PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳課件高二下學期生物人教版選擇性必修3

目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因?qū)胧荏w細胞第一步第二步第三步第四步目的基因的檢測與鑒定前提核心關鍵保證利用PCR獲取和擴增目的基因、啟動子、終止子、標記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、

感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法(微生物);分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等。溫故知新：基因工程的基本程序新冠病毒核酸檢測實驗原理材料用具實驗步驟DNA體外擴增的原理DNA片段電泳鑒定原理實驗探究：DNA片段的擴增及電泳鑒定一、實驗原理（一）DNA體外擴增的原理：PCR儀①PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。②PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理；PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。實驗探究：DNA片段的擴增①PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）二、材料用具實驗材料10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL①4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液。DNA片段的擴增4、實驗步驟（PCR）用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部。（提高反應速率）參照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。移液離心擴增探究.實踐可根據(jù)目的片段長度適當調(diào)整延伸時間預變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。實驗原理（二）DNA片段電泳鑒定原理：電泳鑒定原理DNA分子具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。瓊脂糖凝膠電泳DNA分子電泳電泳鑒定視頻思考：若電泳緩沖液使DNA帶負電荷，加樣孔側(cè)應連電極的哪一極？負極DNA片段的電泳鑒定探究·實踐二、材料用具2.試劑:(2)電泳緩沖液(TAE或TBE)、凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑——溴酚藍)、瓊脂糖和核酸染料(常用核酸染料為EB即溴化乙錠)等。具體內(nèi)容見P117。EB可插入DNA雙鏈堿基之間，形成EB-DNA復合物。該復合物在紫外線激發(fā)下，發(fā)射出紅橙色熒光。EB-DNA復合物熒光強度與DNA含量成正相關，根據(jù)熒光強度可粗略地估計樣品中DNA含量。（EB有劇毒）電源+電泳槽瓊脂糖凝膠樣品孔緩沖液—電泳方法步驟配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻制備凝膠將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜加樣將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相DNA片段的擴增及電泳鑒定探究.實驗注意事項為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。在進行操作時，一定要戴好一次性手套。PCR擴增不能隨意加大試劑用量。DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐五、結果分析與評價1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶。該片段大小約為750bp。DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐五、結果分析與評價2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結果的可能原因。未出現(xiàn)擴增條帶可能的原因有：①TaqDNA聚合酶失活；②引物出現(xiàn)質(zhì)量問題；③變性時溫度低，變性時間短④Mg2+濃度過低出現(xiàn)非特異性擴增帶可能的原因有：①引物特異性不強或容易聚合成二聚體②復性時的溫度過低③DNA聚合酶的濃度過高④模板DNA出現(xiàn)污染⑤Mg2+濃度過高例1：用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此做出分析不合理的是(

)A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B.3號樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號樣品對應植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D.10號的電泳結果能確定反應體系等對實驗結果沒有干擾B4.一種雙鏈DNA分子被三種不同的限制酶切割,切割產(chǎn)物通過