第三章第一節(jié)基因工程（基因表達載體的構(gòu)建）

第三章基因工程第一節(jié)基因工程及其技術(shù)

——基因表達載體的構(gòu)建（1）獲得目的基因的方法有哪些？化學(xué)合成法、基因文庫法。（2）左圖中質(zhì)粒和目的基因需要用哪種酶切割？哪種酶連接在一起？限制酶、DNA連接酶。

上圖中攜帶目的基因的重組質(zhì)粒需要具備哪些特點呢？一、基因表達載體的構(gòu)建

人們構(gòu)建的基因表達載體不僅要使目的基因進入受體細胞并有效表達，而且要能穩(wěn)定存在且遺傳給后代。（一）基因表達載體的組成閱讀教材97頁第一段的內(nèi)容，結(jié)合圖3-1-17思考基因表達載體需要具備哪些結(jié)構(gòu)？這些結(jié)構(gòu)分別有什么作用？學(xué)生活動

基因表達載體除含有目的基因外，還必須有復(fù)制原點、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等。（一）基因表達載體的組成1．啟動子

（1）本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。

（2）位置：目的基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點。

（3）功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。（一）基因表達載體的組成2．終止子（1）本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。（2）位置：目的基因的下游。（3）功能：使轉(zhuǎn)錄在需要的地方終止。3．標(biāo)記基因

初步篩選出接受了目的基因的受體細胞。常用的標(biāo)記基因有抗性基因（如抗生素抗性基因）或某些生化標(biāo)記基因。（一）基因表達載體的組成4．復(fù)制原點

能與特定的受體細胞相匹配，使外源基因在受體細胞中能穩(wěn)定復(fù)制并遺傳。易錯辨析啟動子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別編碼區(qū)基因基因基因DNADNA分子上具有遺傳效應(yīng)的片段稱為基因放大非編碼區(qū)非編碼區(qū)（調(diào)控序列）（調(diào)控序列）啟動子終止子內(nèi)含子外顯子編碼區(qū)的上游編碼區(qū)的下游前體RNA轉(zhuǎn)錄成熟RNAAUGUAG易錯辨析

啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段mRNA上三個相鄰的核糖核苷酸目的基因上游目的基因下游mRNA的首端mRNA的尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位決定轉(zhuǎn)錄的終止翻譯的起始信號決定翻譯過程的終止（二）基因表達載體的構(gòu)建過程基因表達載體的構(gòu)建是基因工程操作的核心。1．用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個有黏性末端的切口。2．用同種的或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割目的基因。3．加入適量DNA連接酶，使切下的目的基因片段拼接到載體的切口處。DNA連接酶表達載體含目的基因的DNA帶有黏性末端的切口帶有相同黏性末端的目的基因片段基因表達載體用能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割（二）基因表達載體的構(gòu)建過程難點突破關(guān)于限制酶的選擇

基因表達載體的構(gòu)建過程中，一般用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割目的基因和載體，以獲得相同的黏性末端（或平末端)，便于二者進行連接。但有時可用兩種產(chǎn)生不同黏性末端的限制酶切割載體和目的基因，這樣可使目的基因定向插入載體，同時可避免載體與載體之間、目的基因與目的基因之間的自身連接和目的基因與載體之間的反向連接。拓展基因工程中的載體1．載體的概念：載體是將外源DNA或基因?qū)爰闹骷毎M行擴增或表達的工具。2．載體的種類：按功能分為克隆載體和表達載體兩類。有一些兼有克隆載體和表達載體的特點。（1）克隆載體——最基本的載體。①來源：從病毒、質(zhì)?；蚋叩壬锛毎蝎@得的DNA均可以作為克隆載體。②過程：在克隆載體上插入適當(dāng)大小的外源DNA片段→將重組后的載體引入宿主細胞→在宿主細胞中通過克隆獲得目的基因。（2）表達載體①概念：要使外源基因（目的基因）能在宿主細胞中表達，必須將它放入帶有基因表達所需要的各種調(diào)控元件的載體中，這類載體稱為表達載體。②舉例：表達載體pKK223-3是一個具有典型表達結(jié)構(gòu)的大腸桿菌質(zhì)粒，其基本骨架由來自pBR322和pUC的質(zhì)粒復(fù)制起（原）點、氨芐青霉素抗性基因、相應(yīng)的啟動子和終止子，以及多克隆位點構(gòu)成。二、將目的基因?qū)胧荏w細胞

閱讀教材97~98頁的內(nèi)容，梳理將目的基因?qū)氩煌荏w細胞的方法有何不同？各自的轉(zhuǎn)化過程是怎樣進行的？用流程圖的方式繪制出來。學(xué)生活動受體細胞類型方法植物細胞哺乳動物細胞微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法（主要）病毒感染法Ca2+處理法（感受態(tài)細胞法）（一）將目的基因?qū)胫参锛毎?/p>

為什么選用農(nóng)桿菌？農(nóng)桿菌有什么特點？1．原理

（1）農(nóng)桿菌

農(nóng)桿菌是一類生活在土壤中的原核微生物，能在自然條件下感染雙子葉植物或裸子植物，但不會感染大多數(shù)單子葉植物。

（2）當(dāng)雙子葉植物或裸子植物收到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌向傷口處移動。

（3）農(nóng)桿菌含有Ti質(zhì)粒，上面有一段轉(zhuǎn)移DNA（T-DNA），能進入受體細胞，并整合到受體細胞染色體DNA上。目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細胞插入植物細胞中的染色體DNA上目的基因表達3．特點：

經(jīng)濟、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物。2．過程受精卵顯微注射受精卵移植到處于相同發(fā)情周期的母畜子宮內(nèi)受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動物（二）將目的基因?qū)氩溉閯游锛毎?．顯微注射法2．病毒感染法

用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因?qū)雱游锛毎麅?nèi)。（三）將目的基因?qū)胛⑸锛毎?．感受態(tài)細胞

經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚恚ㄈ缬肅a2+處理）后，細胞質(zhì)膜對DNA的通透性會發(fā)生改變，細胞變得容易接受外來的DNA，處于這種狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。Ca2+處理微生物細胞感受態(tài)細胞將重組的基因表達載體與感受態(tài)細胞混合在緩沖液中在適當(dāng)?shù)臈l件下完成轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上篩選帶目的基因的微生物2．過程易錯辨析1．在將目的基因?qū)胧荏w細胞之前，都必須進行基因表達載體的構(gòu)建，也就是說導(dǎo)入受體細胞的必須是重組DNA分子，而不是直接導(dǎo)入目的基因。2．對于植物來說，受體細胞可以是受精卵或體細胞，因為植物細胞具有全能性而且容易表現(xiàn)全能性。3．對于動物來說，受體細胞一般是受精卵，因為受精卵的全能性高，而高度分化的動物體細胞的全能性受到限制。4．大腸桿菌和酵母菌在基因工程中都可以作為受體細胞，但又有所不同。大腸桿菌為原核生物，而酵母菌為真核生物（具有多種細胞器），所以酵母菌在用于生產(chǎn)需要加工和分泌的蛋白質(zhì)時比大腸桿菌有優(yōu)勢。有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體三、目的基因及其表達產(chǎn)物的檢測鑒定1．檢測與鑒定的內(nèi)容、方法

閱讀教材98~99頁的內(nèi)容，根據(jù)表格提示的項目填寫表格中缺少的內(nèi)容。檢測水平檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平的檢測DNARNA蛋白質(zhì)個體水平的檢測檢測水平檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平的檢測DNARNA蛋白質(zhì)個體水平的檢測1．檢測與鑒定的內(nèi)容、方法檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體上是否插入了目的基因DNA分子雜交法（基因探針+待測轉(zhuǎn)基因生物的DNA）是否顯示出雜交帶檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄分子雜交技術(shù)（基因探針+待測轉(zhuǎn)基因生物的mRNA）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交包括抗蟲、抗病的接種試驗，抗凍的耐寒試驗，以確定是否有抗性及抗性程度；基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品進行活性比較等2．分子雜交技術(shù)的原理與過程（1）DNA分子雜交技術(shù)①原理：具有一定同源性的兩條DNA單鏈，在一定條件下（適宜的溫度等）可以按照堿基互補配對原則形成雙鏈。②過程與結(jié)果：

提取待測轉(zhuǎn)基因生物細胞中的DNA→與用放射性同位素或熒光標(biāo)記的已知DNA片段（基因探針）進行雜交。

若待測DNA中有能與基因探針互補的特異性DNA片段，用于示蹤的放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記會指示出其所在的位置，表明目的基因已經(jīng)插入轉(zhuǎn)基因生物的DNA分子中。2．分子雜交技術(shù)的原理與過程（2）DNA—mRNA分子雜交技術(shù)①原理：堿基互補配對原則。②過程與結(jié)果：

提取待測轉(zhuǎn)基因生物細胞中的mRNA→用已標(biāo)記的目的基因片段作為探針與mRNA雜交→如果有雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA分子。2．分子雜交技術(shù)的原理與過程（3）抗原—抗體雜交技術(shù)①原理：抗原與抗體的特異性結(jié)合。②過程與結(jié)果：

提取待測轉(zhuǎn)基因生物細胞中的蛋白質(zhì)，并與相應(yīng)的抗體進行雜交→如果有雜交帶出現(xiàn)，說明目的基因已經(jīng)表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。

抗原—抗體雜交技術(shù)中目的基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是抗原還是抗體？

抗原。1．將目的基因?qū)胧荏w細胞的三種類型目的基因植物細胞主要是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法主要是顯微注射法微生物細胞主要是Ca2+處理法哺乳動物細胞導(dǎo)入導(dǎo)入導(dǎo)入課堂小結(jié)表現(xiàn)翻譯2．目的基因檢測與鑒定的“兩個水平”受體細胞mRNA蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交分子雜交技術(shù)DNA分子雜交法性狀如抗蟲接種實驗外源基因是否顯示雜交帶是否顯示雜交帶是否顯示雜交帶是否表現(xiàn)特定性狀導(dǎo)入檢測檢測檢測檢測轉(zhuǎn)錄分子水平檢測個體生物學(xué)水平檢測1．運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將奶牛細胞中編碼凝乳酶的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌細胞中，達到大規(guī)模生產(chǎn)凝乳酶的目的。下圖表示用作運載體的質(zhì)粒和目的基因所在DNA片段。下列操作與實驗?zāi)康牟环氖牵?/p>

）BA．用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA連接酶構(gòu)建基因的表達載體B．用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的即為導(dǎo)入目的基因的細菌C．可用PCR技術(shù)大量擴增目的基因D．用Ca2+處理大腸桿菌使其易于轉(zhuǎn)化2．下圖表示一項重要生物技術(shù)的關(guān)鍵步驟，X是獲得外源基因并能夠表達的細胞。下列有關(guān)說法錯誤的是（

）CA．X是能合成胰島素的細菌細胞B．質(zhì)粒應(yīng)具有多個限制酶切點C．基因與運載體的重組只需要DNA連接酶D．該細菌的性狀被定向改造3．下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關(guān)敘述正確的是（）A．②的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶參與B．③侵染植物細胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀D．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異D