jié)合相材料為聚合物樹脂、商業(yè)SPE柱填料和新型吸附材料。3.5DGT擴散相DGTdiffusivegelDGT的擴散相是指為待測分子提供擴散通道的薄膜，組裝在DGT結(jié)構(gòu)的中間層，是定量計算的基礎(chǔ)。常用的擴散相材料有包括瓊脂糖交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠(APA)和瓊脂糖凝膠。3.6DGT濾膜filtermembraneDGT裝置的濾膜一般指內(nèi)部孔徑為0.45μm的濾膜，常用的DGT濾膜有聚偏氟乙烯膜(PVDF)、硝酸纖維素膜(CN)、醋酸纖維素膜和親水性聚醚砜濾膜(PES)。3.7擴散系數(shù)diffusivecoefficient擴散系數(shù)是指目標(biāo)離子在單位時間每單位濃度梯度的條件下、以擴散的方式垂向通過單位面積擴散相的質(zhì)量或摩爾數(shù)。它是一個衡量某種物質(zhì)分子通過隨機運動在另一種物質(zhì)中傳播速度的指標(biāo)。4方法原理DGT技術(shù)是以Fick第一擴散定律為理論基礎(chǔ)，整個裝置由結(jié)合相、擴散相和濾膜以及固定這三層膜的上下兩部分的塑料外套（AES樹脂）組成（圖1）。塑料蓋子可以卡在底座上，使底座、吸附膜、擴散膜、濾膜無縫接觸，蓋子上有直徑為2cm的窗口，待測物質(zhì)通過窗口擴散進入內(nèi)部凝膠。圖1DGT裝置以及采樣原理圖其中，濾膜主要用來避免外界顆粒物進入裝置內(nèi)部，擴散相提供待測分子的擴散通道，而結(jié)合相對待測物質(zhì)具有吸附作用，可以根據(jù)不同的分析物選擇不同的結(jié)合相材料。外部分析物通過濾膜以及擴散相，最終固定在結(jié)合相上。通過測量結(jié)合相上吸附目標(biāo)物的質(zhì)量（M）可以實現(xiàn)對外界環(huán)境濃度（Cb）的定量。由于擴散相的存在，使得在裝置表面擴散紊流層占總體擴散通路比率大大減小，在流動良好的水體，紊流層厚度(δ)可以忽略不計。在靜態(tài)水中，也可以使用不同厚度的擴散相裝置進行準(zhǔn)確定量紊流層厚度。另外，參數(shù)擴散系數(shù)是每個目標(biāo)物特有的參數(shù)，可以在實驗室條件下單獨測定得到，此參數(shù)受實際環(huán)境條件影響很小，可以直接應(yīng)用于實際采樣過程中的計算，無需額外校正，相較于其他被動采樣器，定量準(zhǔn)確性大大提高。3T/LNEMA019—2024此外，在DGT實際采樣過程中，復(fù)雜、多變的環(huán)境介質(zhì)往往會對結(jié)合相表面電荷狀況、目標(biāo)物的狀態(tài)等造成影響，但實驗表明當(dāng)pH在4~9的變化范圍內(nèi)、離子強度0.001~0.75mol/L的范圍內(nèi)、溶解性有機質(zhì)（DOM）介于0~20mg/L的范圍內(nèi)時，DGT裝置的采樣性能幾乎不受外界環(huán)境干擾。而在自然環(huán)境中，不同水體的pH、離子強度和溶解性有機質(zhì)（DOM）濃度普遍在5~8.5，0.01-0.5mol/L和1~20mg/L范圍內(nèi)，因此，實際采樣時復(fù)雜的外界環(huán)境條件DGT采樣的效果沒有明顯的影響。5材料及試劑所使用的試劑除了另有說明外，均為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純，實驗用水為新鮮制備的去離子水或蒸餾水。5.1材料DGT裝置、氮氣、DGT有機玻璃投放器、浮標(biāo)、手持式GPS儀、溫度計、塑封袋、10mL離心管等。5.2試劑5.2.1純水實驗室用水應(yīng)為一級水、應(yīng)符合GB/T6682相關(guān)要求。5.2.2乙腈（CH3CN）液相色譜純。5.2.3甲醇（CH3OH）液相色譜純5.2.4抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，ρ=1000mg/L準(zhǔn)確稱取10.0mg抗生素標(biāo)準(zhǔn)樣品，用甲醇（5.2.3）溶解并定容到10mL的棕色容量瓶中，配制成1000mg/L抗生素的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，制備的標(biāo)準(zhǔn)貯備液于－20℃以下冷凍、密封、避光保存，保存期5.2.5抗生素標(biāo)準(zhǔn)使用液，ρ=10.0mg/L取抗生素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（5.2.4）1.00mL于100.0mL容量瓶中，甲醇定容，混勻，配制成標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。于－20℃以下避光保存，保存期為90d。5.2.6抗生素內(nèi)標(biāo)儲備液，ρ=100.0mg/L內(nèi)標(biāo)物推薦13C6-磺胺吡啶和環(huán)丙沙星-d8，也可使用其他性質(zhì)相近同位素物質(zhì)。用甲醇（5.2.3）作為溶劑配制，制備的標(biāo)準(zhǔn)貯備液于-20℃以下冷凍、密封、避光保存，保存期為180d。5.2.7抗生素內(nèi)標(biāo)使用液，ρ=1.0mg/L移取適量內(nèi)標(biāo)貯備液（5.2.6用甲醇（5.2.3）稀釋，于-20℃以下避光保存，保存期為90d。6儀器和設(shè)備除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)A級玻璃量器。實驗所涉及的玻璃器皿都經(jīng)過甲醇和超純水的徹底洗滌。4T/LNEMA019—20246.1液相色譜儀液相色譜儀：具紫外檢測器或二極管陣列檢測器。色譜柱：填料為5μmODS，柱長25cm，內(nèi)徑4.6mm的反相色譜柱，或其它等效色譜柱。6.2高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：高效液相色譜具備梯度洗脫功能，質(zhì)譜儀配有電噴霧離子色譜柱：C18柱或其他等效色譜柱，柱長50mm，內(nèi)徑2.1mm，填料粒徑1.7μm，或其他等效色譜柱。6.3微量進樣器微量進樣器：10μL、50μL和100μL。6.4濾膜濾膜：孔徑0.22μm醋酸纖維濾膜、親水性聚丙烯、親水性聚四氟乙烯（PTFE）或其他等效材質(zhì)。6.5分析實驗室通用儀器設(shè)備一般實驗室常用儀器和設(shè)備。7DGT裝置的準(zhǔn)備（1）采用HLB-DGT裝置。該裝置結(jié)合相由通用型HLB填料摻雜于聚丙烯酰胺凝膠中制備而成，擴散膜是瓊脂糖凝膠，厚度分別為0.5mm，0.8mm，1.0mm和1.4mm，濾膜是聚醚砜(PES)。（2）DGT裝置在室溫下保存，已開封包裝的DGT裝置可放在裝有少量0.01MNaCl溶液的自封袋中，保持袋中濕潤，并定期檢查。（3）為防止裝置受到污染，使用前勿使裝置長時間暴露空氣中，勿用手或其他物品接觸DGT裝置暴露窗口。（4）裝置投放前，充氮氣16h以上。8水體中抗生素的測定步驟8.1DGT裝置的投放8.1.1已采集的水樣采集的水樣裝到20L左右的容器中，將已準(zhǔn)備好的DGT裝置放置到容器中固定，保持裝置的采樣窗口朝向水體，并不斷攪動水體（攪拌）。放置一段時間（60h）。8.1.2現(xiàn)場投放（1）將DGT裝置六個為一組固定在有機玻璃投放器上，然后將投放器放置到指定的采樣點沒入水中，用繩子固定。（2）在投放器的尼龍線末端系上浮標(biāo)，確定投放地點的位置，同時進行GPS定位。記錄投放時間，測定水溫、水深、電導(dǎo)率、pH等常規(guī)參數(shù)。（3）DGT裝置在水體中一般持續(xù)放置7天。5T/LNEMA019—20248.2DGT裝置的回收和保存8.2.1已采集的水樣取出DGT裝置，用去離子水沖洗裝置的外表面，取出結(jié)合相后裝入自封袋內(nèi)，滴入幾滴去離子水保濕后，密封保存待分析。8.2.2現(xiàn)場回收通過GPS和浮標(biāo)找到DGT裝置位置，取出DGT裝置，用去離子水沖洗裝置的外表面，取出結(jié)合相后裝入自封袋內(nèi)，滴入幾滴去離子水保濕后，密封保存待分析。8.3DGT采集樣的分析8.3.1DGT結(jié)合相提取從DGT裝置中取出的固定相放到10mL離心管中，使用甲醇/乙酸(9:1v/v)混合溶劑5mL洗脫兩次的方式洗脫回收的DGT結(jié)合相，洗脫后取出固定膜，保存洗脫液待測定。8.3.2提取液的測定DGT洗脫液加入一定量內(nèi)標(biāo)物，經(jīng)過氮吹濃縮至近干，復(fù)溶于1mLLC-MS/MS初始流動相溶液中，過0.22μm的PES濾膜后，采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS/MS)測定抗生素。9結(jié)果計算9.1結(jié)合相上吸附痕量有機污染物質(zhì)量的計算吸附量（M,單位μg）的計算按照方程（1）進行計算：Ce為提取液中目標(biāo)物的濃度，Ve為洗脫液體積，Vg為結(jié)合相體積，fe為目標(biāo)物的洗脫率。9.2DGT平均濃度（CDGT）的計算式中：?g為擴散層厚度（cmD為痕量有機污染物在擴散層中擴散系數(shù)(cm2·s-1)，A為擴散相的開口的面積，t為DGT裝置的放置時間。9.3擴散紊流邊界層（DBL）的計算DGT用于測定水中自由態(tài)離子的濃度存在擴散邊界層δ,所以水體中應(yīng)用DGT時至少需要放置2種不同厚度擴散膜組成的DGT裝置，從而可應(yīng)用下列公式得到兩個方程，其中δ和Cb為未知數(shù)，解方程得到δ的厚度和目標(biāo)物的濃度：6T/LNEMA019—2024（3）式中：M為單位時間內(nèi)的累積量，?g是擴散膜厚度，As指有效采樣面積，t指DGT投放時間，Dg指擴散膜的擴散系數(shù)，Ag指DGT窗口暴露面積，Dw指水體擴散系數(shù)。9.4方法檢出限本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限（MDL）測定步驟如下：1)儀器定量限（LOQLOQ是基于HPLC-MS/MS儀器十倍的信噪比S/N計算得出。2)方法檢出限（MDLMDL是將DGT裝置部署于空白溶液中采樣7天后測得的LOQ，代入公10精密度和準(zhǔn)確度10.1精密度的計算連續(xù)測量同一有證標(biāo)準(zhǔn)樣品6次，用式（4）計算標(biāo)準(zhǔn)偏差Sn：X——n次測量的算術(shù)平均值；Sn——n次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差；相對偏差RSD用式（5）計算：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定3種濃度水平的平行樣品測試結(jié)果(≥6次）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于20%。10.2準(zhǔn)確度的計算準(zhǔn)確度通過測定加標(biāo)回收率來計算，選擇一個有證標(biāo)準(zhǔn)樣品進行加標(biāo)，重復(fù)測定6次，回收率按式（6）計算：（6）式中：?X%——加標(biāo)回收率；X——測定平均值；7T/LNEMA019—2024Xb——樣品本底值Xs——標(biāo)準(zhǔn)值。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定3種濃度水平的樣品加標(biāo)回收率測試結(jié)果，回收率應(yīng)在75%～120%之間。11廢物處理實驗中產(chǎn)生的廢物應(yīng)分類收集，統(tǒng)一保管，并做好相應(yīng)標(biāo)識，委托有資質(zhì)的單位進行處理。8T/LNEMA019—2024附錄A（規(guī)范性附錄）瓊脂糖擴散膜在25℃下的擴散系數(shù)本標(biāo)準(zhǔn)中DGT方法以瓊脂糖疊加PES濾膜作為擴散層，抗生素在瓊脂糖擴散相內(nèi)的擴散系數(shù)通過擴散室法進行測定(圖1.1)，擴散室包括A室和B室，兩室通過瓊脂糖擴散相和聚醚砜濾膜相連，測定時，A室放置有裝有50mL含5mgL-1抗生素溶液(以0.01molL-1NaCl作為背景溶液)，B室僅放置0.