SARS相關(guān)冠狀病毒小鼠感染模型構(gòu)建及致病性的深度剖析

SARS相關(guān)冠狀病毒小鼠感染模型構(gòu)建及致病性的深度剖析一、引言1.1研究背景SARS相關(guān)冠狀病毒（SARS-relatedcoronavirus）作為一類具有高度致病性的病毒，曾在21世紀(jì)初引發(fā)嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SevereAcuteRespiratorySyndrome，SARS）的全球性爆發(fā)，給人類健康和社會經(jīng)濟(jì)帶來了沉重打擊。SARS疫情的爆發(fā)，在短短幾個月內(nèi)迅速蔓延至全球30多個國家和地區(qū)，累計(jì)感染人數(shù)超過8000人，死亡率高達(dá)約10%，引起了全球范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注和恐慌。雖然SARS疫情最終得到了有效控制，但SARS相關(guān)冠狀病毒的潛在威脅依然存在，對其進(jìn)行深入研究具有至關(guān)重要的意義。在病毒學(xué)研究領(lǐng)域，動物模型是不可或缺的工具，對于深入探究SARS相關(guān)冠狀病毒的致病機(jī)制、傳播途徑、宿主免疫反應(yīng)以及評估疫苗和藥物的有效性等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過建立合適的動物模型，研究人員能夠在可控的實(shí)驗(yàn)條件下模擬病毒感染過程，觀察病毒與宿主之間的相互作用，從而揭示病毒的致病機(jī)理，為開發(fā)有效的防控策略提供理論依據(jù)。小鼠作為一種常用的實(shí)驗(yàn)動物，具有繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、遺傳背景清晰等諸多優(yōu)點(diǎn)，在病毒感染模型的構(gòu)建中被廣泛應(yīng)用。然而，由于小鼠與人類在生理結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)等方面存在一定差異，野生型小鼠對SARS相關(guān)冠狀病毒通常不易感，這給小鼠感染模型的構(gòu)建帶來了挑戰(zhàn)。因此，如何構(gòu)建有效的SARS相關(guān)冠狀病毒小鼠感染模型，使其能夠準(zhǔn)確模擬人類感染的病理過程和免疫反應(yīng)，成為了本研究的關(guān)鍵問題。1.2研究目的與意義本研究旨在構(gòu)建一種高效、穩(wěn)定的SARS相關(guān)冠狀病毒小鼠感染模型，深入研究該病毒在小鼠體內(nèi)的致病性，包括病毒感染后的病理變化、免疫反應(yīng)以及病毒的傳播特性等。通過該模型，進(jìn)一步探究SARS相關(guān)冠狀病毒的致病機(jī)制，為理解病毒與宿主之間的相互作用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體來說，本研究期望達(dá)到以下目的：一是通過對小鼠進(jìn)行基因編輯或采用特定的病毒株，建立能夠穩(wěn)定感染SARS相關(guān)冠狀病毒的小鼠模型，模擬人類感染的病理過程；二是利用建立的小鼠感染模型，系統(tǒng)研究SARS相關(guān)冠狀病毒在小鼠體內(nèi)的致病性，包括病毒的組織嗜性、病理損傷特征以及免疫反應(yīng)的動態(tài)變化；三是分析SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠后引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴、免疫細(xì)胞活化與功能變化等免疫病理機(jī)制，為開發(fā)有效的免疫治療策略提供理論基礎(chǔ)。構(gòu)建SARS相關(guān)冠狀病毒小鼠感染模型并研究其致病性具有重要的理論和實(shí)際意義。從理論層面來看，深入了解SARS相關(guān)冠狀病毒的致病機(jī)制是病毒學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。通過小鼠感染模型，研究人員可以在嚴(yán)格控制的實(shí)驗(yàn)條件下，對病毒的感染過程、致病機(jī)制以及宿主的免疫反應(yīng)進(jìn)行深入研究，揭示病毒與宿主之間相互作用的分子機(jī)制，填補(bǔ)目前在這一領(lǐng)域的理論空白，為病毒學(xué)的發(fā)展提供新的理論依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用方面，該研究對于傳染病的防控具有重要的指導(dǎo)意義。首先，小鼠感染模型可以作為評估疫苗和藥物有效性的重要工具。在疫苗研發(fā)過程中，利用小鼠感染模型可以快速評估疫苗的免疫原性和保護(hù)效果，篩選出具有潛力的疫苗候選株，加速疫苗的研發(fā)進(jìn)程。對于藥物研發(fā)，小鼠感染模型可以用于測試藥物的抗病毒活性、安全性和藥代動力學(xué)特性，為臨床前藥物研究提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，有助于開發(fā)出更加有效的抗病毒藥物。其次，通過研究SARS相關(guān)冠狀病毒的致病性，可以為疫情的防控策略提供科學(xué)依據(jù)。了解病毒的傳播途徑、致病特點(diǎn)以及高危人群的易感性，有助于制定針對性的防控措施，如隔離、疫苗接種策略以及公共衛(wèi)生干預(yù)措施等，提高疫情防控的效果，減少疾病的傳播和擴(kuò)散，保護(hù)公眾健康。此外，建立SARS相關(guān)冠狀病毒小鼠感染模型還可以為未來可能出現(xiàn)的類似疫情提供應(yīng)對預(yù)案，增強(qiáng)人類對新發(fā)傳染病的應(yīng)對能力。二、SARS相關(guān)冠狀病毒概述2.1病毒結(jié)構(gòu)與分類SARS相關(guān)冠狀病毒屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），是一類具有囊膜的正鏈單股RNA病毒，其遺傳物質(zhì)是所有RNA病毒中最大的。這類病毒的粒子形狀并不規(guī)則，多呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑約60-220nm。病毒粒子具有包膜結(jié)構(gòu)，這層包膜在病毒的感染過程中起著重要作用，它能夠幫助病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，同時也參與了病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合和融合過程。在病毒的包膜上，存在著三種重要的蛋白，分別是刺突糖蛋白（Spikeprotein，S蛋白）、膜蛋白（Membraneprotein，M蛋白）和包膜蛋白（Envelopeprotein，E蛋白）。其中，S蛋白尤為關(guān)鍵，它是病毒的主要抗原成分，也是病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的部位。S蛋白呈棒狀結(jié)構(gòu)，從病毒包膜表面向外突出，形如日冕，這也是冠狀病毒名稱的由來。S蛋白的結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜，包含多個功能域，其中受體結(jié)合域（Receptor-bindingdomain，RBD）能夠特異性地與宿主細(xì)胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。這種特異性的結(jié)合是病毒感染宿主的第一步，也是決定病毒宿主范圍和組織嗜性的關(guān)鍵因素。M蛋白是一種膜糖蛋白，它在病毒的出芽和包膜形成過程中發(fā)揮著重要作用，參與維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。E蛋白則相對較小，雖然其具體功能尚未完全明確，但研究表明它可能與病毒的組裝、釋放以及致病性等方面有關(guān)。此外，病毒粒子內(nèi)部還包含核衣殼蛋白（Nucleocapsidprotein，N蛋白）和病毒的遺傳物質(zhì)RNA。N蛋白與病毒RNA緊密結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，對病毒RNA起到保護(hù)作用，確保其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。在分類學(xué)上，冠狀病毒科又分為冠狀病毒亞科（Coronavirinae）和環(huán)曲病毒亞科（Torovirinae）。我們通常所說的冠狀病毒指的是冠狀病毒亞科成員。冠狀病毒亞科進(jìn)一步分為α、β、γ和δ四個屬，其中α和β屬主要感染哺乳動物，包括人類，而γ和δ屬多感染禽類。SARS相關(guān)冠狀病毒屬于β屬冠狀病毒，在β屬冠狀病毒中，又可細(xì)分為多個亞型，SARS相關(guān)冠狀病毒屬于其中的Sarbecovirus亞型，且該亞型下包含多種病毒，如引發(fā)2003年非典疫情的SARS冠狀病毒（SARS-CoV）以及與新冠疫情相關(guān)的SARS-CoV-2等。這些病毒在基因序列、蛋白結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)特性等方面存在一定的相似性和差異性，對它們的深入研究有助于我們更好地理解冠狀病毒的進(jìn)化、傳播和致病機(jī)制。2.2病毒傳播與致病機(jī)制SARS相關(guān)冠狀病毒的傳播途徑主要包括近距離呼吸道飛沫傳播、密切接觸傳播以及氣溶膠傳播等。在近距離呼吸道飛沫傳播方面，當(dāng)感染者咳嗽、打噴嚏或說話時，會產(chǎn)生含有病毒的飛沫，這些飛沫可以在空氣中短距離傳播，被周圍的人吸入后，就有可能導(dǎo)致感染。密切接觸傳播則是指與感染者直接接觸，如觸摸感染者的口鼻分泌物，或者間接接觸被病毒污染的物品，如毛巾、衣物、餐具等，然后再觸摸自己的口鼻眼等部位，從而使病毒進(jìn)入體內(nèi)。氣溶膠傳播是指病毒在空氣中形成氣溶膠，這些氣溶膠可以在空氣中長時間懸浮，并隨著空氣流動傳播，當(dāng)健康人吸入含有病毒的氣溶膠時，就可能被感染。研究表明，在一些通風(fēng)不良、人員密集的場所，如醫(yī)院病房、公共交通工具等，氣溶膠傳播的風(fēng)險相對較高。病毒感染人體的過程是一個復(fù)雜的分子機(jī)制。首先，病毒表面的S蛋白與宿主細(xì)胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）特異性結(jié)合。這種結(jié)合是高度特異性的，ACE2在人體的呼吸道、胃腸道、心血管系統(tǒng)等多個組織和器官的細(xì)胞表面廣泛表達(dá)，這也解釋了SARS相關(guān)冠狀病毒為何能夠感染多個器官系統(tǒng)。S蛋白的受體結(jié)合域（RBD）與ACE2的結(jié)合，就像一把鑰匙插入對應(yīng)的鎖孔，開啟了病毒進(jìn)入細(xì)胞的大門。一旦結(jié)合成功，病毒包膜與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合，病毒的遺傳物質(zhì)RNA被釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞后，病毒利用宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)進(jìn)行自身的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。病毒的RNA首先被翻譯成多聚蛋白，這些多聚蛋白會被病毒自身編碼的蛋白酶切割成多個具有功能的非結(jié)構(gòu)蛋白，如RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）等。RdRp在病毒的復(fù)制過程中起著核心作用，它以病毒RNA為模板，合成大量的子代病毒RNA。同時，病毒還會利用宿主細(xì)胞的核糖體合成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，如S蛋白、M蛋白、N蛋白等。這些結(jié)構(gòu)蛋白和子代病毒RNA在宿主細(xì)胞內(nèi)組裝成新的病毒粒子，然后通過出芽的方式釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染周圍的細(xì)胞。在病毒感染人體后，會引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)，這也是導(dǎo)致疾病發(fā)生的重要因素。當(dāng)免疫系統(tǒng)識別到病毒入侵時，會啟動先天性免疫反應(yīng)。先天性免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，會吞噬病毒并釋放細(xì)胞因子和趨化因子，招募其他免疫細(xì)胞到感染部位。然而，在一些嚴(yán)重感染的病例中，過度的免疫反應(yīng)會導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生。細(xì)胞因子風(fēng)暴是指機(jī)體免疫系統(tǒng)過度激活，大量釋放細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等。這些細(xì)胞因子會引起全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺水腫、呼吸衰竭等嚴(yán)重的病理變化，是SARS患者病情惡化和死亡的重要原因之一。隨著感染的持續(xù)，適應(yīng)性免疫反應(yīng)也會逐漸啟動。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞被激活，T淋巴細(xì)胞可以直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞，或者輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體可以中和病毒，阻止病毒進(jìn)一步感染細(xì)胞。然而，在某些情況下，病毒可能會通過變異等方式逃避免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，導(dǎo)致感染的持續(xù)和病情的反復(fù)。三、小鼠感染模型構(gòu)建策略3.1直接感染近交系小鼠3.1.1實(shí)驗(yàn)小鼠選擇在構(gòu)建SARS相關(guān)冠狀病毒小鼠感染模型時，近交系小鼠是常用的實(shí)驗(yàn)動物，其中BALB/c和C57BL/6小鼠尤為典型。BALB/c小鼠是一種白色、免疫反應(yīng)較為敏感的近交系小鼠。其免疫系統(tǒng)對病原體的刺激反應(yīng)強(qiáng)烈，在感染SARS相關(guān)冠狀病毒后，能夠產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答。例如，研究表明，BALB/c小鼠感染病毒后，體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞會迅速活化，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和抗體。這使得研究人員能夠較為容易地觀察和檢測到病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)變化，為研究病毒與免疫系統(tǒng)的相互作用提供了便利。此外，BALB/c小鼠的繁殖性能良好，產(chǎn)仔數(shù)量較多，飼養(yǎng)成本相對較低，這使得在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)中能夠提供充足的實(shí)驗(yàn)樣本。C57BL/6小鼠則是一種黑色的近交系小鼠，其遺傳背景穩(wěn)定，在免疫學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等多個領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。在SARS相關(guān)冠狀病毒感染研究中，C57BL/6小鼠具有獨(dú)特的優(yōu)勢。它對多種病原體的感染表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的反應(yīng)，其體內(nèi)的免疫細(xì)胞亞群分布和功能具有一定的特征，這有助于研究人員深入探究病毒感染后的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。例如，C57BL/6小鼠感染病毒后，其肺部的炎癥反應(yīng)相對較為規(guī)律，便于觀察和分析病毒感染對肺部組織的損傷以及炎癥發(fā)展的過程。同時，由于C57BL/6小鼠在遺傳學(xué)研究方面的廣泛應(yīng)用，其基因數(shù)據(jù)庫較為完善，這為從基因?qū)用嫜芯坎《靖腥緳C(jī)制提供了有力的支持。選擇這兩種近交系小鼠進(jìn)行SARS相關(guān)冠狀病毒感染實(shí)驗(yàn)，還考慮到它們在以往的病毒感染研究中積累了豐富的研究數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。研究人員對它們的生理特性、免疫反應(yīng)特點(diǎn)以及對各種實(shí)驗(yàn)處理的耐受性等方面都有較為深入的了解，這使得在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析時能夠更好地進(jìn)行把控和解釋。此外，它們的體型適中，便于進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作，如病毒接種、血液采集、組織取樣等。然而，野生型的BALB/c和C57BL/6小鼠對SARS相關(guān)冠狀病毒的天然易感性較低，這就需要通過一些特殊的實(shí)驗(yàn)手段來提高它們對病毒的敏感性，從而建立有效的感染模型。3.1.2感染方法與過程在直接感染近交系小鼠的實(shí)驗(yàn)中，鼻腔接種是一種常用的病毒接種方式。鼻腔接種能夠使病毒直接接觸小鼠的呼吸道黏膜，模擬病毒在自然感染過程中通過呼吸道傳播的途徑。具體操作時，首先需要將SARS相關(guān)冠狀病毒制備成合適濃度的病毒懸液。病毒懸液的濃度需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮颓捌陬A(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行精確調(diào)整，一般來說，常用的病毒滴度范圍在10^4-10^6PFU（空斑形成單位）/mL之間。在接種前，需要將小鼠進(jìn)行適當(dāng)?shù)穆樽?，以確保接種過程的順利進(jìn)行和小鼠的安全。常用的麻醉方法包括腹腔注射戊巴比妥鈉或異氟烷吸入麻醉等。麻醉后的小鼠被放置在一個特制的操作臺上，頭部固定，使其鼻孔朝上。然后，使用微量移液器吸取適量的病毒懸液，一般每側(cè)鼻孔接種的體積為5-20μL。將移液器的tip輕輕靠近小鼠的鼻孔，緩慢將病毒懸液滴入鼻孔內(nèi)。在滴入過程中，需要注意控制滴速，避免病毒懸液過快進(jìn)入鼻腔導(dǎo)致小鼠嗆咳或病毒懸液流出鼻腔。滴入完成后，輕輕按摩小鼠的鼻部，以促進(jìn)病毒懸液在鼻腔內(nèi)的擴(kuò)散。接種時間也是實(shí)驗(yàn)中的一個重要因素。一般在接種后的不同時間點(diǎn)，如1天、3天、5天、7天等，對小鼠進(jìn)行觀察和檢測。觀察內(nèi)容包括小鼠的臨床癥狀，如精神狀態(tài)、活動能力、飲食情況、體重變化等。同時，在不同時間點(diǎn)采集小鼠的血液、鼻腔洗液、肺組織等樣本，用于檢測病毒載量、免疫指標(biāo)和病理變化等。例如，通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測血液和組織樣本中的病毒核酸含量，了解病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制情況；通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法檢測血清中的細(xì)胞因子水平，分析病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)；對肺組織進(jìn)行病理切片和染色，觀察肺部的病理損傷特征。3.1.3模型特點(diǎn)與局限性這種直接感染近交系小鼠的模型在病毒復(fù)制和致病表現(xiàn)上具有一定的特點(diǎn)。在病毒復(fù)制方面，感染初期，病毒能夠在小鼠的鼻腔和呼吸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)迅速復(fù)制。隨著感染時間的延長，病毒載量在肺部等組織中逐漸升高，引發(fā)肺部的炎癥反應(yīng)。在致病表現(xiàn)上，感染小鼠會出現(xiàn)一系列類似于人類感染SARS相關(guān)冠狀病毒后的癥狀，如體重減輕、精神萎靡、呼吸急促等。病理檢查可見肺部出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，表現(xiàn)為肺泡間隔增寬、炎性細(xì)胞浸潤、肺泡腔內(nèi)滲出等病理變化。然而，該模型也存在一些局限性，在模擬人類感染方面存在一定的不足。由于小鼠與人類在生理結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)上存在差異，小鼠感染后的癥狀和病理變化與人類感染仍有一定的差距。例如，人類感染SARS相關(guān)冠狀病毒后，除了呼吸系統(tǒng)癥狀外，還可能出現(xiàn)消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多系統(tǒng)的癥狀，而小鼠感染模型中這些系統(tǒng)的癥狀相對不明顯。此外，小鼠的免疫系統(tǒng)對病毒的反應(yīng)速度和強(qiáng)度與人類也有所不同，這可能導(dǎo)致在研究病毒與免疫系統(tǒng)相互作用時，結(jié)果不能完全準(zhǔn)確地反映人類的情況。野生型近交系小鼠對SARS相關(guān)冠狀病毒的易感性相對較低，需要較高滴度的病毒才能成功感染，這與人類自然感染的情況也存在差異。在實(shí)際應(yīng)用中，需要綜合考慮這些局限性，結(jié)合其他研究方法和模型，以更全面、準(zhǔn)確地研究SARS相關(guān)冠狀病毒的致病機(jī)制和防控策略。3.2基因編輯小鼠技術(shù)3.2.1hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建構(gòu)建hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的核心原理是利用基因工程技術(shù)，將人ACE2基因?qū)胄∈蠡蚪M中，使其在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)人源的ACE2蛋白。由于小鼠自身的ACE2蛋白與SARS相關(guān)冠狀病毒的結(jié)合能力較弱，而人ACE2蛋白能夠與病毒表面的S蛋白特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞。通過將人ACE2基因轉(zhuǎn)入小鼠，使得小鼠細(xì)胞表面能夠表達(dá)具有病毒結(jié)合活性的ACE2蛋白，進(jìn)而增加小鼠對SARS相關(guān)冠狀病毒的易感性。在構(gòu)建過程中，常用的方法是將人ACE2基因與特定的啟動子連接，然后通過顯微注射技術(shù)將重組基因?qū)胄∈笫芫训脑酥?。啟動子在基因表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，不同的啟動子具有不同的組織特異性和表達(dá)強(qiáng)度。例如，細(xì)胞角蛋白18（K18）啟動子是一種上皮細(xì)胞特異性啟動子。將人ACE2基因置于K18啟動子的控制下，能夠使hACE2在小鼠的上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)。由于呼吸道上皮細(xì)胞是SARS相關(guān)冠狀病毒感染的主要靶細(xì)胞之一，K18啟動子驅(qū)動的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在呼吸道上皮細(xì)胞高效表達(dá)hACE2，從而模擬病毒在人體呼吸道的感染過程。研究表明，K18-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠感染SARS相關(guān)冠狀病毒后，病毒能夠在呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，引起明顯的呼吸道癥狀和病理變化。CAG啟動子則是一種廣泛表達(dá)的啟動子，它由巨細(xì)胞病毒（CMV）早期增強(qiáng)子、雞β-肌動蛋白啟動子和兔β-珠蛋白polyA信號序列組成。使用CAG啟動子驅(qū)動人ACE2基因表達(dá)，能夠使hACE2在小鼠的多種組織和器官中廣泛表達(dá)。這種廣泛表達(dá)的特性使得研究人員可以觀察病毒在多個組織和器官中的感染和致病情況，全面了解病毒的組織嗜性和全身致病性。在CAG-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠感染實(shí)驗(yàn)中，不僅在呼吸道，在肝臟、腎臟、心臟等器官中也檢測到了病毒的復(fù)制和感染，為研究病毒感染引起的多器官損傷提供了有力的模型。小鼠ACE2基因啟動子也是常用的啟動子之一。它能夠驅(qū)動人ACE2基因在小鼠原本表達(dá)ACE2的細(xì)胞和組織中表達(dá)，保持了ACE2表達(dá)的天然模式。與其他啟動子相比，使用小鼠ACE2基因啟動子構(gòu)建的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠，其hACE2的表達(dá)更接近小鼠自身ACE2的表達(dá)情況，這有助于研究病毒感染過程中，人源ACE2在小鼠體內(nèi)正常生理環(huán)境下的作用機(jī)制。利用該啟動子構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠，在研究病毒與宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制時，能夠提供更真實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.2.2其他基因修飾策略除了構(gòu)建hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠外，敲除或修飾其他相關(guān)基因也可以影響小鼠對SARS相關(guān)冠狀病毒的感染易感性和致病性。例如，敲除小鼠體內(nèi)的某些免疫相關(guān)基因，可能會改變小鼠的免疫反應(yīng)，從而影響病毒的感染和致病過程。研究發(fā)現(xiàn)，敲除Toll樣受體3（TLR3）基因的小鼠，對SARS相關(guān)冠狀病毒的易感性明顯增加。TLR3是一種重要的模式識別受體，能夠識別病毒雙鏈RNA，激活先天性免疫反應(yīng)。當(dāng)TLR3基因被敲除后，小鼠的先天性免疫反應(yīng)受到抑制，無法及時有效地識別和清除病毒，導(dǎo)致病毒在小鼠體內(nèi)大量復(fù)制，病情加重。這表明TLR3在小鼠抵抗SARS相關(guān)冠狀病毒感染中發(fā)揮著重要作用，敲除該基因可以作為一種研究病毒感染與免疫逃逸機(jī)制的策略。對小鼠的細(xì)胞因子基因進(jìn)行修飾也具有重要意義。細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。通過基因編輯技術(shù)，上調(diào)或下調(diào)某些細(xì)胞因子的表達(dá)，能夠改變小鼠體內(nèi)的免疫微環(huán)境，影響病毒的感染和致病進(jìn)程。有研究嘗試下調(diào)小鼠體內(nèi)白細(xì)胞介素6（IL-6）的表達(dá)。在SARS相關(guān)冠狀病毒感染過程中，IL-6的過度表達(dá)會引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和組織損傷。下調(diào)IL-6表達(dá)后，小鼠感染病毒后的炎癥反應(yīng)明顯減輕，肺部病理損傷也有所改善。這說明通過修飾細(xì)胞因子基因，可以調(diào)節(jié)小鼠的免疫反應(yīng)，減輕病毒感染引起的病理損傷，為研究病毒感染的免疫病理機(jī)制和開發(fā)免疫治療策略提供了新的思路。3.2.3基因編輯模型優(yōu)勢基因編輯小鼠模型在研究病毒與宿主相互作用方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。從遺傳背景的角度來看，基因編輯小鼠的遺傳背景明確且可控。研究人員可以精確地對小鼠的特定基因進(jìn)行編輯，使其表達(dá)或缺失特定的基因產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的近交系小鼠直接感染模型相比，基因編輯小鼠模型能夠更準(zhǔn)確地模擬人類感染的遺傳背景。在hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠中，通過導(dǎo)入人源ACE2基因，使得小鼠在遺傳水平上具備了與人類相似的病毒受體，從而更真實(shí)地模擬了SARS相關(guān)冠狀病毒感染人類的過程。這種精確的遺傳模擬有助于研究人員深入探究病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合的分子機(jī)制，以及病毒感染后在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程?；蚓庉嬓∈竽Ｐ瓦€能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒感染和致病過程的精細(xì)調(diào)控。通過編輯不同的基因，研究人員可以分別研究各個基因在病毒感染過程中的作用。例如，在敲除免疫相關(guān)基因的小鼠模型中，可以觀察到免疫反應(yīng)的缺失對病毒感染和致病的影響；在修飾細(xì)胞因子基因的小鼠模型中，可以研究細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中的具體作用。這種對病毒感染和致病過程的精細(xì)調(diào)控，使得研究人員能夠從多個角度深入研究病毒與宿主的相互作用，揭示病毒感染的分子機(jī)制和免疫病理機(jī)制。基因編輯小鼠模型在研究病毒與宿主相互作用方面具有高度的特異性和可控性，能夠?yàn)樯钊肜斫釹ARS相關(guān)冠狀病毒的致病機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)工具，也為開發(fā)針對該病毒的防控策略和治療方法奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.3病毒適應(yīng)進(jìn)化3.3.1適應(yīng)進(jìn)化原理與方法病毒適應(yīng)進(jìn)化的核心原理是基于自然選擇和遺傳變異的理論。當(dāng)SARS相關(guān)冠狀病毒在小鼠體內(nèi)進(jìn)行連續(xù)傳代時，病毒面臨著小鼠體內(nèi)獨(dú)特的環(huán)境壓力，包括小鼠的免疫系統(tǒng)、細(xì)胞表面受體的差異以及細(xì)胞內(nèi)的代謝環(huán)境等。在這種選擇壓力下，病毒的基因組會發(fā)生隨機(jī)突變。這些突變可能導(dǎo)致病毒蛋白的氨基酸序列改變，進(jìn)而影響病毒的生物學(xué)特性，如病毒與小鼠細(xì)胞受體的結(jié)合能力、病毒的復(fù)制效率、免疫逃逸能力等。那些能夠更好地適應(yīng)小鼠宿主環(huán)境的突變病毒，具有更強(qiáng)的生存和繁殖優(yōu)勢，在連續(xù)傳代過程中逐漸被選擇和保留下來，從而使病毒逐漸適應(yīng)小鼠宿主。在具體操作過程中，首先需要獲取合適的SARS相關(guān)冠狀病毒臨床株或?qū)嶒?yàn)室保存株。將該病毒株通過鼻腔接種等方式感染小鼠。在感染后的特定時間點(diǎn)，如感染后3-5天，采集小鼠的肺組織、鼻腔分泌物等樣本。從這些樣本中提取病毒，進(jìn)行病毒的分離和培養(yǎng)，獲得子代病毒。然后，將子代病毒再次感染新的小鼠，重復(fù)上述過程，進(jìn)行多輪連續(xù)傳代。在傳代過程中，需要密切觀察小鼠的臨床癥狀，記錄小鼠的體重變化、精神狀態(tài)、呼吸頻率等指標(biāo)。同時，定期采集小鼠的組織樣本，檢測病毒載量和病毒的遺傳變異情況。通過分析不同傳代病毒的生物學(xué)特性和遺傳信息，篩選出在小鼠體內(nèi)適應(yīng)性良好、致病力較強(qiáng)的病毒株。3.3.2適應(yīng)毒株篩選與鑒定篩選致病性更強(qiáng)的適應(yīng)毒株需要綜合考慮多個因素。在臨床癥狀方面，選擇感染后能導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)明顯癥狀的病毒株。例如，那些使小鼠體重迅速下降，體重下降幅度超過15%-20%的病毒株，可能具有更強(qiáng)的致病性。小鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動明顯減少、呼吸急促甚至呼吸困難等癥狀，也表明病毒株對小鼠的影響較大。病毒載量也是一個重要的篩選指標(biāo)。通過實(shí)時熒光定量PCR等技術(shù)，檢測感染小鼠不同組織中的病毒核酸含量。選擇在肺組織、肝臟、脾臟等重要器官中病毒載量較高的病毒株。例如，在感染后第5天，肺組織中病毒載量達(dá)到10^6-10^7copies/g以上的病毒株，可能具有更強(qiáng)的復(fù)制能力和致病性。遺傳特征分析對于篩選適應(yīng)毒株也至關(guān)重要。對不同傳代病毒的基因組進(jìn)行測序，分析病毒基因組中的突變位點(diǎn)。關(guān)注那些與病毒受體結(jié)合、復(fù)制酶活性、免疫逃逸等功能相關(guān)基因的突變。如S蛋白基因中的突變可能影響病毒與小鼠細(xì)胞受體的結(jié)合能力，若突變導(dǎo)致病毒與小鼠細(xì)胞受體的親和力增強(qiáng)，則該病毒株可能更具致病性。鑒定適應(yīng)毒株的特征時，除了上述的遺傳特征分析外，還需要進(jìn)行病毒的生物學(xué)特性鑒定。包括測定病毒的感染滴度，通過空斑實(shí)驗(yàn)等方法確定病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的感染能力。研究病毒的宿主范圍，檢測適應(yīng)毒株是否能夠感染其他種類的小鼠或動物細(xì)胞，以了解其感染特異性的變化。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等方法，分析病毒蛋白的表達(dá)和修飾情況，進(jìn)一步了解病毒在適應(yīng)過程中的變化。3.3.3適應(yīng)進(jìn)化模型意義適應(yīng)進(jìn)化模型在研究病毒進(jìn)化和致病機(jī)制方面具有不可替代的重要意義。從病毒進(jìn)化的角度來看，該模型為研究病毒在新宿主環(huán)境中的進(jìn)化規(guī)律提供了直觀的實(shí)驗(yàn)體系。通過連續(xù)傳代觀察病毒的變異和進(jìn)化過程，研究人員可以深入了解病毒如何通過基因突變來適應(yīng)新的宿主，以及這些突變對病毒生物學(xué)特性的影響。這有助于預(yù)測病毒在自然界中的進(jìn)化方向，為預(yù)防病毒跨物種傳播和新疫情的爆發(fā)提供理論依據(jù)。例如，通過分析適應(yīng)毒株的突變特征，研究人員可以發(fā)現(xiàn)病毒在適應(yīng)小鼠宿主過程中哪些基因更容易發(fā)生突變，這些突變是否會增加病毒對其他物種的感染風(fēng)險等。在致病機(jī)制研究方面，適應(yīng)進(jìn)化模型能夠幫助研究人員更深入地探究病毒在小鼠體內(nèi)的致病過程。與野生型病毒感染相比，適應(yīng)毒株在小鼠體內(nèi)可能引發(fā)更明顯的病理變化和免疫反應(yīng)。通過對感染適應(yīng)毒株小鼠的病理切片分析、免疫細(xì)胞功能檢測等研究，可以揭示病毒感染導(dǎo)致組織損傷、免疫失衡的具體機(jī)制。這對于理解SARS相關(guān)冠狀病毒的致病機(jī)理，開發(fā)針對性的治療策略具有重要的指導(dǎo)作用。通過研究適應(yīng)毒株感染小鼠后引發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生機(jī)制和調(diào)控途徑，為開發(fā)抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴的藥物提供理論基礎(chǔ)。適應(yīng)進(jìn)化模型還可以用于評估疫苗和藥物對適應(yīng)毒株的有效性，為疫苗和藥物的研發(fā)提供更貼近實(shí)際感染情況的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｋ?、小鼠感染模型致病性研?.1臨床癥狀觀察4.1.1癥狀表現(xiàn)與時間進(jìn)程在SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠后，體重變化是一個重要的觀察指標(biāo)。感染初期，小鼠體重可能無明顯變化，但隨著感染的進(jìn)展，通常在感染后3-5天，部分小鼠開始出現(xiàn)體重下降的情況。以感染適應(yīng)毒株的BALB/c小鼠為例，在感染后第3天，體重平均下降約5%，到第5天，體重下降幅度可達(dá)10%-15%。這種體重下降主要是由于病毒感染導(dǎo)致小鼠食欲減退，能量攝入減少，同時病毒感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)也會增加機(jī)體的能量消耗。精神狀態(tài)的改變也是感染小鼠的典型癥狀之一。感染后，小鼠精神萎靡，活動明顯減少。原本活潑好動的小鼠，變得嗜睡，對周圍環(huán)境的刺激反應(yīng)遲鈍。在感染早期，小鼠可能只是活動頻率降低，如在飼養(yǎng)籠內(nèi)的走動次數(shù)減少，而到了感染后期，小鼠可能會長時間蜷縮在角落，幾乎不進(jìn)行自主活動。呼吸系統(tǒng)癥狀同樣顯著，許多感染小鼠會出現(xiàn)呼吸急促的癥狀。在感染后4-6天，呼吸頻率明顯加快，相較于正常小鼠每分鐘160-210次的呼吸頻率，感染小鼠的呼吸頻率可增加至每分鐘250-300次。部分病情嚴(yán)重的小鼠，還可能出現(xiàn)呼吸困難，表現(xiàn)為呼吸時腹部起伏明顯，甚至出現(xiàn)鼻翼煽動的情況。這是因?yàn)椴《靖腥緦?dǎo)致肺部炎癥，肺泡受損，氣體交換功能障礙，從而影響了呼吸系統(tǒng)的正常運(yùn)作。毛發(fā)狀態(tài)也會發(fā)生變化。感染小鼠的毛發(fā)變得粗糙、無光澤，且容易出現(xiàn)豎毛現(xiàn)象。正常小鼠的毛發(fā)順滑，而感染后的小鼠毛發(fā)雜亂，豎毛可能是由于病毒感染引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮，引起立毛肌收縮。4.1.2不同模型癥狀差異不同構(gòu)建策略的小鼠感染模型在臨床癥狀上存在明顯差異。在直接感染近交系小鼠模型中，由于野生型近交系小鼠對SARS相關(guān)冠狀病毒的易感性相對較低，即使感染成功，其癥狀相對較輕。體重下降幅度一般在感染后7-10天較為明顯，且下降幅度通常在10%以內(nèi)。精神狀態(tài)改變也相對不明顯，呼吸急促等癥狀出現(xiàn)的時間較晚，且程度較輕。這主要是因?yàn)樾∈笞陨淼拿庖呦到y(tǒng)能夠在一定程度上抵御病毒的感染，限制病毒的復(fù)制和傳播。基因編輯小鼠模型，如hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠，癥狀則較為嚴(yán)重。由于其細(xì)胞表面表達(dá)人源ACE2蛋白，增加了對病毒的易感性。感染后，體重下降迅速，在感染后2-3天就可能出現(xiàn)明顯的體重下降，下降幅度可達(dá)15%-20%。精神萎靡癥狀在感染后很快出現(xiàn)，呼吸急促等呼吸系統(tǒng)癥狀也更為明顯，且可能更早出現(xiàn)呼吸困難的癥狀。這是因?yàn)椴《灸軌蚋行У剡M(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制，引發(fā)更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)和組織損傷。病毒適應(yīng)進(jìn)化模型中，感染適應(yīng)毒株的小鼠癥狀介于上述兩者之間。體重下降在感染后4-5天較為明顯，下降幅度約為10%-15%。精神狀態(tài)和呼吸癥狀的表現(xiàn)也較為明顯，但相對于基因編輯小鼠模型，癥狀的嚴(yán)重程度稍輕。這是因?yàn)檫m應(yīng)毒株雖然在小鼠體內(nèi)具有更好的適應(yīng)性和致病性，但與基因編輯小鼠模型中病毒與人源ACE2的特異性結(jié)合相比，其感染機(jī)制和致病過程仍存在一定差異。4.2病理變化分析4.2.1肺部病理特征感染SARS相關(guān)冠狀病毒的小鼠肺部呈現(xiàn)出一系列顯著的病理變化。在光鏡下觀察，肺泡炎是最為常見的病理改變之一。肺泡間隔明顯增寬，這主要是由于炎性細(xì)胞浸潤以及間質(zhì)水腫所致。炎性細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等。巨噬細(xì)胞作為先天性免疫細(xì)胞，在病毒感染初期被激活，它們通過吞噬病毒和釋放細(xì)胞因子來啟動免疫反應(yīng)，但同時也會引發(fā)炎癥。淋巴細(xì)胞則參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞可殺傷被病毒感染的細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，然而在感染過程中，淋巴細(xì)胞的功能可能會受到抑制，導(dǎo)致免疫失衡。中性粒細(xì)胞的浸潤會釋放大量的炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。肺泡腔內(nèi)還可見滲出物，包括漿液、纖維蛋白和炎性細(xì)胞等。這些滲出物會影響肺泡的氣體交換功能，導(dǎo)致氧氣攝入不足和二氧化碳排出障礙。在嚴(yán)重的病例中，肺泡腔內(nèi)還可能出現(xiàn)透明膜形成。透明膜主要由纖維蛋白、壞死細(xì)胞碎片和炎性滲出物組成，它的形成會進(jìn)一步阻礙氣體交換，是導(dǎo)致呼吸衰竭的重要原因之一。隨著感染時間的延長，部分小鼠肺部可能出現(xiàn)肺纖維化的病理改變。肺纖維化是一種慢性的病理過程，表現(xiàn)為肺部纖維結(jié)締組織增生，正常的肺組織結(jié)構(gòu)被破壞。在感染后期，由于持續(xù)的炎癥刺激和組織損傷，成纖維細(xì)胞被激活，它們大量合成和分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致肺組織纖維化。肺纖維化會使肺部的彈性降低，通氣功能障礙，嚴(yán)重影響小鼠的呼吸功能。研究表明，在感染后10-14天，部分小鼠的肺部開始出現(xiàn)輕度的纖維化，表現(xiàn)為肺泡間隔內(nèi)少量纖維組織增生；而在感染后21天左右，纖維化程度可能進(jìn)一步加重，部分區(qū)域可見明顯的纖維條索形成。4.2.2其他器官受累情況除了肺部，SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠后，其他器官也會受到不同程度的影響。在肝臟中，部分小鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞變性，表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松，嚴(yán)重時可出現(xiàn)氣球樣變。這是由于病毒感染導(dǎo)致肝細(xì)胞代謝紊亂，細(xì)胞內(nèi)水分增多所致。部分肝細(xì)胞還可能出現(xiàn)壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮、碎裂或溶解。肝小葉結(jié)構(gòu)也可能遭到破壞，匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤。研究發(fā)現(xiàn)，在感染后5-7天，肝臟中的病毒載量達(dá)到高峰，此時肝細(xì)胞的損傷最為明顯。心臟也會出現(xiàn)一些病理表現(xiàn)。心肌細(xì)胞可能出現(xiàn)變性，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞腫脹、橫紋模糊。部分小鼠還可能出現(xiàn)心肌間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤。這些病理變化會影響心臟的正常功能，導(dǎo)致心肌收縮力下降，心輸出量減少。在感染嚴(yán)重的小鼠中，可能會出現(xiàn)心律失常等心臟功能異常的表現(xiàn)。在大腦中，病毒感染可導(dǎo)致神經(jīng)元變性和壞死。神經(jīng)元是大腦的基本功能單位，它們的損傷會影響大腦的正常功能。部分小鼠還會出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，膠質(zhì)細(xì)胞在大腦中起到支持和營養(yǎng)神經(jīng)元的作用，但在病毒感染時，膠質(zhì)細(xì)胞的增生可能是一種代償性反應(yīng)，也可能參與了炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。大腦的血管周圍可見炎性細(xì)胞浸潤，這可能會影響腦血管的正常功能，導(dǎo)致腦供血不足等問題。4.2.3病理變化與臨床癥狀關(guān)聯(lián)病理變化與臨床癥狀之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。小鼠肺部的病理變化是導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)癥狀的主要原因。肺泡炎和肺纖維化會導(dǎo)致肺部氣體交換功能障礙，使小鼠出現(xiàn)呼吸急促、呼吸困難等癥狀。隨著肺部炎癥的加重，肺泡腔內(nèi)滲出物增多，進(jìn)一步阻礙氣體交換，導(dǎo)致小鼠缺氧，從而表現(xiàn)出精神萎靡、活動減少等癥狀。肝臟的病理變化與小鼠的全身狀況密切相關(guān)。肝細(xì)胞變性和壞死會影響肝臟的代謝和解毒功能，導(dǎo)致體內(nèi)毒素堆積，影響小鼠的食欲和消化功能，進(jìn)而導(dǎo)致體重下降。心臟的病理變化會影響心臟的泵血功能，導(dǎo)致全身血液循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重小鼠的病情。大腦的病理變化則可能導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如行為異常、抽搐等。在感染后期，當(dāng)大腦中的神經(jīng)元損傷嚴(yán)重時，小鼠可能會出現(xiàn)昏迷等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。通過對病理變化與臨床癥狀的關(guān)聯(lián)研究，可以更深入地理解SARS相關(guān)冠狀病毒的致病機(jī)制，為開發(fā)有效的治療策略提供依據(jù)。4.3病毒載量檢測4.3.1檢測方法與原理在SARS相關(guān)冠狀病毒小鼠感染模型的研究中，實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）是檢測病毒載量的常用且關(guān)鍵的方法之一。其原理基于逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)。由于SARS相關(guān)冠狀病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，首先需要利用逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。逆轉(zhuǎn)錄過程中，以病毒RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以dNTP為原料，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成cDNA。隨后，針對病毒特定的基因片段設(shè)計(jì)引物和探針。引物是一段與病毒基因片段兩端序列互補(bǔ)的寡核苷酸，用于引導(dǎo)DNA聚合酶擴(kuò)增目標(biāo)基因片段。探針則是一段帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的寡核苷酸，它能夠特異性地與目標(biāo)基因片段雜交。在PCR擴(kuò)增過程中，DNA聚合酶以cDNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，不斷地將dNTP添加到引物的3'端，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因片段的指數(shù)級擴(kuò)增。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，探針會被DNA聚合酶降解，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而釋放出熒光信號。通過實(shí)時監(jiān)測熒光信號的強(qiáng)度變化，就可以實(shí)時反映PCR擴(kuò)增的進(jìn)程。在一定范圍內(nèi)，熒光信號的強(qiáng)度與起始模板（即病毒核酸）的量成正比，因此可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法對病毒載量進(jìn)行定量分析。病毒滴定也是一種重要的檢測方法，其中空斑實(shí)驗(yàn)是常用的病毒滴定技術(shù)。其原理是基于病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中形成空斑的特性。將稀釋后的病毒懸液接種到長滿單層細(xì)胞的培養(yǎng)板上，病毒會吸附并感染細(xì)胞。在病毒感染細(xì)胞后，會在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和增殖，導(dǎo)致被感染的細(xì)胞發(fā)生病變、死亡。隨后，在細(xì)胞培養(yǎng)物上覆蓋一層含有營養(yǎng)物質(zhì)和瓊脂的培養(yǎng)基，這樣可以限制病毒的擴(kuò)散，使得病毒只能感染相鄰的細(xì)胞。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，被病毒感染的細(xì)胞會逐漸死亡，形成肉眼可見的空斑。每個空斑被認(rèn)為是由一個病毒粒子感染并增殖形成的，因此通過計(jì)數(shù)空斑的數(shù)量，并結(jié)合病毒懸液的稀釋倍數(shù)，就可以計(jì)算出病毒的滴度，即單位體積病毒懸液中所含有的感染性病毒粒子的數(shù)量。例如，若在10^-6稀釋度的病毒懸液接種的培養(yǎng)板上，平均形成了50個空斑，那么該病毒懸液的滴度即為50×10^6PFU/mL。4.3.2不同組織病毒分布在小鼠感染SARS相關(guān)冠狀病毒后，病毒在不同組織中的分布呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)變化。在感染初期，病毒主要在呼吸道組織中復(fù)制和分布。以鼻腔和氣管為例，研究表明，在感染后1-2天，鼻腔和氣管中的病毒載量迅速升高。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，鼻腔組織中的病毒核酸拷貝數(shù)在感染后第1天可達(dá)10^4-10^5copies/g，氣管組織中的病毒載量也在同一時期達(dá)到較高水平。這是因?yàn)楹粑鲤つど掀ぜ?xì)胞是病毒入侵的首要靶細(xì)胞，病毒通過鼻腔接種后，能夠迅速與呼吸道上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞，從而在呼吸道組織中大量復(fù)制。隨著感染時間的延長，病毒逐漸擴(kuò)散到肺部組織。在感染后3-5天，肺部成為病毒載量最高的組織。在肺組織中，病毒主要感染肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。通過免疫組化和原位雜交技術(shù)可以觀察到，病毒抗原和核酸在肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中大量存在。此時，肺部的病毒載量可高達(dá)10^6-10^7copies/g。病毒在肺部的大量復(fù)制會引發(fā)嚴(yán)重的肺部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺泡炎、肺纖維化等病理變化，進(jìn)而影響肺部的正常功能，出現(xiàn)呼吸急促、呼吸困難等臨床癥狀。除了呼吸道組織，病毒在其他器官中也有一定程度的分布。在肝臟中，感染后5-7天可檢測到病毒的存在，病毒載量相對較低，一般在10^2-10^3copies/g。這可能是由于病毒通過血液循環(huán)到達(dá)肝臟，感染肝臟細(xì)胞。肝臟中的枯否細(xì)胞等免疫細(xì)胞也會對病毒感染做出反應(yīng)，參與免疫防御過程。在心臟組織中，感染后7-10天可檢測到少量病毒，病毒載量約為10^1-10^2copies/g。病毒感染心臟可能會影響心臟的正常功能，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、心律失常等問題。在大腦組織中，雖然病毒載量相對較低，但在感染后10-14天仍可檢測到病毒，這表明病毒可能通過血腦屏障進(jìn)入大腦，感染神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，從而引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。4.3.3病毒載量與致病性關(guān)聯(lián)病毒載量與小鼠的致病性之間存在著密切的相關(guān)性。一般來說，高病毒載量往往與嚴(yán)重的病理變化和臨床癥狀相關(guān)。在感染SARS相關(guān)冠狀病毒的小鼠中，當(dāng)肺部病毒載量較高時，肺部的病理損傷更為嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肺部病毒載量達(dá)到10^6-10^7copies/g以上時，小鼠肺部會出現(xiàn)廣泛的肺泡炎，肺泡間隔明顯增寬，炎性細(xì)胞大量浸潤，肺泡腔內(nèi)滲出物增多，甚至出現(xiàn)透明膜形成和肺纖維化等嚴(yán)重病理改變。這些病理變化會導(dǎo)致肺部氣體交換功能嚴(yán)重受損，小鼠出現(xiàn)呼吸急促、呼吸困難等癥狀，體重也會明顯下降，精神狀態(tài)變差。高病毒載量還可能引發(fā)過度的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫病理損傷。當(dāng)病毒在體內(nèi)大量復(fù)制時，免疫系統(tǒng)會被過度激活，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子。這些細(xì)胞因子和趨化因子會招募大量的免疫細(xì)胞到感染部位，引發(fā)炎癥反應(yīng)。然而，過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致組織損傷，甚至引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。細(xì)胞因子風(fēng)暴會進(jìn)一步加重病情，導(dǎo)致多器官功能衰竭，增加小鼠的死亡率。低病毒載量的小鼠，其病理變化和臨床癥狀相對較輕。當(dāng)病毒載量較低時，小鼠的免疫系統(tǒng)可能能夠有效地控制病毒的復(fù)制和傳播，肺部的炎癥反應(yīng)也相對較輕，病理損傷不明顯，小鼠的臨床癥狀也較為輕微，可能僅表現(xiàn)為短暫的體重下降和輕微的呼吸道癥狀。通過對病毒載量與致病性的關(guān)聯(lián)研究，可以更深入地了解SARS相關(guān)冠狀病毒的致病機(jī)制，為開發(fā)有效的治療策略提供重要的依據(jù)。4.4免疫反應(yīng)研究4.4.1先天性免疫應(yīng)答在SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠的過程中，先天性免疫應(yīng)答迅速啟動，成為抵御病毒入侵的第一道防線。巨噬細(xì)胞作為先天性免疫細(xì)胞的重要成員，在感染早期發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)病毒侵入小鼠體內(nèi)后，肺泡巨噬細(xì)胞會迅速識別病毒，并通過吞噬作用將病毒攝入細(xì)胞內(nèi)。巨噬細(xì)胞表面表達(dá)多種模式識別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）等，這些受體能夠識別病毒的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）。以TLR3為例，它能夠特異性地識別病毒的雙鏈RNA，激活下游的信號通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子和趨化因子。研究表明，在感染后1-2天，小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的TLR3表達(dá)水平顯著升高，同時伴隨著白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子的大量分泌。IL-1β可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化和募集，增強(qiáng)免疫反應(yīng)；TNF-α則具有直接的抗病毒作用，同時也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，清除被病毒感染的細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞（DCs）在先天性免疫應(yīng)答中也扮演著重要角色。DCs能夠攝取、加工和呈遞病毒抗原，激活T淋巴細(xì)胞，從而啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠后，肺組織中的DCs會被迅速激活，遷移到局部淋巴結(jié)。在遷移過程中，DCs會攝取病毒抗原，并將其加工成抗原肽段，與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，呈遞給T淋巴細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，感染后3-5天，小鼠肺組織中DCs的數(shù)量明顯增加，其表面的共刺激分子如CD80、CD86等表達(dá)上調(diào)，這表明DCs的功能被激活，能夠更有效地激活T淋巴細(xì)胞。DCs還能分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素12（IL-12）等，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）是先天性免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，它能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞。在SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠時，NK細(xì)胞的活性會增強(qiáng)。NK細(xì)胞通過識別被病毒感染細(xì)胞表面的異常分子，如應(yīng)激誘導(dǎo)的配體等，釋放穿孔素和顆粒酶，導(dǎo)致被感染細(xì)胞凋亡。研究表明，在感染后3-7天，小鼠脾臟和肺組織中的NK細(xì)胞數(shù)量增加，其殺傷活性也顯著增強(qiáng)。NK細(xì)胞還能分泌干擾素γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和DCs的功能，進(jìn)一步促進(jìn)免疫反應(yīng)。4.4.2適應(yīng)性免疫應(yīng)答隨著感染的持續(xù)，適應(yīng)性免疫應(yīng)答逐漸發(fā)揮主導(dǎo)作用。T淋巴細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中起著核心作用。在SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠后，CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞會被激活。CD4+T淋巴細(xì)胞，也稱為輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞），可以分化為不同的亞群，如Th1、Th2、Th17等。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-β等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)對病毒的清除。研究發(fā)現(xiàn)，在感染后7-10天，小鼠體內(nèi)Th1細(xì)胞的比例明顯增加，IFN-γ的分泌水平也顯著升高。Th2細(xì)胞則主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子主要參與體液免疫，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化和抗體的產(chǎn)生。Th17細(xì)胞分泌IL-17等細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)和免疫防御中也發(fā)揮著重要作用。CD8+T淋巴細(xì)胞，即細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），能夠特異性地殺傷被病毒感染的細(xì)胞。CTL通過識別被感染細(xì)胞表面的MHCI類分子與病毒抗原肽的復(fù)合物，釋放穿孔素和顆粒酶，導(dǎo)致被感染細(xì)胞凋亡。研究表明，在感染后10-14天，小鼠體內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，其殺傷活性也顯著增強(qiáng)。CD8+T淋巴細(xì)胞還能分泌細(xì)胞因子，如IFN-γ等，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)。B淋巴細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中主要負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗體。在SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠后，B淋巴細(xì)胞會被激活，分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體?？贵w可以通過多種方式發(fā)揮作用，如中和病毒，阻止病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合；調(diào)理作用，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對病毒的吞噬；激活補(bǔ)體系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)，在感染后10-14天，小鼠血清中開始檢測到特異性抗體，抗體水平隨著感染時間的延長而逐漸升高。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等方法可以檢測到小鼠血清中的IgM、IgG等抗體亞型。IgM是感染早期產(chǎn)生的抗體，其分子量較大，具有較高的親和力，能夠快速結(jié)合病毒，發(fā)揮免疫防御作用。IgG則是感染后期的主要抗體，其半衰期較長，能夠持續(xù)發(fā)揮免疫保護(hù)作用。4.4.3免疫反應(yīng)對致病性影響免疫反應(yīng)在SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠的過程中，既發(fā)揮著清除病毒的關(guān)鍵作用，又可能導(dǎo)致免疫病理損傷，這兩者之間的平衡對于小鼠的病情發(fā)展和預(yù)后至關(guān)重要。在病毒清除方面，先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答協(xié)同作用。先天性免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等在感染早期迅速啟動免疫反應(yīng)，通過吞噬病毒、殺傷被感染細(xì)胞以及分泌細(xì)胞因子等方式，限制病毒的復(fù)制和傳播。適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞則在感染后期發(fā)揮重要作用。T淋巴細(xì)胞能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可以中和病毒，從而有效地清除病毒。研究表明，在免疫功能正常的小鼠中，隨著免疫反應(yīng)的增強(qiáng)，病毒載量逐漸下降，小鼠的病情也逐漸好轉(zhuǎn)。然而，過度的免疫反應(yīng)也可能導(dǎo)致免疫病理損傷。在SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠時，可能會引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。細(xì)胞因子風(fēng)暴是指機(jī)體免疫系統(tǒng)過度激活，大量釋放細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α等。這些細(xì)胞因子會引起全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺水腫、呼吸衰竭等嚴(yán)重的病理變化。研究發(fā)現(xiàn)，在一些病情嚴(yán)重的小鼠中，體內(nèi)細(xì)胞因子水平顯著升高，出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞因子風(fēng)暴癥狀。細(xì)胞因子風(fēng)暴會進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷，甚至引發(fā)多器官功能衰竭，增加小鼠的死亡率。免疫反應(yīng)還可能導(dǎo)致自身免疫損傷。在免疫反應(yīng)過程中，免疫系統(tǒng)可能會錯誤地攻擊自身組織和器官，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。在SARS相關(guān)冠狀病毒感染小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)部分小鼠出現(xiàn)了自身抗體，這些自身抗體可能會與自身組織結(jié)合，引發(fā)自身免疫損傷。五、案例分析5.1案例一：某實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型5.1.1模型構(gòu)建細(xì)節(jié)在某實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型的過程中，采用了先進(jìn)的基因編輯技術(shù)。首先，研究人員通過基因克隆技術(shù)，從人類基因組文庫中獲取了全長的人ACE2基因。為了確保人ACE2基因能夠在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，研究人員對其進(jìn)行了精心的載體構(gòu)建。他們選用了pCAGGS載體，該載體包含了強(qiáng)啟動子CAG。CAG啟動子由巨細(xì)胞病毒（CMV）早期增強(qiáng)子、雞β-肌動蛋白啟動子和兔β-珠蛋白polyA信號序列組成，具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄激活能力，能夠驅(qū)動外源基因在多種組織和細(xì)胞中廣泛且高效地表達(dá)。將人ACE2基因插入到pCAGGS載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pCAGGS-hACE2。在受精卵的準(zhǔn)備階段，選用健康的C57BL/6小鼠作為供體。通過超數(shù)排卵技術(shù)，對雌性C57BL/6小鼠注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG），促進(jìn)其卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育和成熟。在hCG注射后的合適時間點(diǎn)，對小鼠進(jìn)行輸卵管取卵，獲取大量的受精卵。隨后，運(yùn)用顯微注射技術(shù)將重組表達(dá)載體pCAGGS-hACE2導(dǎo)入受精卵的原核中。這一過程需要極其精細(xì)的操作，研究人員借助高精度的顯微操作儀，將含有目的基因的載體溶液緩慢地注入受精卵的原核內(nèi)。注射后的受精卵經(jīng)過短暫的體外培養(yǎng)，篩選出狀態(tài)良好的胚胎。胚胎移植是模型構(gòu)建的關(guān)鍵步驟之一。將篩選后的胚胎移植到同步發(fā)情的假孕母鼠的輸卵管內(nèi)。假孕母鼠是通過與結(jié)扎輸精管的公鼠交配而獲得的，其生理狀態(tài)與正常受孕母鼠相似，但實(shí)際上并未受精。通過將轉(zhuǎn)基因胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)，為胚胎的發(fā)育提供了適宜的子宮環(huán)境。經(jīng)過一段時間的孕育，假孕母鼠分娩出子代小鼠。對子代小鼠進(jìn)行基因型鑒定是確保模型成功構(gòu)建的重要環(huán)節(jié)。研究人員采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，設(shè)計(jì)了針對人ACE2基因的特異性引物。通過提取子代小鼠的基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性條帶，則表明小鼠基因組中成功整合了人ACE2基因。為了進(jìn)一步確定人ACE2基因的表達(dá)情況，還運(yùn)用了實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)。RT-qPCR技術(shù)可以檢測小鼠組織中hACE2mRNA的表達(dá)水平，通過與內(nèi)參基因的比較，準(zhǔn)確地量化hACE2基因的轉(zhuǎn)錄情況。Westernblot技術(shù)則用于檢測hACE2蛋白的表達(dá)，通過將小鼠組織蛋白進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交等一系列操作，使用特異性的抗hACE2抗體來檢測目的蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)過嚴(yán)格的鑒定，篩選出了穩(wěn)定表達(dá)hACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。5.1.2致病性研究結(jié)果在對該hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行SARS相關(guān)冠狀病毒感染后的致病性研究中，觀察到了一系列顯著的結(jié)果。在臨床癥狀方面，感染后的小鼠體重迅速下降。在感染后的第3天，小鼠體重平均下降約10%，到第5天，體重下降幅度可達(dá)15%-20%。小鼠精神萎靡，活動明顯減少，大部分時間蜷縮在飼養(yǎng)籠的角落，對周圍環(huán)境的刺激反應(yīng)遲鈍。呼吸急促癥狀也較為明顯，呼吸頻率從正常的每分鐘160-210次增加到每分鐘250-300次，部分小鼠甚至出現(xiàn)呼吸困難，表現(xiàn)為呼吸時腹部起伏劇烈，鼻翼煽動。病理變化方面，肺部呈現(xiàn)出典型的間質(zhì)性肺炎特征。肺泡間隔明顯增寬，這是由于炎性細(xì)胞浸潤和間質(zhì)水腫所致。炎性細(xì)胞主要包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在感染早期被激活，它們吞噬病毒并釋放細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。淋巴細(xì)胞參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在感染過程中，其功能可能受到抑制，導(dǎo)致免疫失衡。中性粒細(xì)胞的浸潤會釋放大量的炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重炎癥。肺泡腔內(nèi)可見滲出物，包括漿液、纖維蛋白和炎性細(xì)胞等，這些滲出物會影響肺泡的氣體交換功能。在嚴(yán)重的病例中，肺泡腔內(nèi)還出現(xiàn)了透明膜形成，透明膜主要由纖維蛋白、壞死細(xì)胞碎片和炎性滲出物組成，它的形成會進(jìn)一步阻礙氣體交換，是導(dǎo)致呼吸衰竭的重要原因之一。在其他器官方面，肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞變性，表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤。心臟出現(xiàn)心肌細(xì)胞變性，心肌間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤，這可能會影響心臟的正常功能，導(dǎo)致心肌收縮力下降，心輸出量減少。病毒載量檢測結(jié)果顯示，在感染后的第1-2天，鼻腔和氣管中的病毒載量迅速升高，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測，鼻腔組織中的病毒核酸拷貝數(shù)在感染后第1天可達(dá)10^4-10^5copies/g，氣管組織中的病毒載量也在同一時期達(dá)到較高水平。隨著感染時間的延長，肺部成為病毒載量最高的組織，在感染后3-5天，肺部病毒載量可高達(dá)10^6-10^7copies/g。在肝臟、心臟等其他器官中也檢測到了一定量的病毒，但病毒載量相對較低。免疫反應(yīng)研究表明，在感染早期，先天性免疫應(yīng)答迅速啟動。巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體（TLRs）識別病毒的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），激活下游信號通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子。隨著感染的持續(xù)，適應(yīng)性免疫應(yīng)答逐漸發(fā)揮主導(dǎo)作用。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞被激活，T淋巴細(xì)胞分化為不同的亞群，如Th1、Th2、Th17等，它們分泌不同的細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)和病毒清除。B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體，如IgM和IgG。IgM在感染早期產(chǎn)生，能夠快速結(jié)合病毒，發(fā)揮免疫防御作用；IgG則在感染后期大量產(chǎn)生，持續(xù)發(fā)揮免疫保護(hù)作用。5.1.3經(jīng)驗(yàn)與啟示從該案例中可以總結(jié)出多方面的寶貴經(jīng)驗(yàn)和啟示。在模型構(gòu)建方面，選擇合適的基因編輯技術(shù)和載體至關(guān)重要。采用pCAGGS載體結(jié)合顯微注射技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了人ACE2基因在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。這提示在構(gòu)建其他基因編輯小鼠模型時，要充分考慮載體的特性，如啟動子的強(qiáng)度、組織特異性等，以及基因編輯技術(shù)的準(zhǔn)確性和效率。在受精卵的獲取和處理過程中，超數(shù)排卵技術(shù)和體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化，為獲得高質(zhì)量的受精卵和胚胎提供了保障。這表明在動物模型構(gòu)建過程中，要注重實(shí)驗(yàn)操作的細(xì)節(jié)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以提高模型構(gòu)建的成功率。在致病性研究方面，系統(tǒng)、全面的檢測方法是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵。通過對小鼠臨床癥狀的密切觀察、病理變化的詳細(xì)分析、病毒載量的精確檢測以及免疫反應(yīng)的深入研究，全面揭示了SARS相關(guān)冠狀病毒在hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的致病性。這啟示其他研究在開展致病性研究時，要綜合運(yùn)用多種檢測手段，從不同角度對研究對象進(jìn)行分析，以獲得更全面、準(zhǔn)確的研究結(jié)果。該案例中對不同時間點(diǎn)、不同組織器官的檢測，為研究病毒感染的動態(tài)過程提供了范例。在研究病毒感染的過程中，要關(guān)注病毒在不同組織器官中的分布和復(fù)制情況，以及免疫反應(yīng)在不同階段的變化，從而深入了解病毒的致病機(jī)制。5.2案例二：病毒適應(yīng)進(jìn)化獲得的小鼠模型5.2.1適應(yīng)進(jìn)化過程在某研究中，研究人員為了獲得適應(yīng)小鼠的SARS相關(guān)冠狀病毒株，采用了連續(xù)傳代的方法。首先，選取具有代表性的SARS相關(guān)冠狀病毒臨床株，將其通過鼻腔接種的方式感染BALB/c小鼠。感染劑量經(jīng)過精確計(jì)算，以確保每只小鼠接種的病毒量一致，初始接種劑量為10^5PFU/只。接種后，密切觀察小鼠的臨床癥狀。在感染后的第3-5天，小鼠開始出現(xiàn)體重下降、精神萎靡等癥狀。此時，采集小鼠的肺組織樣本。肺組織樣本經(jīng)過勻漿處理，加入適量的病毒保存液，充分研磨后，離心取上清液，獲得含有病毒的懸液。將該懸液進(jìn)行病毒的分離和培養(yǎng)，通過在Vero細(xì)胞上進(jìn)行病毒的擴(kuò)增，獲得子代病毒。將子代病毒再次感染新的BALB/c小鼠，重復(fù)上述過程。在連續(xù)傳代過程中，對每一代病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行詳細(xì)分析。研究人員發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力逐漸增強(qiáng)。通過實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，從第3代開始，病毒在小鼠肺組織中的載量明顯高于前兩代。在第5代時，病毒載量達(dá)到高峰，相較于初始病毒株，肺組織中的病毒核酸拷貝數(shù)增加了10-100倍。對病毒的基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)S蛋白基因、非結(jié)構(gòu)蛋白基因等多個區(qū)域出現(xiàn)了突變。其中，S蛋白基因的突變導(dǎo)致S蛋白的氨基酸序列發(fā)生改變，使得病毒與