海水中痕量活性磷酸鹽的測(cè)定 流動(dòng)分析-磷鉬藍(lán)固相萃取-分光光度法

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海水中痕量活性磷酸鹽的測(cè)定

流動(dòng)分析-磷鉬藍(lán)固相萃取-分光光度法

1范圍

本文件規(guī)定了采用流動(dòng)分析-磷鉬藍(lán)固相萃取-分光光度法測(cè)定海水中痕量活性磷酸鹽的方法原理、

試劑與材料、儀器和設(shè)備、樣品采集與保存、分析步驟、結(jié)果計(jì)算與記錄、精密度和準(zhǔn)確度、質(zhì)量保證

和質(zhì)量控制的要求。

本文件適用于海水中nmol/L級(jí)別痕量活性磷酸鹽的測(cè)定。樣品富集體積為60mL時(shí)，本方法的檢

出限為6nmol/L，測(cè)定下限為10nmol/L。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T12763.4海洋調(diào)查規(guī)范第4部分：海水化學(xué)要素調(diào)查

GB17378.2海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第2部分：數(shù)據(jù)處理與分析質(zhì)量控制

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4方法原理

4.1流動(dòng)分析系統(tǒng)工作原理

樣品與試劑在蠕動(dòng)泵的推動(dòng)下進(jìn)入分析模塊，在密閉的管道中按設(shè)定的順序和比例進(jìn)行混合、反應(yīng)、

固相萃取、洗脫，洗脫液進(jìn)入分光光度檢測(cè)器測(cè)定吸光值，計(jì)算樣品中被測(cè)物質(zhì)的含量。

4.2化學(xué)反應(yīng)原理

在酸性條件下，海水樣品中的活性磷酸鹽在酒石酸銻鉀的催化下，與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬酸化合物，

進(jìn)而被抗壞血酸還原生成磷鉬藍(lán)化合物，該化合物富集在固相萃取小柱上，經(jīng)堿性溶液洗脫后，用分光

光度檢測(cè)器在710nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

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參考分析流路圖見(jiàn)圖1。

說(shuō)明：

P1——蠕動(dòng)泵1P2——蠕動(dòng)泵2C1——試劑混合盤(pán)管，1m

C2——反應(yīng)盤(pán)管，5.5mV1——六通閥V2——多位選擇閥

E——固相萃取小柱（見(jiàn)5.22）D——分光光度檢測(cè)器R1——鉬酸銨混合使用液（見(jiàn)5.11）

R2——抗壞血酸使用液（見(jiàn)5.13）R3——氯化鈉使用液（見(jiàn)5.15）R4——?dú)溲趸c使用液（見(jiàn)5.17）

R5——超純水S——樣品W——廢液

圖1流動(dòng)分析-磷鉬藍(lán)固相萃取-分光光度法測(cè)定痕量活性磷酸鹽的分析流路圖

5試劑與材料

除非另有說(shuō)明，在分析中均使用確認(rèn)為分析純的化學(xué)試劑，實(shí)驗(yàn)用水均為新制備的超純水（電阻率

大于等于18.0MΩ·cm）。

5.1硫酸（H2SO4）：ρ(H2SO4)=1.84g/mL。

5.2鉬酸銨（(NH4)6Mo7O24·4H2O）。

5.3酒石酸銻鉀（KSbOC4H4O6·1/2H2O）。

5.4抗壞血酸（C6H8O6）。

5.5氯化鈉（NaCl）。

5.6氫氧化鈉（NaOH）。

5.7鹽酸（HCl）：優(yōu)級(jí)純，ρ(HCl)=1.19g/mL。

5.8磷酸二氫鉀（KH2PO4）：優(yōu)級(jí)純，在110℃~115℃烘干并恒重后，保存在干燥器中。

5.9硫酸溶液（1+1）。配制方法為：在不斷攪拌下將150mL濃硫酸（見(jiàn)5.1）緩緩加入到150mL水

中。

5.10鉬酸銨混合貯備液。配制方法為：稱(chēng)取13g鉬酸銨（見(jiàn)5.2）溶于100mL水中；稱(chēng)取0.35g酒石

酸銻鉀（見(jiàn)5.3）溶于100mL水中。在不斷攪拌下，將鉬酸銨溶液緩緩加入到300mL硫酸溶液

（見(jiàn)5.9）中，再加入酒石酸銻鉀溶液，混合均勻。該溶液貯存于棕色玻璃瓶中，在4℃下避光保

存。溶液變混濁時(shí)，應(yīng)重配。

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5.11鉬酸銨混合使用液。配制方法為：量取36mL鉬酸銨混合貯備液（見(jiàn)5.10），用水稀釋至100mL，

盛于高密度聚乙烯瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.12抗壞血酸貯備液：c(C6H8O6)=100g/L。配制方法為：稱(chēng)取10g抗壞血酸（見(jiàn)5.4）溶于100mL水

中，貯存于棕色試劑瓶中，在4℃下避光保存，可穩(wěn)定1個(gè)月。

5.13抗壞血酸使用液：c(C6H8O6)=18g/L。配制方法為：量取18mL抗壞血酸貯備液（見(jiàn)5.12），用水

稀釋至100mL，盛于高密度聚乙烯瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.14氯化鈉貯備液：c(NaCl)=2mol/L。配制方法為：稱(chēng)取58.4g氯化鈉（見(jiàn)5.5）溶于500mL水中，

貯存于高密度聚乙烯瓶中，室溫下可保存6個(gè)月。

5.15氯化鈉使用液：c(NaCl)=0.2mol/L。配制方法為：量取10mL氯化鈉貯備液（見(jiàn)5.14），用水稀

釋至100mL，盛于高密度聚乙烯瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.16氫氧化鈉貯備液：c(NaOH)=10mol/L。配制方法為：稱(chēng)取40g氫氧化鈉（見(jiàn)5.6）溶于100mL

水中，貯存于高密度聚乙烯瓶中，室溫下可保存6個(gè)月。

5.17氫氧化鈉使用液：c(NaOH)=0.2mol/L。配制方法為：量取2mL氫氧化鈉貯備液（見(jiàn)5.16），用

水稀釋至100mL，盛于高密度聚乙烯瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.1810%（V/V）鹽酸溶液。配制方法為：量取139mL鹽酸（見(jiàn)5.7），用水稀釋至500mL，盛于高密

度聚乙烯瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.19磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)貯備液：c(KH2PO4)=8000μmol/L。配制方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0880g磷酸二氫鉀（見(jiàn)

5.8）溶于水中，并定容至1000mL，貯存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可穩(wěn)定6個(gè)月。

5.20磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間液：c(KH2PO4)=200μmol/L。配制方法為：準(zhǔn)確量取2.50mL磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)貯備液

（見(jiàn)5.19），用水稀釋并定容至100mL，盛于高密度聚乙烯瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.21磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液：c(KH2PO4)=10.0μmol/L。配制方法為：準(zhǔn)確量取5.00mL磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間液

（見(jiàn)5.20），用水稀釋并定容至100mL，盛于高密度聚乙烯瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.22固相萃取小柱。Oasis?HLB小柱1)：3cm3/60mg。

5.23蠕動(dòng)泵泵管。試劑泵管內(nèi)徑0.89mm，樣品泵管內(nèi)徑2.06mm。

5.24聚四氟乙烯管。流路管道和混合盤(pán)管內(nèi)徑0.75mm，進(jìn)樣管和反應(yīng)盤(pán)管內(nèi)徑1.5mm。

6儀器和設(shè)備

6.1商品化或?qū)嶒?yàn)室自制的流動(dòng)分析裝置，參見(jiàn)圖1，主要由下列各部分組成：

——蠕動(dòng)泵；

——多位選擇閥；

——六通閥；

——流動(dòng)分析用分光光度檢測(cè)器，配20mm流通池；

——數(shù)據(jù)處理及儀器控制軟件。

6.2分析天平：感量為0.0001g。

6.3普通天平：感量為0.01g。

1)Oasis?HLB小柱是由美國(guó)Waters公司提供的產(chǎn)品的商品名。給出這一信息是為了方便本文件的使用者，并不表

示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可使用這些等效產(chǎn)品。

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6.4一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的儀器和設(shè)備。

7樣品采集與保存

樣品采集與保存措施如下：

a）采樣前，應(yīng)依次用10%（V/V）鹽酸溶液（見(jiàn)5.18）、超純水清洗所有接觸樣品的器皿；

b）采樣過(guò)程注意防止污染，應(yīng)戴無(wú)營(yíng)養(yǎng)鹽污染的一次性手套，每采一次樣品應(yīng)更換手套；

c）先用樣品將高密度聚乙烯瓶潤(rùn)洗三次以上，再將樣品采集于瓶中；

d）采集的樣品一般無(wú)需過(guò)濾，如果必須過(guò)濾，要特別注意防止過(guò)濾過(guò)程中引入污染；

e）樣品采集后宜現(xiàn)場(chǎng)分析，若無(wú)法及時(shí)分析，可置于冰箱中冷藏或-20℃冷凍保存，冷藏不能超過(guò)

48h，冷凍不宜超過(guò)30d。

8分析步驟

8.1儀器調(diào)試

按照?qǐng)D1所示連接分析系統(tǒng)。開(kāi)機(jī)后，先用超純水代替試劑，檢查整個(gè)分析流路的密閉性及液體流

動(dòng)的通暢性，待基線穩(wěn)定后（約20min），將各管道的入口端置入對(duì)應(yīng)的試劑或樣品中。

8.2儀器運(yùn)行程序設(shè)定

按表1設(shè)定運(yùn)行程序和參數(shù)，分析流路參見(jiàn)圖1，具體步驟如下：

a）步驟1，在P1（蠕動(dòng)泵1）的推動(dòng)下，樣品和R1（鉬酸銨混合使用液）、R2（抗壞血酸使用液）

進(jìn)入管路，清洗并充滿(mǎn)反應(yīng)盤(pán)管；在P2（蠕動(dòng)泵2）的推動(dòng)下，R3（氯化鈉使用液）預(yù)淋洗固

相萃取小柱；

b）步驟2，在P2（蠕動(dòng)泵2）的推動(dòng)下，R4（氫氧化鈉使用液）洗脫已富集在柱上的前一個(gè)樣品

的反應(yīng)產(chǎn)物磷鉬藍(lán)，送往檢測(cè)器測(cè)定前一個(gè)樣品的吸光值，檢測(cè)波長(zhǎng)為710nm，流通池長(zhǎng)度為

20mm；

c）步驟3，在P2（蠕動(dòng)泵2）的推動(dòng)下，超純水清洗固相萃取小柱；

d）步驟4，在P1（蠕動(dòng)泵1）的推動(dòng)下，樣品和R1（鉬酸銨混合使用液）、R2（抗壞血酸使用液）

混合并反應(yīng)，生成的反應(yīng)產(chǎn)物磷鉬藍(lán)在固相萃取小柱上富集。

表1分析系統(tǒng)的運(yùn)行程序

蠕動(dòng)泵1流速a蠕動(dòng)泵2流速a六位閥多位選擇持續(xù)時(shí)間

步驟說(shuō)明

mL/minmL/min閥位閥閥位s

樣品和R1（鉬酸銨混合使用液）、

12.0（樣品）2.0（氯化鈉使R2（抗壞血酸使用液）清洗管路；

1虛線位140

2.2（試劑）用液）R3（氯化鈉使用液）預(yù)淋洗固相萃

取小柱

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表1分析系統(tǒng)的運(yùn)行程序（續(xù)）

蠕動(dòng)泵1流速a蠕動(dòng)泵2流速a六位閥多位選擇持續(xù)時(shí)間

步驟說(shuō)明

mL/minmL/min閥位閥閥位s

R4（氫氧化鈉使用液）洗脫固相萃

2.0（氫氧化鈉

20.0虛線位240取小柱上前一個(gè)樣品的反應(yīng)產(chǎn)物

使用液）

磷鉬藍(lán)，檢測(cè)器測(cè)定吸光值

30.02.0（超純水）虛線位340超純水清洗固相萃取小柱

樣品和R1（鉬酸銨混合使用液）、

7.5（樣品）480或R2（抗壞血酸使用液）混合并反

40.0實(shí)線位3

1.4（試劑）240b應(yīng)，生成的反應(yīng)產(chǎn)物磷鉬藍(lán)在固

相萃取小柱上富集

a流速為實(shí)測(cè)流速。

b選擇標(biāo)準(zhǔn)系列I繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，時(shí)間設(shè)置為480s；選擇標(biāo)準(zhǔn)系列II繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，時(shí)間設(shè)置為240

s。

8.3標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)系列I：分別量取0.00mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL和1.00mL的磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用

液（見(jiàn)5.21），用超純水稀釋并定容至100mL，制備6個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)系列?；钚粤姿猁}的濃度分別為：

0.0nmol/L、10.0nmol/L、25.0nmol/L、50.0nmol/L、75.0nmol/L和100.0nmol/L。

標(biāo)準(zhǔn)系列II：分別量取0.00mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL和3.00mL的磷酸

鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液（見(jiàn)5.21），用超純水稀釋并定容至100mL，制備7個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)系列?；钚粤姿猁}的

濃度分別為：0.0nmol/L、50.0nmol/L、100.0nmol/L、150.0nmol/L、200.0nmol/L、250.0nmol/L和300.0

nmol/L。

8.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)待測(cè)樣品濃度，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)系列（見(jiàn)8.3），依次從低濃度到高濃度取適量標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，

置于樣品瓶中，啟動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。以測(cè)定吸光值（峰高）為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的活性磷酸鹽濃度為橫

坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8.5樣品測(cè)定

取適量海水樣品，采用8.4相同的條件，進(jìn)行樣品的測(cè)定。

8.6空白試驗(yàn)

用超純水代替樣品，按照8.5樣品測(cè)定步驟進(jìn)行空白試驗(yàn)。

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9結(jié)果計(jì)算與記錄

對(duì)8.4繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合后，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程。樣品中活性磷酸鹽的濃度按照式

（1）進(jìn)行計(jì)算。測(cè)定分析記錄表見(jiàn)附錄A。

???

?=………………（1）

?

式中：

c——樣品中活性磷酸鹽的濃度，單位為納摩爾每升（nmol/L）；

y——測(cè)定的吸光值（峰高）；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程的截距；

a——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程的斜率。

計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后一位。

10精密度和準(zhǔn)確度

10.1精密度

7家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)活性磷酸鹽濃度為40.0nmol/L和150.0nmo/L的樣品進(jìn)行了測(cè)試（n=10~11），

測(cè)定平均值分別為39.6nmol/L~43.7nmol/L和144.2nmol/L~158.4nmol/L；重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.7nmol/L

和2.9nmol/L；重復(fù)性限分別為4.6nmol/L和8.1nmol/L；再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.1nmol/L和5.3nmol/L；

再現(xiàn)性限分別為6.0nmol/L和14.7nmol/L。

在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作者使用相同設(shè)備，按相同的測(cè)試方法，并在短時(shí)間內(nèi)對(duì)同一被測(cè)對(duì)象相

互獨(dú)立進(jìn)行測(cè)試獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值的算術(shù)平均值的20%，以大

于20%的情況不超過(guò)5%為前提。

在不同的實(shí)驗(yàn)室，由不同的操作者使用不同的設(shè)備，按相同的測(cè)試方法，對(duì)同一被測(cè)對(duì)象相互獨(dú)立

進(jìn)行測(cè)試獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值的算術(shù)平均值的20%，以大于20%

的情況不超過(guò)5%為前提。

10.2準(zhǔn)確度

取適量濃度為3.20μmol/L的活性磷酸鹽國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用超純水稀釋至160.0nmol/L作為樣

品，由7家實(shí)驗(yàn)室分別使用本方法進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果的相對(duì)偏差范圍為-3.4%~5.1%。7家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)濃

度為8.4nmol/L~20.6nmol/L的實(shí)際海水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定，加標(biāo)濃度為25.0nmol/L~30.0nmol/L，

回收率范圍為91.0%~107.3%。

11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

質(zhì)量保證和質(zhì)量控制應(yīng)按照GB17378.2和GB/T12763.4的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

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每批樣品或連續(xù)測(cè)定8h后應(yīng)測(cè)定一個(gè)方法空白樣、一組檢測(cè)樣品加標(biāo)樣、一組平行雙樣；有條件

的再測(cè)定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)樣品。方法空白樣以超純水替代樣品，測(cè)定步驟同樣品。測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合附

錄B的規(guī)定。

建議每分析10個(gè)樣品，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度溶液進(jìn)行校準(zhǔn)核查。如果測(cè)定值與理論值的相對(duì)誤差

在±10%之內(nèi)，說(shuō)明分析系統(tǒng)在可控范圍內(nèi)。如果相對(duì)誤差超過(guò)±10%，說(shuō)明分析系統(tǒng)失控，則應(yīng)檢查儀

器、試劑溶液是否正常，確定無(wú)疑后重新配制、測(cè)定、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，上一個(gè)合格檢查值之后測(cè)定的樣

品需重新測(cè)定，并依照新的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

12注意事項(xiàng)

本方法操作中應(yīng)注意如下事項(xiàng)：

——實(shí)驗(yàn)用超純水應(yīng)當(dāng)天制備，以避免空白過(guò)高；

——試劑和環(huán)境溫度會(huì)影響分析結(jié)果，冰箱內(nèi)貯存的試劑應(yīng)放置至室溫后再使用，分析過(guò)程中宜保

持室溫恒定，溫度波動(dòng)不宜過(guò)大；

——每批樣品分析均應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用新配制的試劑或標(biāo)準(zhǔn)系列溶液時(shí)，應(yīng)重新繪

制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

——建議每測(cè)定約100個(gè)樣品更換一次固相萃取小柱，并重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

——每批樣品測(cè)試前、測(cè)試后或測(cè)試過(guò)程中出現(xiàn)基線漂移、管路堵塞等情況時(shí)，可采用以下方式清

洗管路：移除固相萃取小柱，使用超純水清洗管路20min。

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附錄A

（規(guī)范性）

海水中痕量活性磷酸鹽的測(cè)定分析記錄

海水中痕量活性磷酸鹽的測(cè)定分析記錄見(jiàn)表A.1。

表A.1海水中痕量活性磷酸鹽的測(cè)定分析記錄表

（流動(dòng)分析-磷鉬藍(lán)固相萃取-分光光度法）

海區(qū)調(diào)查船采樣日期年月日

儀器型號(hào)分析日期年月日

吸光值（峰高）

樣品中活性磷酸鹽濃度

序號(hào)站號(hào)樣品編號(hào)備注

平行1平行2平均值nmol/L

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸擬合方程：y=ac+b

備注

（a=b=r=）

分析者：校對(duì)者：

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附錄B

（規(guī)范性）

海水中痕量活性磷酸鹽測(cè)定的質(zhì)量控制要求

海水中痕量活性磷酸鹽測(cè)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求見(jiàn)表B.1。

表B.1海水中痕量活性磷酸鹽測(cè)定的質(zhì)量控制要求