T-SDVMA 002-2024 鴨甲肝病毒3 型熒光RT-PCR 檢測技術(shù)

鴨甲肝病毒3型熒光RT-PCR檢測技術(shù)2024-12-12實(shí)施本文件按照GB/T1/1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。本文件由山東省獸醫(yī)協(xié)會提出并歸口。本文件起草單位：山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心(山東省人畜共患病流調(diào)監(jiān)測中心)、青島嘉智生物技術(shù)有限公司、青島新牧至康生物技術(shù)有限公司、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所、山東新希望六和集團(tuán)有限公司、青島市即墨區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心。本文件主要起草人：蘭鄒然、秦立廷、魏笑笑、黃兵、馬秀麗、王苗利、劉志杰、戴榮蓮、李波、楊曉雪、趙魯、陳婷、孫愛榮、孫偉、武梅、王秋珍、李曉菲、高緒慧。1鴨甲肝病毒3型熒光RT-PCR檢測技術(shù)本文件規(guī)定了鴨甲肝病毒3型實(shí)驗(yàn)室診斷樣品采集與處理，以及熒光RT-PCR檢測方法。本文件適用于鴨甲肝病毒3型的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3.縮略語下列縮略語適用于本文件。DHAV-3:鴨甲肝病毒3型病毒(duckhepatitisAvirustype3)熒光RT-PCR:熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timereversetranscriptpolymerasechainCt值：熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(cyclethreshold)4儀器設(shè)備和試劑耗材4.1儀器設(shè)備4.1.1熒光定量PCR擴(kuò)增儀。4.1.2生物安全柜。4.1.3高速冷凍離心機(jī)。4.1.4核酸提取儀。4.1.5恒溫培養(yǎng)箱。4.1.6微量移液器。4.2試劑耗材及實(shí)驗(yàn)參照物除非另有說明，在檢測中使用的化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。24.2.2異丙醇：分析純，使用前預(yù)冷至-20℃。4.2.5陽性參照物(鴨甲肝病毒3型病毒)。4.2.6陰性參照物(鴨肝臟組織)。5.1.1活體及病死鴨采樣：按NY/T541要求無菌采集發(fā)病鴨的肝臟組織。5.1.2病毒培養(yǎng)物：取5.2.1中處理好的上清液經(jīng)尿囊腔接種9日齡~11日齡鴨甲肝病毒3型病毒抗體陰性鴨胚，0.1mL/枚，共5枚。封口后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化，每日照胚2次，記錄鴨胚死亡情況，觀察到第6天。收集接種后24h～96h的死亡鴨胚病毒培養(yǎng)物。5.2.1組織樣品處理：取肝臟組織2g~10g,加入10倍體積生理鹽水，用剪刀剪碎后，置于研磨器中充分研磨，反復(fù)凍融2次~3次，8000r/min離心10min,取上清液200μL用于RNA提取。5.2.2病毒培養(yǎng)物處理：無菌收集培養(yǎng)24h~96h的鴨胚尿囊液，-20℃保存?zhèn)溆谩２杉蛱幚淼臉颖驹?℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h;若需長期保存，需放置-80℃冰箱，但7RNA提取7.1在100μL病料上清液中加入1mL裂解液，劇烈顛倒50次～100次，室溫靜置10min后，加入200μL氯仿，上下顛倒50次~100次，室溫靜置5min~10min,于4℃12000r/min離心10min。7.2吸取上清加入等體積氯仿，上下顛倒50次~100次，于4℃12000r/min離心10min。7.3吸取上清加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻后，-20℃靜置至少30min,然后于4℃12000r/min離心15min～20min。7.4棄上清液，加入1mL預(yù)冷的75%酒精，12000r/min離心5min～10min。7.5棄上清液，倒置自然晾干，或12000r/min再離心5min,吸掉管底部的液體。37.6沉淀用20μL無RNA酶水溶解，備用。每次抽提核酸，應(yīng)至少包括一個(gè)陽性對照和一個(gè)陰性對照，陽性和陰性參照物RNA的提取方法同上。7.7樣品RNA提取也可使用同等效果的商品化試劑盒，提取的RNA立即進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)或-70℃7.8核酸提取也可使用商品化的柱式提取試劑盒或全自動(dòng)磁珠提取試劑盒，按說明書操作。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL。在PCR管中加入5×Buffer4μL,dNTP(2.5mmol/L)8μL,隨機(jī)引物1.5μL,反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(200UuL)0.5μL,RNA酶抑制劑(40U/HL)0.5μLPCR儀中30℃10min,42℃1h得到cDNA。上游引物P3:5'CCTTGTTGTGAAACGGATTA3'下游引物P4:5'GGAACACCCARTAATACTRAAGTaqMan探針序列為：5'TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC3',其5'和3'端分別標(biāo)記FAM和BHQ。8.3擴(kuò)增反應(yīng)8.3.1反應(yīng)體系反應(yīng)體系為25.0μL,配制見表1。表1熒光PCR反應(yīng)體系配制總體積8.3.2反應(yīng)程序采用以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5min;95℃變性15s,60℃退火延伸45s,40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)分析軟件得出的Ct值和擴(kuò)增曲線來判定結(jié)果。熒光RT-PCR擴(kuò)增也可使用等效的商品化的熒光RT-PCR試劑盒，按說明書規(guī)定操作。9結(jié)果判定49.1判定前設(shè)置綜合分析儀器給出的各項(xiàng)結(jié)果，基線以儀器給出的默認(rèn)值作為參考，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，具體根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，選擇FAM通道進(jìn)行分9.2實(shí)驗(yàn)成立條件選擇FAM通道進(jìn)行分析，在陽性對照的Ct≤35且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線；陰性對照無Ct值或Ct≥40,無典型擴(kuò)增曲線的情況下，試驗(yàn)成立。9.3陽性判定Ct≤35,且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判為陽性，表明鴨甲肝病毒3型病毒核酸陽性。9.4陰性判定無Ct值或Ct≥40,無典型擴(kuò)增曲線的樣本，判為陰性，表明鴨甲肝病毒