DB35∕T 1822-2019 水禽圓環(huán)病毒感染PCR鑒別診斷技術

DB35DB35/T1822—2019水禽圓環(huán)病毒感染PCR鑒別診斷技術PCRdiagnostictechniquesfordifferentiatingcircovirusinfectioninwaterfowls2019-04-18發(fā)布2019-07-18實施福建省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 4 6 7本標準主要起草人：傅光華、施少華、黃勇、彭春香、傅秋玲、黃瑜、白泉陽、葉洪、萬春和、1水禽圓環(huán)病毒（Waterfowlcircovirus）為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，主要包括鴨圓環(huán)病毒），）：2發(fā)病鴨（鵝）的法氏囊、脾臟等器官，剪碎后與磷酸鹽緩沖液（PBS，見附錄A的A.8）按體積比1：5的比例制成組織勻漿液，反復凍融3次，8000r/min離心30min，取上清，用于DNA抽提，或置-20℃凍若采集的樣品需放置6h以上再進行處理，應先置-20℃條件下保存?zhèn)溆茫柰羞\時應確保冷藏或其中，CVF為共用上游引物，CVF與DuCVR用于檢測DuCV，擴增條帶為554bp大小的基因片段，CVF與GoCVR用于檢測GoCV，擴增條帶為407bp大小的基因片段。各引物的工作濃度均為10mmol/L，保存于4℃~8℃條件下。3），反應結束后，分別取待檢樣品、陰性對照樣品、陽性對照樣品和空白對照樣品各5μLPCR產物使用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察核酸條帶并判斷結果，經核酸擴鴨圓環(huán)病毒樣品出現(xiàn)554bp大小的擴增條帶（參見附錄C中圖C.1的3號泳道陽性樣品混合物出現(xiàn)407bp和554bp大小的擴增條帶（參見附錄C中圖C.1的4號泳道），空白對照樣品和陰性對照樣品均無），4A.23mol/L的醋酸鈉溶液(NaOA.5.1配制0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（稱取二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g溶解于適量滅菌去離子水中，混勻后用10%氫氧化鈉溶液調pH羥基甲基氨基甲烷（Tris）242g0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）50×TAE電泳緩沖液5置微波爐中加熱至完全融化，待冷至50℃~60℃時，加溴化乙錠（EB）溶液5μL，搖勻后倒入制Na2HPO4·12H2OKH2PO4將上述試劑溶于800mL蒸餾水中，定容至1000mL，1.034×105Pa高壓滅菌30min，4℃保存?zhèn)? AATCTCGCGGGAAGTGGTGGGATGGCTATAATGGGCAGGATGTGGTTGTGATGGATGATTTTTATGGGTGGCTCCCTTCCTTTTAAGGATCTGTGATCGCTATCCTTTACGGGTTGAGTATAAGGGTGGTATGACCCAGTTCGTGTCTAAGACCCCTAATAGGGAGCCTCGCGATTGGTATAAATGCGAGTGTGATGTGTCGGCATTGTATCGGAGAATTAATCAGTACCTGGATGGTTATGCGCCCGCCCCTGATTTTATGCTGCCGTTCCCAATAAACTACTAGAGACCTGGTTAAGGTTAGAATAAGTGTAAAATTACAATAAAGTTATGGTGCAAGCCCAGTCCATTGTCAACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTACTCGGGAAATGACGTAGTCGTCATGGACGACTTTTATGGTTGGTTGCCTTTTTGCTGAGAATTACCGACCGTTACCCTTTACGGGTTGAATTTAAAGGCGGTATGACTCAGTTTGTGGCTAAGACCTTGATGTAACCGCGAGCCTCGTGATTGGTACAAGAGCGAGTTTGACCTTTCAGCTCTGTACCGCAGAATTAACAAGTATCTTGTGTGACAAGTACGAACCCGCCCAGGCATGTACCCTCCCGTTCCCAATAAACTACTGAGACCAATTTGCCGTGAGTCGTTTATTAACTTGGCAGGGTATTACACTTGGGCAGCTCGGTTAAGGTTAGGCACTTGGCAGGGATTAAACACTTGGGCAGCTCGGTTAAACTTGGCAGGGATT