重組DNA技術(shù)的基本工具課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修34

第3章

基因工程

我國是棉花的生產(chǎn)和消費大國。棉花在種植過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。棉鈴蟲可以使棉花產(chǎn)量減少三分之一，嚴重時，甚至能使一片棉田絕收。大量施用農(nóng)藥殺蟲不僅會提高生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境污染。要是能培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種，這一問題就會迎刃而解，我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是在這樣的背景下產(chǎn)生的。(P67)棉花棉鈴蟲幼蟲

?1998年中棉所成功培育出我國第一個國審抗蟲雜交棉新品種------中棉所29，使低齡棉鈴蟲的死亡率超過90%；

?2002年成功培育出我國第一個雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種------中棉所41，該品種能夠緩解棉鈴蟲抗藥性。

為什么傳統(tǒng)的雜交育種方法培育不出抗蟲棉，基因工程卻可以？

是按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品，從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫做重組DNA技術(shù)。生物體外1.操作環(huán)境：2.操作對象：3.操作水平：第3章

基因工程1.概念：P674.原理：5.結(jié)果：基因DNA分子水平基因重組按照人們的需要定向改造生物的遺傳特性1944年，艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實驗，不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物個體間轉(zhuǎn)移。1958年，梅塞爾森和斯塔爾用實驗證明了DNA的半保留復(fù)制。幾乎同一時期確立的中心法則闡明了遺傳信息流動的方向。1961年，尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。截至1966年，64個密碼子均被破譯成功。1970年，科學(xué)家在細菌中發(fā)現(xiàn)了第一個限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱限制酶）1950年，愛德曼發(fā)明了一種測定氨基酸序列的方法。2年后，桑格首次完成了對胰島素氨基酸序列的測定。1953年，沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假說。1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細菌細胞間轉(zhuǎn)移。20世紀70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。第3章

基因工程2.科技探索之路：基因工程的誕生和發(fā)展(P68-69)1972年，伯格首先在體外進行了DNA的改造，成功構(gòu)建了第一個體外重組DNA分子。1977年，桑格等科學(xué)家發(fā)明了DNA序列分析的方法，為基因序列圖的繪制提供了可能。此后，DNA合成儀的問世為體外合成DNA提供了方便。1982年，第一個基因工程藥物-重組人胰島素被批準上市?；蚬こ趟幬锍蔀槭澜绺鲊芯亢屯顿Y開發(fā)的熱點。1984年，我國科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團隊培育出世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚。1973年，科學(xué)家證明了質(zhì)?？梢宰鳛榛蚬こ痰妮d體，并實現(xiàn)了物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。1983年，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。此后，基因工程進入了迅速發(fā)展的階段。2013年，華人科學(xué)家張鋒及其團隊首次報道利用最新的基因組編輯技術(shù)---CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)）技術(shù)編輯了哺乳動物基因組。該技術(shù)可以實現(xiàn)對特定基因的定點插入、敲除或替換。1985年，穆里斯等人發(fā)明PCR，為獲取目的基因提供了有效手段。第3章

基因工程2.科技探索之路：基因工程的誕生和發(fā)展(P68-69)1990年，人類基因組計劃啟動。2003年，該計劃的測序任務(wù)順利完成。21世紀以來，科學(xué)家發(fā)明了多種高通量測序技術(shù)，可以實現(xiàn)低成本測定大量核酸序列，加速了人們對基因組序列的了解。課堂練習(xí)基于基因工程的誕生和發(fā)展的相關(guān)基礎(chǔ)理論，判斷下列說法的正誤。1.1953年，沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并用實驗證明了DNA的半保留復(fù)制。（

）2.1970年，在細菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個限制酶，后來又發(fā)現(xiàn)了多種限制酶、DNA連接酶等。（

）3.1972年，伯格首先在體外進行了DNA的改造，并構(gòu)建了第一個體外重組DNA分子。（

）4.1983年，科學(xué)家采用花粉管通道法培育了世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。（

）5.1984年，我國科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團隊培育了世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚。（

）×√√×√3.1

重組DNA技術(shù)的基本工具從社會中來

番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵害。當(dāng)番木瓜受到這種病毒感染后，產(chǎn)量會大大下降?？茖W(xué)家通過精心設(shè)計用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？非轉(zhuǎn)基因番木瓜（右）轉(zhuǎn)基因番木瓜(左）實現(xiàn)這一精準的操作過程，至少需要三種“分子工具”，即準確切割DNA的“分子手術(shù)刀”、將DNA片段再連接起來的“分子縫合針”和將體外組好的DNA分子導(dǎo)入受體細胞的“分子運輸車”。重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具”一、限制性內(nèi)切核酸酶二、DNA連接酶三、基因進入受體細胞的載體一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”:P711.來源：2.作用：主要是從原核生物中分離純化來的能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。注意作用部位：磷酸二酯鍵3.結(jié)果：黏性末端和平末端（酶專一性）資料卡限制酶名字的由來：P72

限制酶是如何命名的呢？是用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的.例如，一種限制酶是從大腸桿菌(Escherichiacoli）的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示;如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶,則進一步表示成EcoRI。例如，流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ二、拓展應(yīng)用1.想一想，為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？

細菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因為含有某種限制酶的細胞的DNA分子，不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。所以，盡管細菌中含有限制酶，但它自身的DNA也不會被切割，并且可以防止外源DNA入侵。思考：如何將切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子？練習(xí)與應(yīng)用：P74P72靠DNA連接酶來完成的。種類______________________________________來源大腸桿菌T4噬菌體作用差別

連接____________和____________

E·coliDNA連接酶T4DDNA連接酶黏性末端平末端

二、DNA連接酶——“分子縫合針”：P72都能將雙鏈DNA片段“縫合“起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵。（注意：E·coliDNA連接酶連接平末端的效率較低）思考：P72DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？不是一回事。雖然兩者都是催化磷酸二酯鍵形成的酶，化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)，但兩者存在顯著的區(qū)別：區(qū)別DNA連接酶DNA聚合酶不同點模板不需要模板需要DNA的一條鏈作模板作用對象催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵只能催化單個核苷酸加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵作用結(jié)果形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈用途基因工程DNA復(fù)制根據(jù)所學(xué)知識，據(jù)圖完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶ba1.切斷a處的酶為_______

2.連接a處的酶為_______3.切斷b處的酶為_______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵反饋練習(xí)練習(xí)與應(yīng)用：P74C三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”：P721.常用載體：質(zhì)粒（1）本質(zhì)：（2）特點：是一種裸露、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中。攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進入受體細胞后，能在細胞中進行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。注意：在基因工程中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。這些質(zhì)粒上常有特殊的標記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重組DNA分子的篩選。小結(jié)：質(zhì)粒適于做載體的特點（學(xué)生朗讀）（1）.有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段插入；（2）.攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進入受體細胞后，能在細胞中進行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制；（3）.人工改造的質(zhì)粒常帶有特殊的標記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重組DNA分子的篩選。2.其他載體：P72-73除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動植物病毒等?？偨Y(jié)：重組DNA技術(shù)的基本工具有限制酶、DNA連接酶和載體；

工具酶:只有限制酶和DNA連接酶。練習(xí)與應(yīng)用：P74A課堂小結(jié)：3.1重組DNA技術(shù)的基本工具一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”1.來源：原核生物(主要)2.作用：能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。（體現(xiàn)酶具有專一性的特點）3.結(jié)果：黏性末端和平末端二、DNA連接酶——“分子縫合針”E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”1.常用載體：質(zhì)粒（本質(zhì)、特點）2.其他載體：噬菌體、動植物病毒等

高考真題（2024·湖南·高考真題）某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是（）A．限制酶失活，更換新的限制酶B．酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等C．質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點缺失，更換正常質(zhì)粒DNAD．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶B酶切條件不合適通常會使切割效果下降，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和PH等，調(diào)整酶的用量沒有作用，B錯誤。

探究.實踐

DNA的粗提取與鑒定一、實驗原理:P74基本思路：DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對它們進行提取。1.DNA的提?。篋NA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可以用酒精初步分離DNA與蛋白質(zhì)。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。2.DNA的鑒定：DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色。DNA+二苯胺沸水浴加熱藍色二、目的要求:P741.了解DNA的物理和化學(xué)性質(zhì)，理解DNA粗提取和鑒定的原理。2.學(xué)會DNA粗提取的方法以及用二苯胺試劑對DNA進行鑒定。三、材料用具：P741.材料洋蔥菜花香蕉豬肝菠菜2.用具:略

探究.實踐

DNA的粗提取與鑒定三、方法步驟:P74-75（學(xué)生朗讀）1.研磨洋蔥：稱取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，切碎，倒入10mL研磨液，充分研磨。2.過濾獲取含DNA的上清液：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。3.冷卻酒精析出DNA：在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分數(shù)為95%)，靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或者將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。研磨洋蔥

探究.實踐

DNA的粗提取與鑒定三、方法步驟:P74-754.DNA的鑒定：取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。

探究.實踐

DNA的粗提取與鑒定注意事項：1.在將待鑒定的提取物加入2mol/L的NaCl溶液中溶解時，需要不斷攪拌以增加溶解的DNA的量，建議攪拌3min以上。2.二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證實驗效果。加入二苯胺試劑后沸水浴處理的時間要在5min以上，且要等到冷卻后再觀察結(jié)果，這樣才可以觀察到較為明顯的顯色反應(yīng)。四、結(jié)果分析與評價：P751.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可含有哪些雜質(zhì)嗎？（1）觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。（2）二苯胺試劑鑒定呈藍色說明實驗基本成功；如果不呈現(xiàn)藍色，可能原因有：所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程出現(xiàn)了失誤等?？赡芎泻说鞍?、多糖等雜質(zhì)。

探究.實踐

DNA的粗提取與鑒定四、結(jié)果分析與評價：P753.與其他同學(xué)提取的DNA進行比較，看看實驗結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。

同學(xué)們可采取分組的方式進行實驗。可以選取不同的實驗材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實驗結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實驗材料、哪種方法提取效果更好。五、進一步探究：P75

本實驗只是對DNA進行了粗提取，請查閱資料，了解實驗室提取純度較高的DNA的一種方法，并與本實驗中所使用的方法進行比較，總結(jié)兩種方法的異同。

探究.實踐

DNA的粗提取與鑒定探究.實踐

DNA的粗提取與鑒定P74四、結(jié)果分析與評價3與其他同學(xué)提取的DNA進行比較，看看實驗結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。同學(xué)們可采取分組的方式進行實驗?？梢赃x取不同的實驗材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實驗結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試