固定化酶和固定化細(xì)胞課件

固定化酶和固定化細(xì)胞

4.1固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)所謂固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空間範(fàn)圍內(nèi)起催化作用，並能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重複多次地使用；（2）固定化後，和反應(yīng)物分開(kāi)，有利於控制生產(chǎn)過(guò)程，同時(shí)也省去了熱處理使酶失活的步驟；（3）穩(wěn)定性顯著提高；（4）可長(zhǎng)期使用，並可預(yù)測(cè)衰變的速度；（5）提供了研究酶動(dòng)力學(xué)的良好模型。4.2酶固定化技術(shù)發(fā)展史

酶作為一種生物催化劑，因其催化作用具有高度專一性、催化條件溫和、無(wú)污染等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用於食品加工、醫(yī)藥和精細(xì)化工等行業(yè)。但在使用過(guò)程中，人們也注意到酶的一些不足之處，如酶穩(wěn)定性差、不能重複使用，並且反應(yīng)後混入產(chǎn)品，純化困難，使其難以在工業(yè)中更為廣泛的應(yīng)用。為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，人們模仿人體酶的作用方式，通過(guò)固定化技術(shù)對(duì)酶加以固定改造，來(lái)克服游離酶在使用過(guò)程中的一些缺陷。將酶固定化以後，既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，使其具有一般化學(xué)催化劑能回收反復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，並在生產(chǎn)工藝上可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)化。事實(shí)上，早在1916年，Nelson和Griffin就用吸附的方法實(shí)現(xiàn)了酶的固定化，他們將蔗糖酶吸附在骨炭粉上，發(fā)現(xiàn)吸附以後酶不溶於水而且具有和液體酶同樣的活性，可惜這個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期以來(lái)沒(méi)有得到酶學(xué)家的重視。系統(tǒng)地進(jìn)行酶的固定化研究則是從20世紀(jì)50年代開(kāi)始的。1953年Grubhofer和Schleith將聚氨基苯乙烯樹(shù)脂重氮化，然後將澱粉酶、羧肽酶、、胃蛋白酶和核糖核酸酶等酶與這種載體結(jié)合，製成了固定化酶。六十年代後期，酶固定化技術(shù)迅速發(fā)展，出現(xiàn)了很多新的酶固定化方法。1969年，日本的著名學(xué)者千畑一郎等將固定化氨基醯化酶應(yīng)用於DL-氨基酸的光學(xué)拆分上，來(lái)生產(chǎn)L-氨基酸，開(kāi)創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用於工業(yè)生產(chǎn)的先例。在20世紀(jì)60年代後期對(duì)酶的固定化研究主要是將酶與水不溶性載體結(jié)合起來(lái)，成為不溶於水的酶衍生物，所以最初曾稱為水不溶酶（waterinsolubleenzyme）和固相酶（solidphaseenzyme）。但是隨著理論與技術(shù)的發(fā)展，後來(lái)發(fā)現(xiàn)也可以將溶解狀態(tài)的酶固定在一個(gè)有限的空間使其不能自由移動(dòng)，也能達(dá)到固定酶的作用。如把酶包埋在凝膠內(nèi)，酶本身是可溶的，因此，用水不溶酶和固相酶的名稱就不恰當(dāng)了。所以在1971年召開(kāi)的第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議上，建議採(cǎi)用統(tǒng)一的英文名稱ImmobilizedEnzyme。用於固定化的酶，起初都是採(cǎi)用經(jīng)提取和分離純化後的酶，後來(lái)隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，作為固定化的對(duì)象已不一定是酶，也可對(duì)含酶細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行固定化。1973年，日本的千畑一郎等成功的使用固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸，將固定化微生物細(xì)胞首次應(yīng)用於工業(yè)生產(chǎn)，使細(xì)胞固定化技術(shù)迅速發(fā)展1986年，我國(guó)科學(xué)家利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)鹼性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功。目前，固定化技術(shù)已經(jīng)取得了許多重要成果，充分發(fā)揮了固定化酶和固定化細(xì)胞在改革工藝和降低成本方面的巨大潛力。但從目前的發(fā)展?fàn)顩r來(lái)看，儘管酶種類繁多，但已經(jīng)固定化的酶卻相對(duì)有限，採(cǎi)用固定化酶技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)尚屬少數(shù)，真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限於葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶和青黴素醯化酶等為數(shù)不多的十幾個(gè)酶種，故仍需大力研究開(kāi)發(fā)使更多的固定化酶和細(xì)胞能適用於工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。4.3固定化酶的製備方法固定化酶的製備方法、製備材料多種多樣，不同的製備方法和材料，固定化後酶的特性不同。對(duì)於特定的目標(biāo)酶，要根據(jù)酶自身的性質(zhì)、應(yīng)用目的、應(yīng)用環(huán)境來(lái)選擇固定化載體和方法。在具體選擇時(shí)，一般應(yīng)遵循以下幾個(gè)原則。

（1）必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是活性中心的構(gòu)象。酶的催化反應(yīng)取決於酶本身蛋白質(zhì)分子所特有的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心，為了不損害酶的催化活性及專一性，酶在固定化狀態(tài)下發(fā)揮催化作用時(shí)，既需要保證其高級(jí)結(jié)構(gòu)，又要使構(gòu)成活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化。這就要求酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位，應(yīng)避免活性中心的氨基酸殘基參與固定化反應(yīng)；另外，由於酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)是憑藉疏水鍵、氫鍵、鹽鍵等較弱的鍵維持的，所以固定化時(shí)應(yīng)採(cǎi)取盡可能溫和的條件，避免那些可能導(dǎo)致酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞的條件，如高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)鹼、有機(jī)溶劑等處理。（2）酶與載體必須有一定的結(jié)合程度。酶的固定化既不影響酶的原有構(gòu)象，又能使固定化酶能有效回收貯藏，利於反復(fù)使用。（3）固定化應(yīng)有利於自動(dòng)化、機(jī)械化操作。這要求用於固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，才能使之在製備過(guò)程中不易破壞或受損。（4）固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。固定化應(yīng)盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高催化效率和產(chǎn)物的量。（5）固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性。在應(yīng)用過(guò)程中，所選載體應(yīng)不和底物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。（6）固定化酶的成本適中。工業(yè)生產(chǎn)必須要考慮到固定化成本，要求固定化酶應(yīng)是廉價(jià)的，以利於工業(yè)使用。酶的固定化方法主要可分為四類：吸附法、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法和交聯(lián)法等。吸附法和共價(jià)鍵結(jié)合法又可統(tǒng)稱為載體結(jié)合法。4.3.1吸附法吸附法（adsorption）是通過(guò)載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡(jiǎn)單的方法。酶與載體之間的親和力是範(fàn)德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。物理吸附法(physicaladsorption)是通過(guò)物理方法將酶直接吸附在水不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。是製備固定化酶最早採(cǎi)用的方法，如α-澱粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾採(cǎi)用過(guò)此法進(jìn)行固定化。物理吸附法常用的有機(jī)載體如纖維素、膠原、澱粉及麵筋等；無(wú)機(jī)載體如活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、矽膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。（1）物理吸附法物理吸附法制備固定化酶，操作簡(jiǎn)單、價(jià)廉、條件溫和，載體可反復(fù)使用，酶與載體結(jié)合後，活性部位及空間構(gòu)象變化不大，故所制得的固定化酶活力較高。但由於靠物理吸附作用，酶和載體結(jié)合不牢固，在使用過(guò)程中容易脫落，所以使用受到限制。常與交聯(lián)法結(jié)合使用。離子吸附法(ionadsorption)是將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法，即通過(guò)離子鍵使酶與載體相結(jié)合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖異構(gòu)酶、糖化酶、β-澱粉酶、纖維素酶等，在工業(yè)上用途較廣。如最早應(yīng)用於工業(yè)化生產(chǎn)的氨基醯化酶，就是使用多糖類陰離子交換劑二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖凝膠固定化的。此外，DEAE-纖維素吸附的α-澱粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。（2）離子吸附法離子吸附法所使用的載體是某些離子交換劑。常用的陰離子交換劑有DEAE-纖維素、混合胺類(ECTEOLA)-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、AmberliteIRA-93、410、900等；陽(yáng)離子交換劑有羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽、AmberliteCG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。其吸附容量一般大於物理吸附劑。離子吸附法具有操作簡(jiǎn)便、條件溫和、酶活力不易喪失等優(yōu)點(diǎn)。此外，吸附過(guò)程同時(shí)可以純化酶。4.3.2包埋法包埋法（entrapment）是將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；後者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。（1）凝膠包埋法凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯醯胺、聚乙烯醇和光交聯(lián)樹(shù)脂等合成凝膠或樹(shù)脂。（2）微膠囊包埋法微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物製成的半透膜微膠囊內(nèi)的方法。它使酶存在於類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。常用於製造微膠囊的材料有聚醯胺、火棉膠、醋酸纖維素等。用微膠囊包埋法制得的微囊型固定化酶的直徑通常為幾微米到數(shù)百微米，膠囊孔徑為幾埃至數(shù)百埃，適合於小分子為底物和產(chǎn)物的酶的固定化。如脲酶、天冬醯胺酶、尿酸酶、過(guò)氧化氫酶等。其製造方法有介面聚合法、介面沉澱法、二級(jí)乳化法、液膜（脂質(zhì)體）法等。4.3.3共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法(covalentbinding）是將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)有以下幾種：（1）酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天門冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基。（3）半胱氨酸殘基的巰基。（4）絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。（5）組氨酸殘基的咪唑基。（6）色氨酸殘基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。其中最普遍的共價(jià)鍵結(jié)合基團(tuán)是氨基、羧基以及苯環(huán)。常用來(lái)和酶共價(jià)偶聯(lián)的載體的功能基團(tuán)有芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等。這種方法是固定化酶研究中最活躍的一大類方法，但必須注意，參加共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是酶催化活性非必需基團(tuán)，如若共價(jià)結(jié)合包括了酶活性中心有關(guān)的基團(tuán)，會(huì)導(dǎo)致酶的活力損失。（1）重氮法重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵相連接而固定化的方法，是共價(jià)鍵法中使用最多的一種。常用的載體有多糖類的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚體和聚丙烯醯胺衍生物等。（2）疊氮法即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)成固定化酶。含有羥基、羧基、羧甲基等基團(tuán)的載體都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交聯(lián)葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等都可用此法來(lái)固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纖維素疊氮法。（3）溴化氰法即用溴化氰將含有羥基的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然後再與酶分子上的氨基偶聯(lián)，製成固定化酶。任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來(lái)活化。由於該法可在非常緩和的條件下與酶蛋白的氨基發(fā)生反應(yīng)，近年來(lái)已成為普遍使用的固定化方法。尤其是溴化氰活化的瓊脂糖已在實(shí)驗(yàn)室廣泛用於固定化酶以及親和層析的固定化吸附劑。

（4）烷化法和芳基化法以鹵素為功能團(tuán)的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反應(yīng)而使酶固定化。此法常用的載體有鹵乙醯、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。從上面介紹的四種製備方法可看出，用共價(jià)鍵結(jié)合法制備的固定化酶，酶和載體之間都是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)以共價(jià)鍵偶聯(lián)。由於共價(jià)鍵的鍵能高，酶和載體之間的結(jié)合相當(dāng)牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會(huì)使酶分子從載體上脫落下來(lái)，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。但是採(cǎi)用該方法時(shí)，載體活化的難度較大，操作複雜，反應(yīng)條件較劇烈，製備過(guò)程中酶直接參與化學(xué)反應(yīng)，易引起酶蛋白空間構(gòu)象變化，酶活回收率一般為30%左右，甚至酶的底物的專一性等性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，往往需要嚴(yán)格控制操作條件才能獲得活力較高的固定化酶?，F(xiàn)在已有不少活化的商品化酶固定化載體，它們的使用不需做大量的處理工作，商品一般以幹的固定相或預(yù)裝柱的形式供應(yīng)，一般情況下這些固定相已經(jīng)活化好，酶的固定化只要將酶在合適的pH和其他相關(guān)條件下，讓酶迴圈通過(guò)柱子便可完成。

4.3.4交聯(lián)法交聯(lián)法（cross-linking）是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。由於酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間將有利於固定化酶活力的提高。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶氮聯(lián)苯和N,N′-乙烯雙順丁烯二醯亞胺等，其中使用最廣泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反應(yīng)，形成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)（見(jiàn)表4-1）。往往一種酶可以用不同方法固定化，但沒(méi)有一種固定化方法可以普遍地適用於每一種酶。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，常將兩種或數(shù)種固定化方法並用，以取長(zhǎng)補(bǔ)短。4.4固定化酶的特性4.4.1固定化酶的形狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數(shù)，它和線條主要用於工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用於連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)；薄膜主要用於酶電極，應(yīng)用於分析化學(xué)；酶管機(jī)械強(qiáng)度較大，亦宜用於工業(yè)生產(chǎn)。4.4.2固定化酶的性質(zhì)酶在水溶液中以自由的游離狀態(tài)存在，但是固定後酶分子便從游離的狀態(tài)變?yōu)槔喂痰亟Y(jié)合於載體的狀態(tài)，其結(jié)果往往引起酶的性質(zhì)的改變。為此，在固定化酶的應(yīng)用過(guò)程中，必須瞭解固定化酶的性質(zhì)與游離酶之間的差別，並對(duì)操作條件加以適當(dāng)調(diào)整。由於固定化的方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)也有所不同。4.4.3酶活力固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是：①酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結(jié)合；②當(dāng)酶與載體結(jié)合時(shí)，它的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其構(gòu)象的改變導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變；③酶被固定化後，雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻的影響。也有在個(gè)別情況下，酶經(jīng)固定化後其活力升高，可能是由於固定化後酶的抗抑能力提高使得它反而比游離酶活力高。4.4.4固定化酶的穩(wěn)定性

游離酶的一個(gè)突出缺點(diǎn)是穩(wěn)定性差，而固定化酶的穩(wěn)定性一般都比游離酶提高得多，這對(duì)酶的應(yīng)用是非常有利的。其穩(wěn)定性增強(qiáng)主要表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面：（1）操作穩(wěn)定性酶的固定化方法不同，所得的固定化酶的操作穩(wěn)定性亦有差異。固定化酶在操作中可以長(zhǎng)時(shí)間保留活力，一般情況下，半衰期在一個(gè)月以上，即有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。（2）貯藏穩(wěn)定性固定化可延長(zhǎng)酶的貯藏有效期。但長(zhǎng)期貯藏，活力也不免下降，最好能立即使用。如果貯藏條件比較好，亦可較長(zhǎng)時(shí)間保持活力。例如，固定化胰蛋白酶，在0.0025mol/L磷酸緩衝液中，於20℃保存數(shù)月，活力尚不損失。（3）熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性對(duì)工業(yè)應(yīng)用非常重要。大多數(shù)酶在固定化之後，其熱穩(wěn)定性都有所提高，但也有一些酶的耐熱性反而下降。一般採(cǎi)用吸附法來(lái)進(jìn)行酶的固定化時(shí)，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致酶熱穩(wěn)定性的降低。（4）對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性酶經(jīng)固定化後，其對(duì)蛋白酶的抵抗力提高。這可能是因?yàn)榈鞍酌甘谴蠓肿?，由於受到空間位阻的影響，不能有效接觸固定化酶。例如，千畑一郎發(fā)現(xiàn)，用尼龍或聚脲膜包埋，或用聚丙烯醯胺凝膠包埋的固定化天門冬醯胺酶，對(duì)蛋白酶極為穩(wěn)定，而在同一條件下，游離酶幾乎全部失活。另外固定化後酶對(duì)有機(jī)試劑和酶抑制劑的耐受性也得到了提高。（5）酸堿穩(wěn)定性

多數(shù)固定化酶的酸堿穩(wěn)定性高於游離酶，穩(wěn)定pH範(fàn)圍變寬。極少數(shù)酶固定化後穩(wěn)定性下降，可能是由於固定化過(guò)程使酶活性構(gòu)象的敏感區(qū)受到牽連而導(dǎo)致的。4.4.5固定化酶的反應(yīng)特性固定化酶的反應(yīng)特性，例如，底物特異性、酶反應(yīng)的最適pH、酶反應(yīng)的最適溫度、動(dòng)力學(xué)常數(shù)、最大反應(yīng)速度等均與游離酶有所不同。（1）底物特異性固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有一定關(guān)係。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)酶的底物為小分子化合物時(shí)，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生變化。例如，氨基醯化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶等，固定化前後的底物特異性沒(méi)有變化；而當(dāng)酶的底物為大分子化合物時(shí)，如蛋白酶、α-澱粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特異性往往會(huì)發(fā)生變化。這是由於載體引起的空間位阻作用，使大分子底物難以與酶分子接近而無(wú)法進(jìn)行催化反應(yīng)，酶的催化活力難以發(fā)揮出來(lái)，催化活性大大下降；而分子量較小的底物受到空間位阻作用的影響較小，與游離酶沒(méi)有顯著區(qū)別。酶底物為大分子化合物時(shí)，底物分子量不同，對(duì)固定化酶底物特異性的影響也不同，一般隨著底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。例如，糖化酶用CMC疊氮衍生物固定化時(shí)，對(duì)分子量8000的直鏈澱粉的活性為游離酶的77％，而對(duì)分子量為50萬(wàn)的直鏈澱粉的活性只有15%～17％。（2）反應(yīng)的最適pH酶被固定後，其最適pH和pH曲線常會(huì)發(fā)生偏移，原因可能有以下三個(gè)方面：一是酶本身電荷在固定化前後發(fā)生變化；二是由於載體電荷性質(zhì)的影響致使固定化酶分子內(nèi)外擴(kuò)散層的氫離子濃度產(chǎn)生差異；三是由於酶催化反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)致固定化酶分子內(nèi)部形成帶電荷微環(huán)境。產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)固定化酶的最適pH的影響，一般來(lái)說(shuō)，產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適pH與游離酶相比升高；產(chǎn)物為鹼性時(shí)，固定化酶的最適pH與游離酶相比降低。這是由於酶經(jīng)固定化後產(chǎn)物的擴(kuò)散受到一定的限制所造成的。當(dāng)產(chǎn)物為酸性時(shí)，由於擴(kuò)散限制，使固定化酶所處微環(huán)境的pH與周圍環(huán)境相比較低，需提高周圍反應(yīng)液的pH值，才能使酶分子所處的催化微環(huán)境達(dá)到酶反應(yīng)的最適pH，因而，固定化酶的最適pH比游離酶的最適pH高一些；反之，產(chǎn)物為鹼性時(shí)，固定化酶的最適pH比游離酶的pH為低。（3）反應(yīng)的最適溫度固定化酶的最適反應(yīng)溫度多數(shù)較游離酶高，如色氨酸酶經(jīng)共價(jià)結(jié)合後最適溫度比固定前提高5～15℃，但也有不變甚至降低的。固定化酶的作用最適溫度會(huì)受固定化方法以及固定化載體的影響。（4）米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km反映了酶與底物的親和力。酶經(jīng)固定化後，酶蛋白分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化以及載體電荷的影響可導(dǎo)致底物和酶的親合力的變化。使用載體結(jié)合法制成的固定化酶Km有時(shí)變動(dòng)的原因，主要是由於載體與底物間的靜電相互作用的緣故。（5）最大反應(yīng)速度

固定化酶的最大反應(yīng)速度與游離酶大多數(shù)是相同的。有些酶的最大反應(yīng)速度會(huì)因固定化方法的不同而有所差異。4.5固定化活細(xì)胞利用胞內(nèi)酶製作固定化酶時(shí)，先要把細(xì)胞破碎，才能將裏面的酶提取出來(lái)，這就增加了工序和成本，且提取的酶往往不夠穩(wěn)定。因此人們?cè)O(shè)想直接固定那些含有所需胞內(nèi)酶的細(xì)胞，並且就用這樣的細(xì)胞來(lái)催化化學(xué)反應(yīng)。20世紀(jì)70年代，在固定化酶的基礎(chǔ)上科學(xué)家們研製成固定化細(xì)胞（ImmobilizedCell），並且用於生產(chǎn)。70年代末，法國(guó)研究成功固定化細(xì)胞生產(chǎn)啤酒，80年代初我國(guó)居乃琥等用固定化細(xì)胞批量生產(chǎn)啤酒和酒精取得重要研究成果。固定化細(xì)胞按其生理狀態(tài)又可分為固定化死細(xì)胞和活細(xì)胞兩大類。最初固定化的細(xì)胞是死細(xì)胞或靜止態(tài)細(xì)胞，只利用其酶活性，近年來(lái)發(fā)展到固定化活細(xì)胞。前者經(jīng)固定化後，雖然整個(gè)細(xì)胞活力消失，但是，需要利用的“目的酶”仍保持催化活力；而後者經(jīng)固定化後，細(xì)胞仍保存活性，能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，所以稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。例如，瓊脂包埋的酵母細(xì)胞數(shù)初時(shí)為106個(gè)/m3，在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基裏培養(yǎng)兩天後，細(xì)胞數(shù)可達(dá)109～1010個(gè)/m3。與酶的固定化相比，固定化細(xì)胞保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，有效地利用游離細(xì)胞完整的酶系統(tǒng)和細(xì)胞膜的選擇通透性，既具有固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，又具有其自身的優(yōu)越性：①無(wú)需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時(shí)大大降低了成本；②可進(jìn)行多酶反應(yīng)，且不需添加輔助因數(shù)，固定化細(xì)胞不僅可以作為單一的酶發(fā)揮作用，而且可以利用菌體中所含的複合酶系完成一系列的催化反應(yīng)，對(duì)於這種多酶系統(tǒng)，輔助因數(shù)再生容易；固定化細(xì)胞的優(yōu)越性③對(duì)於活細(xì)胞來(lái)說(shuō)，保持了酶的原始狀態(tài)，酶的穩(wěn)定性更高，對(duì)污染的抵抗力更強(qiáng)；④細(xì)胞生長(zhǎng)停滯時(shí)間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快等等。正是由於固定化細(xì)胞的這些無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，儘管其出現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚於固定化酶，但其應(yīng)用範(fàn)圍比固定化酶更為廣泛。固定化細(xì)胞的優(yōu)越性當(dāng)然，固定化細(xì)胞也有其自身的缺點(diǎn)，如：必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度；必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)目的酶的分解；胞內(nèi)多酶的存在，會(huì)形成副產(chǎn)物；載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會(huì)造成底物滲透與擴(kuò)散的障礙等。固定化酶和固定化細(xì)胞都是以酶的應(yīng)用為目的，其製備方法也基本相同。固定化活細(xì)胞的製備條件比固定化酶更要溫和，其製備方法主要有物理吸附法和包埋法兩種。4.6酶催化反應(yīng)器及其類型以酶為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需要的設(shè)備稱之為酶催化反應(yīng)器，簡(jiǎn)稱酶反應(yīng)器。4.6.1酶反應(yīng)器的類型酶反應(yīng)器有兩種類型：一類是直接用游離酶進(jìn)行反應(yīng)，即均相酶反應(yīng)器；另一類是應(yīng)用固定化酶進(jìn)行的非均相酶反應(yīng)器。均相酶反應(yīng)能在批量式攪拌桶反應(yīng)器或超濾膜反應(yīng)器中進(jìn)行，而非均相酶反應(yīng)則可在多種反應(yīng)器中進(jìn)行，適用於連續(xù)催化反應(yīng)，包括：連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、連續(xù)攪拌桶-超濾和迴圈式反應(yīng)器等。4.6.2反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

這類反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，造價(jià)較低，傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)能迅速達(dá)到穩(wěn)態(tài)，主要應(yīng)用在飲料等食品工業(yè)中。其缺點(diǎn)是操作麻煩，在反復(fù)回收過(guò)程中固定化酶容易損失，所以工業(yè)規(guī)模的固定化酶很少採(cǎi)用。但是，常用於游離酶。圖4-2批量式攪拌桶反應(yīng)器4.6.2.1批量式攪拌桶反應(yīng)器這種反應(yīng)器在運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中，底物以恒定的流速流入反應(yīng)器，與此同時(shí)，反應(yīng)液則以同樣的流速流出反應(yīng)器。反應(yīng)桶內(nèi)裝有攪拌器，使反應(yīng)組分與固定化酶顆?；旌暇?，出口處有過(guò)濾膜，可使不斷補(bǔ)充新鮮底物與反應(yīng)液流量維持動(dòng)態(tài)平衡，如圖4-3。4.6.2.2連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器(ContinuousFlowStirredTandReactor，縮寫CSTR)圖4-3連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器在理想的連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器中，反應(yīng)液混合良好，各部位的成分相同，並與流出液的組成也一致。CSTR的開(kāi)放結(jié)構(gòu)使得調(diào)換固定化酶比較容易，而且有利於控制溫度和調(diào)節(jié)pH，還能夠處理膠態(tài)或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶採(cǎi)用CSTR有較高的轉(zhuǎn)化率。其缺點(diǎn)是，由攪拌產(chǎn)生的剪切力較大，易打碎磨損固定化酶顆粒。近來(lái)對(duì)此類型反應(yīng)器進(jìn)行了改良，就是將載有酶的圓片聚合物固定在攪拌軸上或者放置在與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動(dòng)的金屬網(wǎng)筐內(nèi)，這樣，既能保證反應(yīng)液攪拌均勻，同時(shí)又不致?lián)p壞固定化酶。4.6.2.3填充床反應(yīng)器(PackedBedReactor，縮寫PBR)圖4-4填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器又稱固定床反應(yīng)器（如圖4-4）?？商畛涠嘞虍愋园胪感灾锌绽w維製成管狀，內(nèi)部填充酶膜、酶片等。在填充床反應(yīng)器內(nèi)，底物在一定方向上以恒定的速度通過(guò)固定化酶柱。若柱的橫截面上每一點(diǎn)液體流動(dòng)的速度完全相同，則可以認(rèn)為反應(yīng)器是在理想條件下作為活塞式流動(dòng)反應(yīng)器（PlugFlowReactor，PFR）運(yùn)轉(zhuǎn)。由於流動(dòng)方向上存在速度和溫度梯度，在軸方向上存在底物的擴(kuò)散，所以實(shí)際上總是不可能完全符合理想化的條件。4.6.2.4

流化床反應(yīng)器(FluidzedBedReactor，縮寫為FBR)圖4-5流化床反應(yīng)器流化床型反應(yīng)器是—種裝有較小顆粒的垂直塔式反應(yīng)器。反應(yīng)時(shí)，底物溶液以足夠大的流速，從反應(yīng)器底部向上通過(guò)固定化酶柱床，便能使固定化酶顆粒始終處?kù)读骰癄顟B(tài)。其結(jié)構(gòu)如圖4-5。其流動(dòng)方式使反應(yīng)液的混合程度介於CSTR的全混型和PFR的平推流型之間。由於反應(yīng)器內(nèi)混合程度高，因此，傳熱、傳質(zhì)情況良好。4.6.2.5連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器(CSTR／UF)圖4-6連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器CSTR／UF結(jié)構(gòu)是CSTR與超濾裝置聯(lián)用的酶膜反應(yīng)器。在CSTR出口處設(shè)置一個(gè)超濾裝置，通過(guò)超濾裝置，酶可以迴圈使用。其結(jié)構(gòu)如圖5-6。該超濾器中的半透性超濾膜只允許小分子產(chǎn)物通過(guò)，不允許大分子酶和底物通過(guò)。因此，可以將小分子產(chǎn)物與大分子酶和底物分開(kāi)，有利於產(chǎn)物回收。該反應(yīng)器適用於顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。對(duì)這類反應(yīng)器在技術(shù)上的可行性已得到了證實(shí)，例如進(jìn)行纖維素的連續(xù)糖化、用α-澱粉酶水解澱粉、用轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖和用青黴素酶把青黴素G轉(zhuǎn)化成6-氨基青黴烷酸（6-APA）等生化過(guò)程。此外，還用於小分子產(chǎn)物（葡萄糖、麥芽糖）與大分子底物（澱粉、纖維素）的分離。4.6.2.6

迴圈反應(yīng)器（RecycleReactor，RCR）外迴圈反應(yīng)器內(nèi)迴圈反應(yīng)器

迴圈操作仍能為底物與酶提供足夠的接觸機(jī)會(huì)，以達(dá)到所需的轉(zhuǎn)化率。這種反應(yīng)器可用於難溶或者不溶性底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

4.6.3膜式反應(yīng)器膜式反應(yīng)器是20世紀(jì)70年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型反應(yīng)器，它是利用膜的分離功能，同時(shí)完成反應(yīng)和分離過(guò)程的一種反應(yīng)器。4.6.3.1膜式反應(yīng)器的類型根據(jù)酶的存在狀態(tài)、相數(shù)、膜組件型式、膜材料類型、耦合方式、傳質(zhì)推動(dòng)力等的不同，酶膜反應(yīng)器有不同的分類方式。根據(jù)膜組件的型式不同，可把酶膜反應(yīng)器分為板框式、螺旋卷式、管式和中空纖維式酶膜反應(yīng)器。以下以螺旋卷膜式反應(yīng)器和中空纖維膜式反應(yīng)器為例來(lái)說(shuō)明。（1）螺旋卷膜式反應(yīng)器此反應(yīng)器的螺旋結(jié)構(gòu)是將含酶的膜片與支持材料交替地纏繞在中心棒上。所用的膜片一般是膠原蛋白；而支持材料則是一種稱為凡克塞(vexar)的惰性聚合網(wǎng)狀物。後者可以將相鄰的兩層含酶膜片分開(kāi)來(lái)，以防止膜層相互重疊，堵塞流道。把上述螺旋元件裝進(jìn)圓筒，筒兩端加蓋板，並安裝進(jìn)出口管，這樣，就製成了螺旋卷膜式反應(yīng)器。含酶的膜是半透性膜，只允許小分子的底物和產(chǎn)物通過(guò)膜，而大分子酶則不能通過(guò)。該反應(yīng)器有許多優(yōu)點(diǎn)，例如，螺旋模型可將流體流動(dòng)的單元分隔成許多獨(dú)立空間，當(dāng)?shù)孜锶芤毫鹘?jīng)各個(gè)獨(dú)立空間，並與酶接觸時(shí)，均有相同的流體力學(xué)條件和停留時(shí)間，可改善接觸效果，消除短路；另外，網(wǎng)狀支持材料可以提高每一流動(dòng)間隔的混合效果，加快物質(zhì)傳遞。（2）中空纖維膜式反應(yīng)器這類反應(yīng)器是把酶結(jié)合於半透性的中空纖維上，中空纖維壁的內(nèi)外結(jié)構(gòu)一般是不同的。其內(nèi)層是緊密光滑的半透性膜，有一定的分子截留值，可以截留大分子物質(zhì)如酶，而允許小分子物質(zhì)通過(guò)。其外層是多孔海綿狀的支持層。將酶固定於中空纖維的支持層中，然後，將許多含酶的中空纖維集中成－束，裝進(jìn)圓筒內(nèi)，筒兩端封閉，並安裝進(jìn)出口管道，這樣便製成了中空纖維膜式反應(yīng)器。用這種固定化酶填充的反應(yīng)器可以提供較大的催化表面，其缺點(diǎn)是中空纖維的製造極為困難，難以保證纖維束內(nèi)流體流動(dòng)的均勻性，以及存在較大的物質(zhì)傳遞阻力等。4.6.3.2膜式反應(yīng)器的特點(diǎn)與一般反應(yīng)器相比，酶膜反應(yīng)器具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不受化學(xué)平衡轉(zhuǎn)化率的限制，這是酶膜反應(yīng)器最為