生物技術(shù)概論：第二講 植物組培的培養(yǎng)基.ppt

1、,第二講 培養(yǎng)基,目的要求：,一、掌握培養(yǎng)基的種類(lèi)及其特點(diǎn) 三、掌握培養(yǎng)基的組成和其適宜劑量 二、掌握MS培養(yǎng)基配制 四、理解培養(yǎng)基篩選方法,第一節(jié) 培養(yǎng)基的種類(lèi)和成分 一、培養(yǎng)基種類(lèi) 二、培養(yǎng)基成分 第二節(jié) 培養(yǎng)基制備 一、母液配制和保存 二、培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌 第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇 一、單因子試驗(yàn) 二、多因子試驗(yàn) 三、逐步增減法 四、廣譜實(shí)驗(yàn)法,一、培養(yǎng)基的種類(lèi) 1、根據(jù)其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基是指加凝固劑的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，加熱溶解后，分別裝入常用的培養(yǎng)容器中冷卻后即得到固體培養(yǎng)基。 液體培養(yǎng)基是指不加凝固劑的培養(yǎng)基。,培養(yǎng)基種類(lèi),固體培

2、養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,營(yíng)養(yǎng)分布均勻，生長(zhǎng)整齊一致，但通氣性差。,通氣性較好，便于操作，但營(yíng)養(yǎng)分布不均，生長(zhǎng)發(fā)育不整齊。,二者比較,2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程 培養(yǎng)基分為： 初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基 外植體：從植物體上取出的用于無(wú)菌培養(yǎng)的植物材料。 植物材料：莖尖、莖段、花瓣、葉子、花藥等,初代培養(yǎng) ：指用來(lái)第一次接種從植物體上分離下來(lái)的外植體過(guò)程 。 繼代培養(yǎng)：對(duì)培養(yǎng)物(包括細(xì)胞、組織或其切段)通過(guò)更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分離，進(jìn)行連續(xù)多代的培養(yǎng)，就稱為繼代培養(yǎng)。,3、根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為： 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 增殖培養(yǎng)基 生根培養(yǎng)基 4、根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。 基本

3、培養(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。 完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。,常用培養(yǎng)基種類(lèi),有機(jī)成分復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素 用于原生質(zhì)體培養(yǎng)( 包括原生質(zhì)融合的培養(yǎng)),KM-8P培養(yǎng)基特點(diǎn)：,N6培養(yǎng)基特點(diǎn)：,1974年朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì) 成分簡(jiǎn)單 KNO3 和 (NH4)2SO4含量高 廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其它植物的花藥培養(yǎng)等,White培養(yǎng)基特點(diǎn)：,1943年由hite為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。19

4、63年又作了改良，稱作hite改良培養(yǎng)基 。 特點(diǎn)：無(wú)機(jī)鹽含量較低 適用：生根培養(yǎng)。,B5培養(yǎng)基特點(diǎn)：,含較低的銨 雙子葉植物 尤其木本植物組培可選擇,MS培養(yǎng)基特點(diǎn)： 無(wú)機(jī)鹽、離子濃度高，硝酸鹽含量較高。,MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無(wú)機(jī)鹽的濃度較高，能保證組織培生長(zhǎng)所需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。并且因?yàn)殡x子濃度高，在配制、貯存、消毒過(guò)程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡,一、無(wú) 機(jī) 鹽 ,氮 枝葉生長(zhǎng)需要氮素，缺氮老葉先發(fā)黃；氮過(guò)量，枝葉過(guò)度茂盛 。 磷 缺磷，植株生長(zhǎng)緩慢，老葉暗紫色。 鉀 促進(jìn)花卉生長(zhǎng)健壯，增強(qiáng)抗性，莖稈挺拔。缺鉀，葉尖、葉緣枯焦，葉片呈皺曲狀，老葉

5、發(fā)黃或火燒狀。 鈷 缺鈷，葉片失綠而卷曲，整個(gè)葉片向上彎曲凋枯。,二、有 機(jī) 物,維 生 素,肌 醇,氨 基 酸,天然復(fù)合物,椰子汁（CM）,酵母浸出液（YE),水解酪蛋白（CH),碳水化合物,馬鈴薯汁液,其 它,碳水化合物,選用種類(lèi)：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等 蔗糖濃度：2%3%，胚培養(yǎng)為4%15% 大生產(chǎn)時(shí)可用白糖,糖在培養(yǎng)基的作用： 1）為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架 2）為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量 3）維持滲透壓,種類(lèi)： VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、 VB3（煙酸）、Vc（抗壞血酸 濃度：0.11.0mg/L 作用：VB1 促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力 VB6 促根生長(zhǎng) V

6、c 防組織褐變 VB3 與植物代謝和胚的發(fā)育有關(guān)系,維 生 素,氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培養(yǎng)基的種類(lèi)不同，其種類(lèi)和濃度不同。 肌醇：又稱環(huán)己六醇，在糖類(lèi)的轉(zhuǎn)化中起作用,常見(jiàn)糖和維生素及其主要性質(zhì),椰乳：促愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)，用量1020%， 使用注意莖尖大小 香蕉泥：用量150 200ml/L ，應(yīng)用在蘭花組培 馬鈴薯汁液：用量150200g/L，使苗壯 水解酪蛋白：濃度100200mg/L，應(yīng)用在微莖尖 培養(yǎng),天然復(fù)合物,自然界中，植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)

7、建成、開(kāi)花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠、萌發(fā)等許多生理生化活動(dòng)。 在培養(yǎng)基中，其各種成分對(duì)培養(yǎng)物影響最大的最顯著的就是激素。激素的種類(lèi)、濃度、以及配比都會(huì)顯著的影響愈傷組織的形成、不定根、不定芽的分化，胚狀體的形成等。 通常，不同植物，或不同品種，甚至同一植物的不同位置對(duì)激素的要求有很大的變化，這主要取決于植物的內(nèi)源激素水平。 組織培養(yǎng)中使用的激素有的是天然的，如脫落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4D）,三、激素,（一）、激素的種類(lèi)： 1、生長(zhǎng)素類(lèi)： 在自然界中，生長(zhǎng)素影響莖和節(jié)間的伸長(zhǎng)、向性、頂端優(yōu)勢(shì)、葉片脫落和生根等現(xiàn)象 在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的

8、分化，誘導(dǎo)愈傷組織）,組織培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)素： 1 二氯苯氧乙酸（2，4D） 2 萘乙酸（NAA） 3 吲哚乙酸（IAA） 4 吲哚3丁酸（IBA） NAA、IAA、IBA被廣泛用于生根，2，4D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。 IAA容易光解，注意用棕色試劑瓶保存，保存時(shí)間不要太久。 溶解方法：1M NaOH或95酒精，以前者為好 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存,2、細(xì)胞分裂素 自然界中，細(xì)胞分裂素影響細(xì)胞分裂，頂端優(yōu)勢(shì)的變化和莖的分化等 組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分類(lèi)素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。細(xì)胞分裂素常常與生長(zhǎng)素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長(zhǎng)，細(xì)胞分化和器官形成。

9、常用的細(xì)胞分裂素有： 6芐氨基嘌呤（6BA） 激動(dòng)素（6-糠氨基嘌呤、 KT） 玉米素（ZT） 噻二唑苯基脲（ thidiazuron、 TDZ ） 溶解方法：1MHCL 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存,3、赤霉素 由日本人黑澤1926年發(fā)現(xiàn)。自然界中，赤霉素能夠打破休眠、促進(jìn)果實(shí)成長(zhǎng)等效果。雖然已經(jīng)用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究，但在培養(yǎng)基中很少添加，因?yàn)樗淖饔猛秦?fù)面的。雖然也有赤霉素能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株的報(bào)道，但在使用中仍需慎重，不可輕易添加。 赤霉素有20多種，其中在組織培養(yǎng)中最常用的是GA3。在組織培養(yǎng)中與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素相比，赤霉素不太常用，據(jù)報(bào)道赤霉素能

10、刺激不定胚正常發(fā)育成小植株 溶解方法：95酒精 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存 赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解 滅菌：高溫易分解，要過(guò)濾滅菌,4、脫落酸 在自然界中，脫落酸能阻礙發(fā)育、促進(jìn)老化、形成休眠芽等作用。 經(jīng)試驗(yàn)表明，脫落酸有利于胚性愈傷組織形成正常不定芽。 材料的試管保存，加上脫落酸能抑制生長(zhǎng)，使繼代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)。 溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。 保存：具有熱穩(wěn)定性，但容易發(fā)生光解。 配成一定濃度后，冰箱冷藏保存,（二）、常見(jiàn)培養(yǎng)基中植物激素配方類(lèi)型,（三）、常見(jiàn)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及主要性能一覽表,（四）、常見(jiàn)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的微摩爾/升濃度與毫克/升的換,四、培養(yǎng)體支

11、持材料,1.瓊脂 用量710g/L（0.7%-1%） 注意：1 若濃度過(guò)高，培養(yǎng)基就會(huì)變得很硬，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就難于擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中。 2 當(dāng)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)需要研究時(shí)，應(yīng)注意不要使用瓊脂，因?yàn)槭袌?chǎng)供應(yīng)所有瓊脂含有雜質(zhì)，特別是含有Ca,Mg和微量元素。 2.其它 卡拉膠、玻璃纖維、濾紙橋、海綿等,五、輔助性物質(zhì),1.抗生素 2.抗氧化物 3.活性炭,抗生素,1.常用種類(lèi)：青霉素 鏈霉素 慶大霉素等 2.用量：5%20% 3.作用：防止由外植體內(nèi)生菌造成的污染。 4 過(guò)濾滅菌,抗氧化物,常用抗氧化劑及使用： 半胱氨酸 VC（50200mg/L液洗滌外植體傷口表面）。,活性炭,1.作用：具吸附作用；莖尖初代培

12、養(yǎng)可防褐化；促進(jìn)新梢增殖（濃度0.1 0.2%）；促進(jìn)生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）。利于胚胎培養(yǎng)。 2.常用濃度：0.510g/L 3.活性炭的作用 對(duì)生長(zhǎng)的抑制：其吸附了植物激素 對(duì)生長(zhǎng)的刺激：其吸附了有抑制作用的物質(zhì),第二節(jié) 培養(yǎng)基配制,一、母液配制與保存,二、培養(yǎng)基配制,(一)母液配制流程圖,稱 量,母液分裝,確定培養(yǎng)基,溶 解,定 容,貼標(biāo)簽,保存于冰箱,一、母液配制 (以MS為例),稱量藥品,天平預(yù)置 全顯示 清 零 稱 藥,(二)母液配制要求： 1.母液濃縮倍數(shù)：10-100 ，大量元素10；微量元素、鐵鹽100；有機(jī)物50； 2.選用蒸餾水、重蒸餾水、分析純或化學(xué)純?cè)噭?/p>

13、 3.防止沉淀 4.激素母液濃度：1mg/ml,1次配成50或100 ml 5.激素溶解： IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容； NAA先溶于熱水或95%酒精再加水； 2，4-D先溶于1M NaOH再加水； KT、BA先溶于1M HCl再加水。,為什么要配制母液？ 1）方便 2）準(zhǔn)確（有些成分量太?。?3）母液要分類(lèi)配， 否則有些成分混合一起會(huì)產(chǎn)生沉淀 以MS培養(yǎng)基為例：,MS培養(yǎng)基母液的配制,母液保存：,在冰箱內(nèi) 低溫保存,二、培養(yǎng)基配制,移母液,調(diào)PH值,培養(yǎng)基熬制,滅 菌,稱取蔗糖、瓊脂,扎 口,定 容,分 裝,二次定容,接 種,確定配方,大量元素母液,微量元素母液,鐵 鹽母

14、液,有機(jī)物母液,取100ml,取10ml,取10ml,取10ml,注：MS培養(yǎng)基配制,容 量 瓶,要求：一次性移取，不能吸進(jìn)吸氣球里，數(shù)量看準(zhǔn)，不滴不漏，吹凈為度。,移母液,用自來(lái)水定容至1升,定 容：,稱取蔗糖、瓊脂,用自來(lái)水定容到1升 取蔗糖2530g，瓊脂78g。,培養(yǎng)基熬制：,3.將容量瓶中剩余的液體一并倒入鋁鍋中，搖晃使均勻。,1.將定容好的培養(yǎng)液取1/3倒入鋁鍋中，同時(shí)加入稱好的蔗糖和瓊脂，邊煮邊攪拌，防止糊底。,2.用旺火煮開(kāi)，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。,用0.1MNaOH或HCl調(diào)PH值為6.0。,調(diào)PH值：,分裝：,趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入3040ml 。,扎

15、口與滅菌:,要求封口松緊適宜，系活扣，便于接種操作。,培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)滅菌，防止變質(zhì)。,滅菌后，應(yīng)盡快地轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶使其冷卻，一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)基儲(chǔ)藏于30以下的室內(nèi)名，最好儲(chǔ)藏在410的條件下。 應(yīng)當(dāng)注意的是，某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)如IAA、ZT、ABA等以及某些維生素是不穩(wěn)定的，不能和其他的培養(yǎng)基一起高壓滅菌，而要進(jìn)行過(guò)濾滅菌。,第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇,一、單因子試驗(yàn) 二、多因子試驗(yàn) 三、逐步增減法 四、廣譜試驗(yàn)法,2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合,6BA（mg/L),A1 A2 A3 A4 A5,NAA（mg/L),B1,B2,B4,B3,B5,B1A1 B1A2 B1A3 B1A4 B1A5,B2A1

16、B2A2 B2A3 B2A4 B2A5,B3A1 B3A2 B3A3 B3A4 B3A5,B4A1 B4A2 B4A3 B4A4 B4A5,B5A1 B5A2 B5A3 B5A4 B5A5,2種激素3種濃度的實(shí)驗(yàn)組合,NAA（mg/L),6BA（mg/L) 低 中 高,低,中,高,低低 低中 低高,中低 中中 中高,高低 高中 高高,廣譜試驗(yàn)法,1 把培養(yǎng)基分為4個(gè)大類(lèi)：無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 2 對(duì)每一類(lèi)物質(zhì)再選定3個(gè)濃度，既：低（L)、中（M）和高（H）、4類(lèi)物質(zhì)各3種濃度的各種不同組合構(gòu)成了一項(xiàng)包括81個(gè)處理的試驗(yàn)。 3 在這81個(gè)處理中最好的一個(gè)用4個(gè)字母表示，例如：一個(gè)包含中等濃度無(wú)機(jī)鹽、低濃度生長(zhǎng)素、中等濃度細(xì)胞分類(lèi)素和高濃度有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的處理表示為：MLMH。 4 達(dá)到這個(gè)階段后，可以再試驗(yàn)不同類(lèi)型的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，以找到它們的最好類(lèi)型。因?yàn)橛行┰囼?yàn)系統(tǒng)對(duì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分類(lèi)素這兩類(lèi)生長(zhǎng)物質(zhì)的具體形式比較敏感。,NAA,A：NAA 0mg/L，芽（少），根（無(wú)） B：NAA 0.1mg/L，芽（少），根（無(wú)），愈傷組織（少量） C：N