微生物檢驗(yàn)理論課 09龍軍臨床常見(jiàn)真菌檢驗(yàn)一 學(xué)習(xí)資料

臨床常見(jiàn)真菌檢驗(yàn)珠江醫(yī)院龍軍掌握真菌的基本生物學(xué)特性掌握臨床標(biāo)本的采集掌握真菌感染的微生物學(xué)檢驗(yàn)原則了解真菌感染的預(yù)防與治療學(xué)習(xí)目標(biāo)真菌微生物學(xué)

檢驗(yàn)總論Mycology(真菌學(xué))Fungi(真菌)Hyphae(菌絲)Spore(孢子)Yeast(酵母菌)Mold(霉菌)Candida(念珠菌)Cryptococcus(隱球菌)Histoplasma(組織胞漿菌)真菌概述什么是真菌？真菌(fungus)是廣泛存在于自然界的一類真核細(xì)胞生物，具有真正的細(xì)胞核和細(xì)胞器，不含葉綠素，以寄生和腐生方式吸取營(yíng)養(yǎng)，能進(jìn)行有性和無(wú)性繁殖。

全世界已記載的真菌有20萬(wàn)種以上，其中絕多數(shù)對(duì)人類無(wú)害，只有少數(shù)真菌（約200余種）與人類疾病有關(guān)對(duì)人致病的真菌分為四類：病原性真菌、條件致病性真菌、產(chǎn)毒真菌及致癌真菌真菌與細(xì)菌的區(qū)別真菌細(xì)菌細(xì)胞真核細(xì)胞原核細(xì)胞細(xì)胞核有,有核膜核仁擬核、無(wú)核膜核仁細(xì)胞器有只有核糖體細(xì)胞壁甲殼質(zhì)、β-葡聚糖、甘露聚糖及蛋白質(zhì)肽聚糖細(xì)胞膜含固醇不含固醇真菌分類

Ainsworth分類系統(tǒng)

真菌界（KingdomFungi）真菌門--5亞門,18綱,68目與醫(yī)學(xué)有關(guān)的真菌為真菌門中的四個(gè)亞門◆接合亞門（zygomycotina）◆子囊菌亞門（Ascomycotina）◆擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）◆半知菌亞門（Deutermycotina)---對(duì)人致病性真菌最多假絲酵母菌屬（Candida）隱球菌屬（Cryptococcus）表皮癬菌屬（Epidermophton）球孢子菌屬（Coccidioides）組織胞漿菌屬（Histoplastoma）

按侵犯人體的部位分類淺部真菌----主要侵犯皮膚表層角質(zhì)層、毛發(fā)和指甲深部真菌----侵犯皮膚角質(zhì)層以下、粘膜、深部組織和內(nèi)臟器官，在一定條件下可播散引起全身感染真菌的生物學(xué)性狀真菌的形態(tài)特性

單細(xì)胞真菌：圓形或卵圓形,出芽繁殖酵母菌:孢子，無(wú)菌絲類酵母菌：芽生孢子，假菌絲

新生隱球菌和白假絲酵母菌

多細(xì)胞真菌：有菌絲（hypha）和孢子(spore)

又稱絲狀菌(filamentousfungus)

霉菌(mold)

皮膚癬菌二相性真菌：球孢子菌，組織胞漿菌

二相型真菌機(jī)體內(nèi)寄生37℃單細(xì)胞型：多細(xì)胞型：含動(dòng)物蛋白培養(yǎng)基酵母菌沙保氏培養(yǎng)基25℃ 普通培養(yǎng)基25℃絲狀菌單細(xì)胞真菌形態(tài)酵母菌酵母菌出芽繁殖類酵母菌—白假絲酵母菌孢子假菌絲多細(xì)胞真菌形態(tài)sporehypha二相性真菌

真菌的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)-孢子（spore）

真菌孢子細(xì)菌芽胞作用真菌繁殖結(jié)構(gòu)細(xì)菌休眠結(jié)構(gòu)數(shù)目一條菌絲可產(chǎn)生多個(gè)孢子一個(gè)細(xì)菌體只形成一個(gè)芽孢形成位置可在細(xì)胞內(nèi)外形成只在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)形成形狀形態(tài)、色澤多樣圓形或橢圓形抵抗力不強(qiáng)，加熱60-70℃短時(shí)間即可死亡強(qiáng)，有的可耐100℃數(shù)小時(shí)孢子的分類有性孢子(sexualspores):

同一菌體或不同菌體上的2個(gè)細(xì)胞融合經(jīng)減數(shù)分裂形成無(wú)性孢子（Asexualspores）:

菌絲上的細(xì)胞分化或出芽生成致病性真菌大多形成無(wú)性孢子

分生孢子conidium葉狀孢子thallospore孢子囊孢子(Sporangiospores)大分生孢子(macroconidia)

–鑒別意義小分生孢子(microconidia)真菌都能產(chǎn)生芽生孢子（Blastoconidia）和假菌絲(pseudohyphae)

厚膜孢子(Chlamydospores

)—鑒別意義關(guān)節(jié)孢子(Arthrospores)—鑒別意義無(wú)性孢子分類A．大分生孢子（小孢子菌）；B．芽生孢子和假菌絲（假絲酵母菌）；C．厚膜孢子（假絲酵母菌）；D．關(guān)節(jié)孢子（球孢子菌）；E．孢子囊孢子（毛霉）；F．小分生孢子（曲霉）真菌無(wú)性孢子形態(tài)生殖菌絲末端細(xì)胞分裂或收縮形成；也可從菌絲側(cè)面出芽形成分生孢子（conidium）：--多細(xì)胞真菌最常見(jiàn)的無(wú)性孢子葉狀孢子（thallospore）：在生殖菌絲內(nèi)細(xì)胞直接形成。包括芽生孢子、厚膜孢子、關(guān)節(jié)孢子等孢子囊孢子（sporangiospore）：氣生菌絲末端膨大成孢子囊，內(nèi)含許多孢子.孢子囊孢子真菌的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)—菌絲（hypha）孢子適宜溫/濕度芽管菌絲mycelium菌絲體功能分類：營(yíng)養(yǎng)、氣生、生殖菌絲結(jié)構(gòu)分類：有隔、無(wú)隔菌絲體按其功能可分兩種：（1）營(yíng)養(yǎng)菌絲體：菌絲深入被寄生組織或培養(yǎng)基，吸取合成養(yǎng)料以供生長(zhǎng)。（2）氣生菌絲體：菌絲向上生長(zhǎng)稱氣生菌絲，其中產(chǎn)生孢子的則稱為生殖菌絲體。菌絲按結(jié)構(gòu)可分為：有隔菌絲與無(wú)隔菌絲有隔菌絲：大部分真菌的菌絲在一定間距見(jiàn)有橫隔，稱隔膜。將菌絲分成一連串的細(xì)胞。無(wú)隔菌絲：菌絲中無(wú)橫隔將其分段，整條菌絲就是一個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)含有許多核，是一種多核單細(xì)胞。有隔菌絲與假菌絲真菌絲(truehypha):指菌絲頂端連續(xù)生長(zhǎng)產(chǎn)生隔膜形成的菌絲稱為真菌絲，隔膜處不縊縮。即相連細(xì)胞間的橫隔面積與細(xì)胞直徑一致,呈竹節(jié)狀的細(xì)胞串假菌絲(pseudohypha):指酵母菌菌種進(jìn)行一連串的芽殖后，長(zhǎng)大的子細(xì)胞仍不脫落分離，并繼續(xù)出芽，細(xì)胞成串排列，在分隔處縊縮真菌菌絲的形態(tài)A．螺旋狀菌絲；B．球拍狀菌絲；C．結(jié)節(jié)狀菌絲；D．鹿角狀菌絲；E．梳狀菌絲；F．關(guān)節(jié)狀菌絲真菌的形態(tài)構(gòu)成菌絲營(yíng)養(yǎng)菌絲氣生菌絲→生殖菌絲孢子有性孢子由同一菌體或不同菌體上的二個(gè)細(xì)胞融合形成

絕大多數(shù)屬于非致病性真菌所具有

無(wú)性孢子分生孢子分生孢子梗的頂端或側(cè)面大分生孢子小孢子菌屬、表皮癬菌屬小分生孢子毛癬菌屬葉狀孢子菌絲細(xì)胞直接形成芽生孢子

隱球菌、念珠菌

關(guān)節(jié)孢子

厚膜孢子

新型隱球菌子囊孢子菌絲末端形成膨大的囊狀結(jié)構(gòu)即孢子囊，內(nèi)含很多孢子

根霉菌

特點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)要求不高，常用沙保氏培養(yǎng)（基基本成分：葡萄糖、蛋白胨、瓊脂）

生長(zhǎng)條件：pH4.0-6.0，溫度22-28℃（深部真菌37℃）高濕度和氧菌落：?jiǎn)渭?xì)胞--酵母型菌落、類酵母型菌落（假菌絲）多細(xì)胞--絲狀菌落

真菌的生長(zhǎng)特性固體培養(yǎng)基上菌落與細(xì)菌類似，濕潤(rùn)、較透明、光滑|質(zhì)地均勻，但是比細(xì)菌菌落大而厚。鏡下：酵母型--卵圓孢子、芽生孢子類酵母型—芽生孢子、假菌絲單細(xì)胞真菌菌落類型酵母型/類酵母型類酵母型菌落（白假絲酵母菌菌落）酵母型菌落絲狀菌落多細(xì)胞真菌菌落類型菌落呈棉絮狀、絨毛狀、粉末狀（氣生菌絲體）。菌落正背面呈不同顏色（可為鑒定依據(jù)）鏡下：孢子、菌絲及完整菌絲體曲霉菌屬青霉菌屬P363

真菌感染的

標(biāo)本采集與檢驗(yàn)流程真菌感染的微生物學(xué)檢查標(biāo)本淺部感染：皮屑、毛發(fā)、指（趾）甲屑深部感染：痰、血液、腦脊液、分泌物1.皮膚及皮膚附屬物：毛發(fā)、皮屑、指（趾）甲等。2.各種分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、糞便、尿液等。3.血液和體液：體液包括胸水、腹水、腦脊液、淋巴穿刺液等。4.膿汁和滲出液微生物學(xué)檢查標(biāo)本采集送檢注意事項(xiàng)早期采集：病程早期、急性期，使用抗菌藥物前無(wú)菌采集：無(wú)菌操作，無(wú)菌容器根據(jù)目的菌特性用不同方法采集盡快運(yùn)送采集好的標(biāo)本；盡快接種或涂片標(biāo)本。1.采集標(biāo)本要適宜2.用藥前采集3.標(biāo)本量要足4.嚴(yán)格無(wú)菌操作5.2小時(shí)內(nèi)送檢真菌感染標(biāo)本采集注意事項(xiàng)真菌的檢驗(yàn)方法

鏡檢真菌形態(tài)真菌分離培養(yǎng)與鑒定真菌抗原檢測(cè)真菌核酸檢測(cè)真菌毒素檢測(cè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)抗體檢測(cè)直接鏡檢1.不染色：如癬病取病發(fā)或病損部位皮屑、甲屑置于載玻片上+KOH（使角質(zhì)軟化）+蓋玻片→鏡檢，找菌絲、孢子

2.染色：革蘭氏染色、墨汁染色、瑞氏染色等

真菌標(biāo)本直接檢查染色顯微鏡觀察革蘭氏染色真菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，但著色可能不均與細(xì)菌大小差別較大，真菌大于5微米，細(xì)菌小于5微米假絲酵母菌：革蘭染色陽(yáng)性。隱球菌：墨汁作負(fù)染后鏡檢。革蘭氏染色糞便中真菌革蘭氏染色白帶中真菌革蘭氏染色尿中真菌墨汁染色新型隱球菌直接鏡檢的意義直接鏡檢陽(yáng)性表示：①有診斷意義，如淺部真菌病等；②看到的就是真菌的形態(tài)，可確定某些致病性真菌的屬或種,如假絲酵母菌的厚膜孢子等；③判斷某些真菌種的致病性等直接鏡檢的局限：①陰性結(jié)果不能排除真菌感染；其敏感性隨標(biāo)本類型、數(shù)量、采集時(shí)間和質(zhì)量等而有所不同②有假陽(yáng)性結(jié)果---溶解的淋巴細(xì)胞在腦脊液中易被誤認(rèn)為陽(yáng)性。因此，對(duì)直接鏡檢可疑結(jié)果應(yīng)作復(fù)查或用其他檢驗(yàn)方法鑒定。是目前鑒定真菌的惟一方法。大多數(shù)真菌培養(yǎng)溫度為28℃，深部真菌為37℃。對(duì)二相性真菌培養(yǎng)時(shí),28℃培養(yǎng)真菌呈菌絲相（霉菌型），37℃培養(yǎng)為組織相（酵母型）。菌落觀察：是鑒別真菌的方法。

分離培養(yǎng)真菌培養(yǎng)方法

平皿培養(yǎng):表面較大可使標(biāo)本散布，便于觀察菌落形態(tài)，但水分易蒸發(fā)，只能培養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖較快的真菌，如假絲酵母菌、隱球菌。大試管培養(yǎng):水分不易蒸發(fā)，主要用于皮膚癬菌的培養(yǎng)和真菌菌種的保存。玻片培養(yǎng)(微量培養(yǎng)、小培養(yǎng)):可用于真菌菌種的鑒定。菌落形態(tài)觀察菌落性質(zhì)：是酵母菌還是霉菌。菌落大?。阂话悴≡哉婢湫。鴹l件致病性真菌菌落大。菌落顏色：一般病原性真菌顏色淡，污染真菌顏色深。致病性真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉;致病性真菌有時(shí)使培養(yǎng)基開裂，但污染霉菌很少引起培養(yǎng)基開裂?？岂R嘉顯色培養(yǎng)基根據(jù)菌落形態(tài)及所產(chǎn)色素判斷為何種念珠菌或毛霉菌/曲霉菌，經(jīng)涂片革蘭氏染色鏡下觀察真菌形態(tài)確定綠色：白色念珠菌藍(lán)色：熱帶念珠菌紫色：光滑念珠菌褐色：克柔念珠菌白色至粉色：其他念珠菌（真菌鑒定試劑盒鑒定）真菌的藥敏試驗(yàn)方法肉湯稀釋法葡萄糖美蘭瓊脂擴(kuò)散法Etest方法ATB-Fungus3方法流式細(xì)胞儀測(cè)定法藥敏檢測(cè)K-B法：方法同細(xì)菌K-B法---僅限大扶康和伏立康唑；調(diào)念珠菌菌液濃度0.2麥?zhǔn)?，用無(wú)菌棉簽蘸取菌液涂于念珠菌藥敏專用平板上貼藥敏藥片，35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)后觀察結(jié)果真菌K-B法藥敏結(jié)果真菌藥物敏感試驗(yàn)過(guò)程方法:肉湯稀釋法，包括常量稀釋法和微量稀釋法。培養(yǎng)基:含谷氨酰胺和pH指示劑，不含碳酸氫鈉RPMI1640培養(yǎng)基。程序:藥物原液配制接種菌液制備藥液稀釋常量稀法微量稀釋法結(jié)果判斷質(zhì)量控制

作用于真菌細(xì)胞膜：兩性霉素B、制霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑及克霉唑等。作用于真菌細(xì)胞壁：尼可霉素Z、卡泊芬凈及普拉米星（pradimicin）等。作用于真菌核酸：干擾真菌DNA合成，5－氟尿嘧啶（5－FC）等。其他：大蒜新素（allitridum）及冰醋酸（glacialeaceticacid）等?？拐婢幬锓诸?-作用機(jī)理分類1．兩性霉素B

兩性霉素對(duì)大多數(shù)深部致病真菌具有活性，如念珠菌、新型隱球菌、曲菌、組織胞漿菌、雙向真菌等均有較強(qiáng)的抑制作用。但對(duì)皮膚和毛發(fā)癬菌大多耐藥。2．酮康唑(ketoconazole)

對(duì)念珠菌、著色真菌屬、球孢子菌屬等有抗菌活性，對(duì)毛發(fā)癬菌亦具抗菌活性。臨床常用抗真菌藥物3．氟康唑(fluconazole)

對(duì)念珠菌、隱球菌具有較高抗菌活性。4．氟胞嘧啶為窄譜抗生素，對(duì)念珠菌、新型隱球菌和球擬酵母有較高抗菌活性，對(duì)其他真菌抗菌作用差，易產(chǎn)生耐藥性，故常和兩性霉素B聯(lián)合使用。臨床常用抗真菌藥物

5．伊曲康唑(itraconazole)

伊曲康唑體外有廣譜抗真菌活性。對(duì)念珠菌、隱球菌、曲霉菌、組織胞漿菌、馬內(nèi)非青霉均有效。6．伏立康唑（Voriconazole）伏立康唑適用于侵襲性曲霉病及嚴(yán)重真菌感染不能耐受其他藥物或經(jīng)其他藥物治療無(wú)效者，如足放線病菌屬、鐮刀菌屬等感染。臨床常用抗真菌藥物抗真菌藥物藥敏試驗(yàn)原則1.提供兩種以上有相當(dāng)活性的抗真菌藥物的可信測(cè)量方法2.和體內(nèi)的活性具有相關(guān)性，可預(yù)測(cè)治療的效果3.可用來(lái)監(jiān)控敏感群體菌株的耐藥性發(fā)生4.可預(yù)期研究新藥的潛在治療效能。5.90-60原則菌種鑒定菌種鑒定是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，僅觀察菌落形態(tài)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還需作生化反應(yīng)，分子生物學(xué)鑒定，必要時(shí)將菌種送有關(guān)單位鑒定。檢驗(yàn)真菌常用的生化反應(yīng)有糖(醇)類發(fā)酵試驗(yàn)、同化碳源試驗(yàn)、同化氮源試驗(yàn)或利用硝酸鉀試驗(yàn)、牛乳分解試驗(yàn)、酚氧化酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和脲酶試驗(yàn)等。試驗(yàn)方法同細(xì)菌試驗(yàn)，主要用于檢驗(yàn)深部感染真菌如假絲酵母菌、隱球菌等。真菌非培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)抗原檢測(cè)：常用的方法有乳膠凝集試驗(yàn)、ELISA、半定量放射免疫法。均應(yīng)設(shè)對(duì)照，防止發(fā)生假陽(yáng)性和假陰性。核酸檢測(cè)：操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省工、敏感性和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，但要一定的實(shí)驗(yàn)條件，并大多仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，故目前不可能完全替代常規(guī)鑒定方法。動(dòng)物試驗(yàn)：分離病原性真菌、確定真菌菌種的致病性、研究藥物對(duì)真菌的作用等。真菌毒素的檢測(cè)：生物學(xué)方法、薄層層析法、高效液相色譜法和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法等。醫(yī)學(xué)真菌的鑒定手段引入了分子生物學(xué)的鑒定方法，從核酸堿基G+Cmol％分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、Southern印跡分析到脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、PCR指紋、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)以及DNA特殊片段測(cè)序等。核酸檢測(cè)最新的分型技術(shù)微衛(wèi)星序列多態(tài)性分型MLST---多位點(diǎn)序列分型：分辨率最高，通過(guò)對(duì)真菌特定管家基因片段進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序、分析、分型。63非培養(yǎng)診斷方法非培養(yǎng)診斷血清學(xué)檢測(cè)組織病理學(xué)檢查分子診斷PAS染色免疫組化PCR相關(guān)技術(shù)抗原檢測(cè)

抗體檢測(cè)影象學(xué)診斷高分辨率CT螺旋CT代謝產(chǎn)物檢測(cè)G試驗(yàn)GM試驗(yàn)LA試驗(yàn)甘露聚糖抗體烯醇化酶抗體馬內(nèi)菲青霉抗體阿拉伯糖醇生化反應(yīng)普通、巢式復(fù)合、SSRRAPD、RFLPAFLP、測(cè)序DNA探針技術(shù)基因芯片64分子診斷

診斷基因

在病原體檢測(cè)中的優(yōu)點(diǎn)：敏感性和特異性高早期診斷確定現(xiàn)癥感染

主要技術(shù)：DNA探針(DNAprobe)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)65分子生物學(xué)技術(shù)

實(shí)時(shí)定量(RealTime)PCR定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)；利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程；通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量；優(yōu)點(diǎn)：可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、定量分析、避免污染；反應(yīng)迅速，敏感性、特異性高。DNA序列測(cè)定是目前最引人注目的發(fā)展方向，已成為致病真菌的分類鑒別的重要手段。目前應(yīng)用最多的為16-rDNA序列、幾丁質(zhì)合成酶、細(xì)胞色素P450L1A1基因，細(xì)胞色素氧化酶C和細(xì)胞色素B等基因序列。67分子生物學(xué)優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)極短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)微量的真菌DNA，使真菌感染的早期診斷成為可能

缺點(diǎn)標(biāo)本處理和DNA提取方法影響檢測(cè)結(jié)果PCR方法的高敏感性，容易造成假陽(yáng)性篩選出的特異引物或探針還需經(jīng)大量不同種屬菌株的驗(yàn)證缺乏針對(duì)新型病原真菌特異性檢測(cè)的研究缺乏明確的分子生物學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)侵襲性真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)CHIF-NET2011年總結(jié)當(dāng)前侵襲性真菌感染發(fā)病率升高中國(guó)真菌監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)缺乏：ARTEMIS國(guó)內(nèi)單中心數(shù)據(jù)存在誤導(dǎo)：耐藥嚴(yán)重？引自萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)真菌感染(2009以后)CHIF-NET2011項(xiàng)目背景入組：血液無(wú)菌體液組織&膿介入取材(BALF、PSB)排除：痰尿顯色培養(yǎng)基分純金標(biāo)準(zhǔn):

分子生物學(xué)方法

ITS+/-D1D2

準(zhǔn)確定種！CLSIM44-A紙片擴(kuò)散法氟康唑伏立康唑收集標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定藥敏試驗(yàn)CLSI,M44-A&M44-S2研究方案CHIF-NET2011總核酸提?。翰Ａе檎鹗帯蠓?/p>

PCR擴(kuò)增：通用引物ITS1-ITS4對(duì)菌株ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增

測(cè)序與比對(duì)：PCR產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)鑒定。菌種的分子生物學(xué)鑒定CHIF-NET2011中心實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作流程CHIF-NET2011菌株保存CHIF-NET2011CHIF-NET2011監(jiān)測(cè)結(jié)果CHIF-NET2011CHIF-NET2010：814株CHIF-NET2011：1259株收集菌株數(shù)量CHIF-NET2011標(biāo)本類型分布CHIF-NET2011*其他科室包括：口腔科眼科皮膚科婦科兒科VIP病房科室分布CHIF-NET2011菌種分布CHIF-NET2011CHIF-NET2011共收集酵母樣真菌1259株，分子鑒定共計(jì)30個(gè)種分離率最高的菌種為白念珠菌(44.3%)、熱帶念珠菌(17.2%)、近平滑念珠菌(13.2%)、光滑念珠菌(8.8%)、新型隱球菌(6.8%)在血流標(biāo)本中，分離率最高的為白念珠菌(36.6%)、近平滑念珠菌(18.3%)；在腦脊液標(biāo)本中，分離率最高的為新型隱球菌(73.8%)所有酵母樣真菌總體耐藥率為氟康唑3.1%，伏立康唑0.2%在分離率前5位的酵母樣真菌中，僅光滑念珠菌對(duì)氟康唑、伏立康唑的敏感性較低(分別為77.6%、88.3%)并存在交叉耐藥；其他常見(jiàn)酵母菌氟康唑敏感率均>92%，伏立康唑敏感率>97%仍有耐藥相關(guān)真菌地區(qū)性集中出現(xiàn)的現(xiàn)象。結(jié)論CHIF-NET2011MALDI-TOFMS

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用研究進(jìn)展基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assistedLaserDesorptionIonisationTime-Of-FlightMassSpectrometry)MALDI-TOFMSWieserAetal.ApplMicrobiolBiotechnol2012操作步驟檢測(cè)分離菌株---細(xì)菌可鑒定大部分的細(xì)菌鏈球菌肺炎鏈球菌，緩癥鏈球菌，副溶血鏈球菌腸桿菌科細(xì)菌志賀菌，大腸埃希菌厭氧菌檢測(cè)分離菌株---真菌MALDI-TOFMS系統(tǒng)已經(jīng)在過(guò)去的10年中成功的應(yīng)用于真菌的鑒定，Welham等在2000年成功的應(yīng)用MALDI-TOFMS方法來(lái)鑒定了3種真菌。此后，許多研究都證明了MALDI-TOFMS可以用來(lái)鑒定多種真菌如酵母菌、青霉菌、曲霉菌、鐮刀菌、木霉菌以及皮膚真菌等。MALDI-TOFMS主要還是用于酵母菌的鑒定，MALDI-TOFMS數(shù)據(jù)庫(kù)以及標(biāo)本的制備程序均仍需要改進(jìn)以促進(jìn)這個(gè)技術(shù)在絲狀真菌中的鑒定。檢測(cè)分離菌株---酵母樣真菌酵母菌細(xì)胞壁較厚蛋白提取法乙醇甲酸乙腈準(zhǔn)確鑒定念珠菌隱球菌毛孢子菌屬地霉菌屬畢赤酵母芽生裂殖菌屬

白色念珠菌質(zhì)譜圖碳青霉烯酶的檢測(cè)捷克HrabakJ等使用MALDI-TOFMS來(lái)檢測(cè)碳青霉烯酶的活性。德國(guó)BurckhardtI等采用MALDI-TOFMS在1-2.5小時(shí)內(nèi)檢測(cè)細(xì)菌對(duì)碳青霉烯酶的耐藥性。β內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)德國(guó)SparbierK.等使用MALDI-TOFMS來(lái)檢測(cè)不同腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多種β內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況。

新型隱球菌質(zhì)譜圖總結(jié)---革命性的改變！節(jié)省時(shí)間1-2工作日→3分鐘降低成本60元→2元準(zhǔn)確和全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)準(zhǔn)確度相當(dāng)甚至更高微生物全自動(dòng)化鑒定時(shí)代已經(jīng)到來(lái)不足：無(wú)法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)如何看待

念珠菌定植與感染的關(guān)系？2025/4/2定植部位真菌感染的診斷：困難較大，難以區(qū)分污染、定植和感染腹腔感染胃腸道為念珠菌定植部位，由穿孔或胰腺炎合并的腹腔感染往往難以區(qū)分定植和感染泌尿系統(tǒng)前尿道為念珠菌定植部位，獲取合格的深部組織標(biāo)本要求較高呼吸系統(tǒng)口咽部、鼻咽部為念珠菌定植部位，痰培養(yǎng)出現(xiàn)念珠菌同樣不能確診痰液檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)尿液檢測(cè)腹水檢測(cè)結(jié)果判讀的最重要前提：標(biāo)本合格侵襲性念珠菌感染的診斷既不能完全依賴于微生物學(xué)證據(jù)的獲得，又不能脫離實(shí)驗(yàn)室菌株的培養(yǎng)與藥敏結(jié)果的提示92內(nèi)容提要如何看待呼吸道分泌物檢出的念珠菌？如何看待泌尿道檢出的念珠菌？如何看待腹腔標(biāo)本檢出的念珠菌？“痰液檢測(cè)念珠菌陽(yáng)性”一定是念珠菌定植么？不一定痰標(biāo)本鏡檢與培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性的可能痰標(biāo)本采集本身就存在諸多可能被污染的情況標(biāo)本不合格(即污染)痰標(biāo)本在運(yùn)送或保存或接種等過(guò)程中易受到污染定植念珠菌廣泛定植于口咽部，鼻咽部無(wú)論是痰液還是支氣管分泌物檢測(cè)陽(yáng)性，多為定植菌感染臨床真菌感染已經(jīng)較為常見(jiàn)，一些臨床醫(yī)師認(rèn)為“痰培養(yǎng)念珠菌陽(yáng)性”一定是定植菌的觀念是不全面的臨床上，這種情況往往易被忽略且不易避免鏡檢直接觀察念珠菌有無(wú)假菌絲或菌絲可以為定植還是感染提供一些線索多次送檢的意義怎么樣才算是一份合格的痰標(biāo)本？咳痰標(biāo)本的采集方法醫(yī)師或護(hù)士直視下采集標(biāo)本，如有必要，可用吸痰器采集病人先用無(wú)菌生理鹽水漱口，去除表面的菌群，教育病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液時(shí)間要求清晨的痰含菌量最多，是最佳采集時(shí)間在抗生素應(yīng)用前采集痰標(biāo)本標(biāo)本采集后1～2h內(nèi)必須立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室處理如果無(wú)痰可用3％～5％NaCl5ml霧吸約5min導(dǎo)痰，也可用物理療法、體位引流、鼻導(dǎo)管抽吸等法取痰不建議24h內(nèi)多次采集，除非痰液外觀性狀出現(xiàn)改變一份合格的痰標(biāo)本應(yīng)該是痰涂片鏡檢每低倍視野<10個(gè)鱗狀上皮細(xì)胞，>25個(gè)多核白細(xì)胞念珠菌屬于類酵母樣菌，有酵母相和菌絲相酵母相為芽生孢子，在無(wú)癥狀寄居及傳播中起作用，不引起癥狀菌絲相為芽生孢子伸長(zhǎng)呈假菌絲，大量繁殖，侵襲組織能力加強(qiáng)，出現(xiàn)臨床癥狀需要注意的是，念珠菌中的光滑念珠菌不能產(chǎn)生假菌絲/菌絲，所以，臨床不能因?yàn)椤扮R檢念珠菌處于酵母相”就排除感染鏡檢假菌絲或菌絲的重要意義酵母相菌絲相假菌絲無(wú)隔、無(wú)分支念珠菌多為假菌絲多次送檢陽(yáng)性：

可作為肺念珠菌病疑似診斷的依據(jù)2010中國(guó)念珠菌病診斷與治療專家共識(shí)合格的痰或支氣管分泌物標(biāo)本2次顯微鏡檢酵母假菌絲或菌絲陽(yáng)性，以及真菌培養(yǎng)有念珠菌生長(zhǎng)，且2次培養(yǎng)為同一菌種可作為肺念珠菌病疑似診斷的依據(jù)痰液、支氣管肺泡灌洗液的直接檢查(細(xì)胞學(xué)、直接鏡檢或培養(yǎng))是IFI診斷的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)之一另外，多次送檢藥敏試驗(yàn)也可為臨床抗真菌治療藥物的選擇提供幫助“支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測(cè)念珠菌陽(yáng)性”

一定是念珠菌感染么？很有可能怎么樣才算是一份合格的BALF標(biāo)本？支氣管肺泡灌洗術(shù)(bronchoalceolarlavage,BAL)按照標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格操作，回收液量，至少應(yīng)回收30-40%以上，BALF方能進(jìn)行分析第一份回收的標(biāo)本往往混支氣管內(nèi)成分，為防止其干擾，也可將第一份標(biāo)本與其它標(biāo)本分開檢查術(shù)后回收灌洗液處理首先用單層紗布過(guò)濾以除去粘液，將濾液離心后分離上清液供生化檢查和免疫學(xué)測(cè)定，沉淀物供細(xì)胞檢查微生物學(xué)檢查的標(biāo)本須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作；合適的BALF應(yīng)要求：達(dá)到規(guī)定的回收比例，回收率＞40%，活細(xì)胞95%以上不混有血液，紅細(xì)胞數(shù)小于10%不應(yīng)混有多量的上皮細(xì)胞(一般小于3%)BALF檢測(cè)念珠菌陽(yáng)性

可作為預(yù)防性抗真菌治療的信號(hào)由于肺念珠菌感染的臨床表現(xiàn)無(wú)特征性，確診較困難，因此，對(duì)于有下列情況之一者均應(yīng)考慮到肺念珠菌感染的可能長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的患者;接受化療、放療患者出現(xiàn)肺部感染時(shí);原有肺部細(xì)菌感染經(jīng)足量抗生素治療無(wú)效，病情持續(xù)惡化或好轉(zhuǎn)后又惡化者;胸片、CT檢查肺部出現(xiàn)新的病變或兩中下肺野呈彌漫性斑片影或圓形塊狀影，不能用細(xì)菌性、病毒性肺炎解釋者如果此時(shí)BALF檢測(cè)念珠菌陽(yáng)性，就要考慮應(yīng)用抗真菌藥物進(jìn)行治療BAL臨床應(yīng)用的局限BAL的禁忌證如下：①嚴(yán)重的心、肺功能損害者；②新近發(fā)生急性心肌梗死患者；③新近發(fā)生大咳血者；④活動(dòng)性肺結(jié)核未經(jīng)治療者等操作復(fù)雜：要嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則在急性感染期甚至有可能導(dǎo)致感染播散ICU念珠菌定植患者進(jìn)展侵襲性念珠菌病的百分比顯著高于非念珠菌定植患者S.S.Magilletal.DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease55(2006)293–301進(jìn)展為IC的百分比P=0.02P=0.04P=0.01念珠菌定植可進(jìn)展為侵襲性念珠菌病肺念珠菌病的診斷困難區(qū)分呼吸道念珠菌感染和定植困難上氣道念珠菌定植常見(jiàn)，氣道分泌物（痰和BALF）培養(yǎng)陽(yáng)性不能作為侵襲性感染的證據(jù)

36例確診肺念珠菌病的患者，生前痰和BALF培養(yǎng)陽(yáng)性率為83%，而同期沒(méi)有念珠菌感染病理證據(jù)的對(duì)照組，痰培養(yǎng)陽(yáng)性率也高達(dá)46%（p=0.08）EORTC/MSG定義：痰和BALF中絲狀真菌和隱球菌鏡檢和培養(yǎng)陽(yáng)性作為感染的微生物學(xué)證據(jù)，而念珠菌培養(yǎng)陽(yáng)性（無(wú)論3次還是更多）只是定植侵襲性肺念珠菌病的早期診斷和治療“EPCAN”研究：念珠菌指數(shù)（Candidascore）ICU病人，入住時(shí)間＞7d：侵襲性念珠菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為全靜脈營(yíng)養(yǎng)（TPN）、手術(shù)、多部位念珠菌定植（每項(xiàng)危險(xiǎn)系數(shù)1分）、嚴(yán)重膿毒血癥（危險(xiǎn)系數(shù)2分）；將每例患者的所有危險(xiǎn)系數(shù)相加，就得到該患者的念珠菌指數(shù)。當(dāng)念珠菌指數(shù)≥2.5時(shí)，診斷侵襲性念珠菌感染的敏感性為81%，特異性為74%。Leonetal.CritCareMed2006;34:730–737念珠菌積分（Candidascore）Leonetal.CritCareMed2006;34:730–737侵襲性念珠菌病的預(yù)測(cè)因子O.R.C.I.95%SCORE多部位念珠菌定植3.041.45–6.391ICU入住前手術(shù)史2.711.45–5.061TPN2.481.16–5.311嚴(yán)重的膿毒血癥7.684.14–14.222

積分＞2.5的患者能夠在早期應(yīng)用抗真菌藥物中獲益如何理解痰培養(yǎng)的價(jià)值？痰培養(yǎng)念珠菌陽(yáng)性的價(jià)值有限痰培養(yǎng)分離到念珠菌，要結(jié)合臨床高危因素：定植指數(shù)血清標(biāo)志物：G試驗(yàn)痰涂片鏡檢：有無(wú)出芽、菌絲痰培養(yǎng)陽(yáng)性的臨床意義？——綜合評(píng)估如果患者存在明顯的高危因素，有肺部感染的臨床表現(xiàn)又不能用其他病原菌感染解釋，血清真菌感染標(biāo)志物（如G試驗(yàn)）陽(yáng)性，此時(shí)痰培養(yǎng)念珠菌為唯一病原體且為反復(fù)培養(yǎng)陽(yáng)性或?yàn)榧兣囵B(yǎng)，可以作為針對(duì)念珠菌診斷性或經(jīng)驗(yàn)性治療的依據(jù)，至少提醒臨床醫(yī)生應(yīng)提高警惕，特別是除肺外還有其他部位也分離到念珠菌時(shí)。懷疑念珠菌肺炎的患者在呼吸道標(biāo)本檢測(cè)的同時(shí)應(yīng)做血液真菌培養(yǎng)，如血培養(yǎng)分離出念珠菌，且與呼吸道分泌物培養(yǎng)結(jié)果相一致，有助于念珠菌血癥繼發(fā)肺念珠菌病或肺炎合并念珠菌血癥的診斷。內(nèi)容提要如何看待呼吸道分泌物檢出的念珠菌？如何看待泌尿道檢出的念珠菌？如何看待腹腔標(biāo)本檢出的念珠菌？“尿液檢測(cè)念珠菌陽(yáng)性”一定是念珠菌定植么？不一定尿液檢測(cè)念珠菌陽(yáng)性與念珠菌菌尿癥尿培養(yǎng)念珠菌陽(yáng)性檢驗(yàn)學(xué)污染定植尿路感染念珠菌血癥早期癥候念珠菌菌尿癥臨床有無(wú)尿管有無(wú)感染征象是否高?；颊哂袩o(wú)泌尿系粘膜功能破壞關(guān)鍵問(wèn)題：持續(xù)培養(yǎng)是否陽(yáng)性？其它部位培養(yǎng)是否陽(yáng)性？關(guān)鍵問(wèn)題：是不是需要預(yù)防治療？哪些患者需要治療？怎么樣才算是一份合格的尿液標(biāo)本？清潔中段尿盡量取晨起第一次尿液棄去開始流出的尿液，以沖刷尿道口的細(xì)菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿?qū)蚬苣蛞杭虼鼉?nèi)的尿液不能用作培養(yǎng)；導(dǎo)尿管末端的尿液也不能用于培養(yǎng)，因?yàn)楹茈y避免沒(méi)有尿道菌群污染。留置導(dǎo)管尿液標(biāo)本常通過(guò)專門的采樣端口采集，不能把導(dǎo)尿管與尿袋拔開后收集尿液尿培養(yǎng)標(biāo)本送檢多次收集或24小時(shí)尿不能用作培養(yǎng)室溫都有利于病原菌和污染菌會(huì)生長(zhǎng)繁殖，因此若30min內(nèi)不能及時(shí)培養(yǎng)尿液則必須冷藏，但也要盡可能及時(shí)送檢，不宜超過(guò)8h一部分患者可能是導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染7.010.012.57.84.710.46.38.701020所有ICUs跨科室<400床位跨科室≥400床位內(nèi)科外科神經(jīng)外科神經(jīng)科心血管外科ChristineGeffers,etal.DtschArzteblInt2011;108(6):87–93流行病學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)自于KISS(德國(guó)院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)系統(tǒng))586個(gè)ICUs中導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染白念珠菌繼大腸桿菌，腸球菌和綠膿桿菌排第四位白念珠菌ICUs導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染率為8.7%內(nèi)科ICU最高12.5%導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染%“尿液檢測(cè)念珠菌陽(yáng)性”對(duì)于哪些患者有意義？直接鏡檢念珠菌數(shù)量及形態(tài)特點(diǎn)的提示尿念珠菌定量：一種觀點(diǎn)認(rèn)為，當(dāng)念珠菌菌尿菌落計(jì)數(shù)≥1X104CFU/mL時(shí)，在嚴(yán)重疾病患者中預(yù)示侵襲性念珠菌病(IC)醫(yī)師常常并不關(guān)注尿培養(yǎng)念珠菌陽(yáng)性結(jié)果通過(guò)念珠菌形態(tài)鑒別定植與感染：有學(xué)者通過(guò)假菌絲生長(zhǎng)或抗體包裹來(lái)判斷感染與定植，該方法的不足是光滑念珠菌不產(chǎn)生假菌絲、白念珠菌長(zhǎng)假菌絲也會(huì)受pH值、營(yíng)養(yǎng)因素的影響而抗體包裹不具有特異性決不能忽視直接鏡檢的意義有基礎(chǔ)疾病的住院患者需警惕念珠菌菌尿癥1991-1993年，美國(guó)一項(xiàng)多中心，前瞻性研究：861例患者中89.1%有潛在基礎(chǔ)疾病，白念珠菌是最常見(jiàn)的分離菌39.037.722.217.06.94.33.510.952.30204060手術(shù)操作糖尿病泌尿道疾病惡性腫瘤營(yíng)養(yǎng)不良外傷粒缺移植無(wú)神經(jīng)源性膀胱12.2%前列腺病，結(jié)石或其它部位阻塞11.6%腎衰竭7.5%復(fù)發(fā)感染3.7%內(nèi)在的腎臟疾病2.7%KauffmanCA,etal.ClinInfectDis.2000Jan;30(1):14-8.患者比例%有臨床表現(xiàn)及高危因素的患者需警惕念珠菌菌尿癥無(wú)癥狀念珠菌尿：多為良性無(wú)危險(xiǎn)因素的病人有危險(xiǎn)因素的門診病人有危險(xiǎn)因素的住院病人有癥狀念珠菌尿：尿道炎前列腺炎膀胱炎輸尿管真菌球原發(fā)性腎念珠菌病血源播散性念珠菌病(累及腎)危險(xiǎn)因素糖尿病腎移植高齡留置導(dǎo)尿管女性伴細(xì)菌尿延長(zhǎng)住院期泌尿道先天畸形入住ICU泌尿道結(jié)構(gòu)異常使用廣譜抗生素尿停滯膀胱功能障礙腎結(jié)石FisherJF,etal.ClinInfectDis.2011May;52Suppl6:S457-66.117需警惕尿路念珠菌播散至血的可能一項(xiàng)流行病學(xué)研究顯示，念珠菌菌尿癥與院內(nèi)念珠菌血癥顯著相關(guān)OR9.79因此，泌尿系念珠菌感染可以是全身感染的一部分,也可成為繼發(fā)性念珠菌敗血癥的發(fā)源地需警惕念珠菌菌尿癥可