細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù)課件

1、細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),第05章 細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),本章主要內(nèi)容： 1. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 2. 病毒及其培養(yǎng)技術(shù) 3. 病毒效價(jià)（滴度）測(cè)定技術(shù) 4. 常用分子病毒學(xué)技術(shù),細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),第1節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),一、幾個(gè)概念,1.原代細(xì)胞：直接由組織制備的細(xì)胞培養(yǎng)物。未經(jīng)建系，不能 無限傳代，僅可傳有限代次，一般58代。 2.傳代細(xì)胞：能夠無限傳代繁殖的細(xì)胞群，不具有來源組織的 核型和貼壁細(xì)胞依賴性。 3.雞胚：孵化至911天的健康或SPF雞胚。 4.基礎(chǔ)培養(yǎng)基（minimum essential medium, MEM）：能夠滿 足動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的基本營(yíng)養(yǎng)需要的培養(yǎng)

2、基。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),5.生長(zhǎng)液：含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液。 6.維持液：含2%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液。 7.消化（分散）液：0.25%胰酶。配方入下： NaCl 0.8g KCl 0.2g Na2HPO4 12H2O 0.29g KH2PO4 0.02g EDTA 0.03g 胰酶 0.25g 水至 100mL 8.接毒：將毒種按一定比例加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，以進(jìn)一步增 殖病毒的過程。方法分為單層接種和同步接毒。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟,1.細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮中取出凍存的細(xì)胞，迅速投入37水浴中，待完全融化后，直接轉(zhuǎn)入盛有5-10mL細(xì)胞生

3、長(zhǎng)液的60mm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37、5CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，換生長(zhǎng)液培養(yǎng)。 2.細(xì)胞的傳代 移去細(xì)胞瓶中生長(zhǎng)液，用PBS洗兩次，用0.25%的胰酶消化液分散細(xì)胞，視細(xì)胞消化程度確定消化時(shí)間，一般在2-5min。待部分細(xì)胞出現(xiàn)脫落后，輕輕拍打細(xì)胞瓶，使細(xì)胞脫離瓶壁。加入生長(zhǎng)液，用吸管吹打數(shù)次使細(xì)胞彼此分開，傳代于2-3個(gè)與原培養(yǎng)瓶同樣大小的培養(yǎng)瓶中，在37、5CO2培養(yǎng)。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),3.換液與維持培養(yǎng) 待傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)至80%滿度時(shí)(一般應(yīng)24hrs)，將生長(zhǎng)液換掉，加入同樣數(shù)量的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。通?？删S持23天。待細(xì)胞長(zhǎng)滿并開始出現(xiàn)衰老死亡者時(shí)，重復(fù)傳代、換液的操作。

4、4.細(xì)胞凍存 待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，也可將細(xì)胞保存起來。保存在-80或液氮中。具體操作如下：用消化液將細(xì)胞分散后，加入含10% DMSO（二甲基亞砜）的FBS營(yíng)養(yǎng)液，使細(xì)胞濃度達(dá)106-107/ml，分裝于細(xì)胞凍存管中，1ml/管。按照4、1hr，-20、4hrs、-80過夜的順序凍存，最后置液氮中長(zhǎng)期保存。 應(yīng)注意：凍存過程應(yīng)緩慢，而復(fù)蘇過程應(yīng)迅速。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),第2節(jié) 病毒及其培養(yǎng)技術(shù),病毒：屬于微生物界，是細(xì)胞內(nèi)專性寄生的最小生命形態(tài)-微生物，即在自然情況下，它只能在活的細(xì)胞內(nèi)才能復(fù)制和增殖。 細(xì)胞外的病毒，沒有新陳代謝，不表現(xiàn)生命活性。但當(dāng)其進(jìn)入宿主細(xì)胞后，病毒核酸迅即啟動(dòng)和復(fù)制

5、，最后產(chǎn)生數(shù)量增多的子代病毒；病毒具有遺傳性和變異性。 因此，病毒具有生命活動(dòng)型和生命靜止型的雙重存在形式。與其他微生物不同，病毒有其自身的特性。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),一、病毒的特征,1. 病毒一般只含有一種核酸DNA或RNA，而其他微生物，包括細(xì)菌、支原體、立克次氏體和衣原體，則都同時(shí)含有兩種核酸； 2. 病毒通過基因組復(fù)制和表達(dá)，產(chǎn)生子代病毒的核酸和蛋白，隨后裝配成完整的病毒粒子；而在其他微生物，則是核酸和許多其他組成成分一起參與生長(zhǎng)、增殖過程，并常以二分裂或類似的方式進(jìn)行； 3. 病毒缺乏完整的酶系統(tǒng)，不具備其他生物“產(chǎn)能”所需的遺傳信息，因此必須利用宿主細(xì)胞的酶類和產(chǎn)能機(jī)構(gòu)，并借

6、助宿主細(xì)胞的生物合成機(jī)構(gòu)復(fù)制其核酸以及合成由其核酸編碼的蛋白，乃至直接利用細(xì)胞成分?？梢赃@樣認(rèn)為，病毒的生物合成實(shí)質(zhì)上是病毒遺傳信息控制下的細(xì)胞生物合成過程；,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),4. 某些RNA病毒(反轉(zhuǎn)錄病毒)的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA (cDNA)，與細(xì)胞基因組整合，并隨細(xì)胞DNA的復(fù)制而增殖，這就是所謂的DNA前病毒。 5. 病毒沒有細(xì)胞壁，也不進(jìn)行蛋白質(zhì)、糖和脂類的代謝活動(dòng)，因此對(duì)抗生素具有明顯的抵抗力。 6. 病毒基因組形式多樣：dsDNA、ssDNA、dsRNA、+ssRNA、-ssRNA等。既有線狀，又有環(huán)狀，還有分節(jié)段的。 細(xì)胞是組成動(dòng)物、植物、微生物等生物體的基本

7、單位，但病毒與此不同，一個(gè)簡(jiǎn)單的病毒由蛋白質(zhì)衣殼和核酸組成，復(fù)雜一些的病毒僅在衣殼外面多一層囊膜，故病毒可被稱為亞細(xì)胞生物或分子生物。 病毒沒有生長(zhǎng)，也不以二等分裂方式繁殖，而是以某種方式將基因組釋放到細(xì)胞內(nèi)，一方面以其為模板轉(zhuǎn)錄mRNA合成蛋白，另一方面合成子代核酸，再組裝為子代病毒粒子，最后釋放到細(xì)胞外，這一過程叫增殖。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),復(fù)制：病毒的增殖：Replication、Multiplication。病毒以其核酸侵入易感細(xì)胞內(nèi)，在病毒核酸信號(hào)指揮下，利用宿主細(xì)胞，按其自身為模板合成病毒的蛋白質(zhì)、核酸及其它部件，然后裝配成新的病毒粒子，最后釋放到細(xì)胞外，開始另一個(gè)感染周期。

8、,復(fù)制周期(Replication cycle)：即感染循環(huán)(infection cycle)。從病毒吸附于宿主細(xì)胞開始，到子代病毒從細(xì)胞釋放出來為止的全過程，稱為病毒的復(fù)制周期。,二、病毒復(fù)制周期,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),1.吸附和侵入 病毒吸附分兩步進(jìn)行，即可逆的非特異性吸附和不可逆的特異性吸附。首先，非特異性吸附即病毒與細(xì)胞以靜電引力相結(jié)合。這種吸附可發(fā)生在細(xì)胞表面任何部位且易被沖洗、高濃度鹽類和一定的pH環(huán)境所破壞，使病毒從吸附物上重新解脫出來。 隨后是病毒的特異性吸附，即病毒蛋白(抗受體)與細(xì)胞膜上的受體特異性結(jié)合。這種吸附是不可逆的。病毒吸附細(xì)胞的過程，可在幾分鐘到幾十分鐘的時(shí)間

9、內(nèi)完成。,病毒感染增殖的一般過程： 動(dòng)物病毒的增殖過程大致可以分為：吸附與侵入、脫殼、病毒成分的合成以及裝配與釋放等4個(gè)主要階段。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),細(xì)胞受體主要是胞膜上的糖蛋白。據(jù)估計(jì)，一個(gè)宿主細(xì)胞上的特異性受體部位可達(dá)104105個(gè)。但不一定每個(gè)細(xì)胞表面都有特定病毒的特異受體。細(xì)胞有無特定病毒的受體，直接影響是否對(duì)該病毒具有易感性。所以，病毒受體的研究是研究病毒感染的分子機(jī)制的重要內(nèi)容之一。 侵入與吸附是一個(gè)連續(xù)過程。不過，侵入是一個(gè)依靠能量的過程。目前發(fā)現(xiàn)病毒侵入細(xì)胞有3種方式：病毒直接轉(zhuǎn)入胞漿，如小RNA病毒；細(xì)胞吞飲病毒，如多瘤病毒；病毒囊膜同細(xì)胞膜融合，如流感病毒。無囊膜病

10、毒以前二種方式侵入，有囊膜病毒常以第三種方式進(jìn)入。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),2.脫殼 病毒脫殼，包括脫囊膜和脫衣殼兩個(gè)過程。有囊膜病毒(除痘病毒外)的脫囊膜過程就是上述侵入的過程。無囊膜病毒則只有脫衣殼的過程。 病毒核衣殼的脫落和核酸的逸出主要發(fā)生在細(xì)胞漿內(nèi)。但不同病毒脫殼發(fā)生的地點(diǎn)和過程不完全一樣。如呼腸孤病毒，并不發(fā)生完全的脫殼。某些在細(xì)胞核內(nèi)增殖的DNA病毒，例如乳多空病毒、腺病毒和皰疹病毒，其核衣殼可能在未被完全脫殼的情況下就進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。口蹄疫病毒則可能就在細(xì)胞膜上脫掉衣殼，病毒核酸直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 脫殼必須有酶的參與，脫殼酶來自宿主細(xì)胞，有的為病毒基因編碼。迄今，病毒侵入細(xì)胞并脫

11、殼的詳細(xì)分子機(jī)制尚未完全研究清楚。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),3.病毒成分的合成 病毒侵入細(xì)胞并脫殼后，在其遺傳信息的控制下，一方面病毒利用自身的特異性核酸聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶等進(jìn)行病毒成分的合成；另一方面利用細(xì)胞生物合成的場(chǎng)所和原材料合成病毒的各種組成成份及其所需的酶類，包括病毒核酸轉(zhuǎn)錄或復(fù)制時(shí)所需的聚合酶；最后是由新合成的病毒成分裝配成完整的病毒粒子。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),4.裝配和釋放 新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染細(xì)胞內(nèi)逐步成熟。所謂成熟，是指核酸進(jìn)一步被修飾，病毒蛋白亞單位以最佳物理方式形成衣殼。 例如脊髓灰質(zhì)炎病毒的RNA必須同一個(gè)基因蛋白(VPg)結(jié)合后，才能成為病毒RNA。

12、與此同時(shí)，衣殼蛋白VP0、VP1和VP3形成5S的結(jié)構(gòu)單位，再由60個(gè)5S形成80S的衣殼。病毒RNA進(jìn)入衣殼，就形成完整病毒粒子，這就是裝配。 病毒的裝配效率甚低，常因核酸不能與衣殼有機(jī)地結(jié)合，形成缺乏感染性的空殼病毒（假病毒）。同樣，病毒成分在細(xì)胞內(nèi)裝配成完整病毒粒子的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),由于細(xì)胞的生物合成被病毒阻斷，細(xì)胞發(fā)生變性及死亡（CPE），細(xì)胞自身的溶解就將病毒釋放出來。某些不產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變的病毒的釋放方式，目前還不十分清楚。相反，小RNA病毒合成速度極快，病毒粒子在胞漿內(nèi)大量積聚，也許在細(xì)胞死亡之前，就可脹破細(xì)胞，釋放病毒。 有囊膜病毒的釋放過程就

13、是病毒核衣殼獲得囊膜的過程。反轉(zhuǎn)錄病毒、披膜病毒、副粘病毒等，由于在胞漿內(nèi)復(fù)制及裝配，病毒在胞漿膜上獲得囊膜。而皰疹病毒由于在胞核內(nèi)復(fù)制及裝配，病毒在核膜上獲得囊膜。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),VIRAL LIFE CYCLE,ATTACHMENT,PENETRATION,HOST FUNCTIONS,ASSEMBLY (MATURATION),Transcription,REPLICATION,RELEASE,UNCOATING,Translation,MULTIPLICATION,病毒的復(fù)制過程,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),（一）用細(xì)胞培養(yǎng)病毒,三、病毒的培養(yǎng)技術(shù),病毒可用細(xì)胞、雞胚和動(dòng)物進(jìn)

14、行培養(yǎng)。,細(xì)胞培養(yǎng)：cell culture. 用機(jī)械的方法(剪碎)或化學(xué)的方法(胰酶)，使動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液后，給以相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)和溫度等條件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)。 包括原代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和細(xì)胞系（cell line）培養(yǎng)。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是研究病毒的分子感染機(jī)制、生物大分子裝配機(jī)制的重要手段，也是大量增殖病毒，制備細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的基礎(chǔ)技術(shù)。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),體外培養(yǎng)的細(xì)胞有兩種基本形態(tài),成纖維樣細(xì)胞,上皮樣細(xì)胞,1.細(xì)胞培養(yǎng)的類型,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),雞胚成纖維細(xì)胞 CEF：Chicken embryo fibroblast,1)原代細(xì)胞 由新鮮的、分化程度較低的組織

15、或胚胎，經(jīng)剪碎并用胰酶消化后制備的細(xì)胞。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),地鼠腎細(xì)胞株 BHK21,非洲綠猴腎細(xì)胞 Vero細(xì)胞,2)細(xì)胞株（cell strain） 從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2細(xì)胞,人子宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞系,3)細(xì)胞系(cell line) 從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖。,細(xì)胞的傳代：擴(kuò)大培養(yǎng)用胰酶將長(zhǎng)成致密單層的細(xì)胞(原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株、細(xì)胞系)從一個(gè)培養(yǎng)瓶消化下來，并分裝為23瓶，補(bǔ)充培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)的過程。原代細(xì)胞的傳代過程常稱之為

16、繼代。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),3. 單細(xì)胞制備方法,機(jī)械分散法：用于原代細(xì)胞的制備，如雞胚成纖維細(xì)胞。 用剪刀將雞胚剪成1mm3小塊，放入底部有一塊微孔銅絲網(wǎng)的10-20ml注射器內(nèi)，將組織細(xì)胞擠過網(wǎng)孔，即可得到分散的細(xì)胞或配合酶消化法。,胰酶消化法：用于消化細(xì)胞間的蛋白成分。視不同組織和細(xì)胞，胰酶濃度和消化時(shí)間有所不同；一般為0.25%，在室溫或37下作用一段時(shí)間胰酶消化后，再用吸管進(jìn)行吹打，使之分散為單細(xì)胞。,螯合劑分散法：EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)可與鈣鎂離子結(jié)合，從而使上皮細(xì)胞類細(xì)胞分散，單獨(dú)使用時(shí)消化效果可能不佳，與胰酶配制在一起，消化效果更佳。配制EDTA液時(shí)，需用無鈣鎂緩沖

17、液。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),4. 細(xì)胞培養(yǎng)的方法,1)原代細(xì)胞的制備：雞胚成纖維細(xì)胞。取911日齡雞胚，去頭、四肢、內(nèi)臟，PBS洗滌；置于小燒杯中，用剪刀剪碎(1mm3)。用0.25%胰酶消化：37、30min，吸棄胰酶，在組織塊中加入培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散，用紗布過濾，計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)。,細(xì)胞計(jì)數(shù)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)板。在白細(xì)胞計(jì)數(shù)板上放上蓋玻片 取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取一滴滴入白細(xì)胞計(jì)數(shù)板，使其滲入蓋玻片下，計(jì)數(shù)五個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)： 細(xì)胞數(shù)/ml(五個(gè)大方格中的細(xì)胞總個(gè)數(shù)5)10000稀釋倍數(shù) 將原始細(xì)胞懸液稀釋至5105個(gè)細(xì)胞/ml后，裝瓶培養(yǎng)。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病

18、毒學(xué)技術(shù),9-10日 齡雞胚,幼齡動(dòng) 物組織,加培養(yǎng)基吹打分散 過濾、補(bǔ)足培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),25ml培養(yǎng)瓶裝3ml，100ml培養(yǎng)瓶裝10ml， 平放于37溫箱培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),37培養(yǎng)2448h，雞胚成纖維細(xì)胞可形成致密單層，但細(xì)胞瓶中需裝合適的細(xì)胞量。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),2) 細(xì)胞的傳代,1）取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞； 2）倒掉培養(yǎng)液； 3）用PBS洗細(xì)胞面12次（可略去?。?4）加入適量0.25%胰酶消化液使其覆蓋細(xì)胞面； 5）室溫下消化(時(shí)間視不同細(xì)胞而定)； 6）去胰酶，加入少量生長(zhǎng)液，吹打分散細(xì)胞； 7）加入足量生長(zhǎng)液，分裝為約24瓶，溫箱培養(yǎng)。,細(xì)

19、胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),5. 影響細(xì)胞的因素,靜置培養(yǎng)、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)和微囊化培養(yǎng)。,靜置培養(yǎng),將細(xì)胞懸液接入轉(zhuǎn)瓶(塑料或玻璃瓶)，放于恒溫箱的轉(zhuǎn)鼓上進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞仍是貼壁生長(zhǎng)，但能增加供細(xì)胞貼壁的表面積，便于擴(kuò)大產(chǎn)量；溫和轉(zhuǎn)動(dòng)(68r/h)時(shí)，細(xì)胞有一段時(shí)間離開培養(yǎng)基，懸浮于空中，增加了氣體交換，有利細(xì)胞生長(zhǎng)。,轉(zhuǎn)瓶,轉(zhuǎn)瓶機(jī),細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),6. 病毒增殖的技術(shù),1.培養(yǎng)基：Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM。 2.血清：生長(zhǎng)液加10%，維持液加2%。 3.pH：用碳酸氫鈉調(diào)至中性偏堿，培養(yǎng)液呈粉紅色。 4.溫度：37。 5.細(xì)胞

20、接種量：合適，一般為105/ml。 6.消化：適度。 7.污染：嚴(yán)格無菌操作。原材料、培養(yǎng)基和試劑的消毒和 除菌、器材的消毒、操作，培養(yǎng)基需加雙抗。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),試劑的配制：,1. 雙抗：用滅菌三蒸水溶解青、鏈霉素，每毫升含青霉素104 IU、鏈霉素104ug，冷凍保存，使用時(shí)，100ml培養(yǎng)基加1ml。 2. 培養(yǎng)液和胰酶均可配制成較高濃度的液體存放于冰箱，前者 4，后者冷凍。 3. 配制培養(yǎng)基使用液時(shí)，加雙抗和小牛血清后，再用碳酸氫鈉 溶液調(diào)pH，不必按照培養(yǎng)基的使用說明，在溶解培養(yǎng)基粉劑 后立即加入碳酸氫鈉。 注意：若要檢查配制好的培養(yǎng)基是否無菌，可取少量裝瓶，置于37溫箱

21、。 為保持培養(yǎng)基無菌，可分裝成較小的瓶子，每瓶一次用完冰箱保存的培養(yǎng)基較涼，使用前，可將培養(yǎng)基在室溫下適當(dāng)放置。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),病毒接種與收獲：,1.取生長(zhǎng)良好的敏感細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)基，用PBS或Hanks 液洗滌細(xì)胞面12次。 2.加入預(yù)先稀釋的病毒液，其體積為維持液的1%2%，輕晃 使其覆蓋細(xì)胞面。 3.37靜置如3060min，使病毒吸附于細(xì)胞表面。 4.加入維持液，37培養(yǎng)，每日鏡檢，多數(shù)病毒在接種后3 7d可使細(xì)胞出現(xiàn)病變(CPE)。 5.在CPE達(dá)80%左右時(shí)可收毒，凍融3次使病毒釋放，離心去 細(xì)胞碎片，取上清液低溫冷凍保存。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),同步接種和異步接種

22、：,1. 細(xì)胞長(zhǎng)好后，再接種病毒，為異步接種法 2. 某些病毒(如細(xì)小病毒)需采用同步接種，才能更好地繁殖，即，在單細(xì)胞懸液分裝后或分裝后4h內(nèi)，同時(shí)接種病毒。 3. 合適的病毒吸附時(shí)間和收毒時(shí)間可參閱相關(guān)文獻(xiàn)。 4. 不產(chǎn)生CPE的病毒，可使用一些間接的指標(biāo)，如免疫學(xué)方法 病毒毒價(jià)的測(cè)定：TCID50、空斑試驗(yàn)。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),選擇敏感細(xì)胞：獲得高滴度的病毒液,若用細(xì)胞繁殖病毒，針對(duì)不同病毒，需選擇其相應(yīng)的敏感細(xì)胞； 鴨瘟病毒可用雞鴨鵝胚成纖維細(xì)胞； 馬立克氏病病毒可用雞胚和鴨胚成纖維細(xì)胞； 口蹄疫病毒可用BHK21、PK15等； 未知病毒，通過研究確定敏感細(xì)胞。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用

23、病毒學(xué)技術(shù),影響病毒繁殖的因素:,血清：接種病毒后，需使用維持液，即培養(yǎng)基中的血清含量減至2%；若血清影響到病毒繁殖，可用無血清培養(yǎng)基。 溫度：37，某些病毒的最適溫度或高于或低于37，如狂犬病病毒的最適溫度為32。 pH：細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)可產(chǎn)酸，雖然受病毒感染影響，細(xì)胞產(chǎn)酸能力下降，但由于大多數(shù)病毒的繁殖需要37d，故維持液中酸性物質(zhì)仍可蓄積，配制維持液時(shí)可偏堿。 病毒接種量：適當(dāng)稀釋后，體積為維持液的1%10%。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),復(fù)習(xí)思考題,1. 概念：細(xì)胞培養(yǎng)、原代細(xì)胞、細(xì)胞株、細(xì)胞系、細(xì)胞 的傳代、靜置培養(yǎng)、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。 2. 用細(xì)胞培養(yǎng)繁殖病毒時(shí)，有哪些因素可影響到病毒的 增殖？

24、3. 細(xì)胞培養(yǎng)有哪些方式？,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),禽胚：雞、鴨、鵝胚。許多病毒適合于禽胚繁殖；禽胚來源充足；操作簡(jiǎn)單。,（二）用禽胚培養(yǎng)病毒,目的：適于對(duì)禽胚敏感的動(dòng)物病毒的分離、培養(yǎng)； 病毒滴度的測(cè)定； 中和試驗(yàn)：病毒的鑒定、分型、抗體檢測(cè)； 抗原制備； 廣泛用于生物制品的研究和生產(chǎn)。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),1.禽胚的選擇,根據(jù)不同病毒選擇不同禽胚： 雞胚：禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、禽痘病毒。 鴨胚：狂犬病病毒、減蛋綜合征病毒。 鵝胚或番鴨胚：鵝細(xì)小病毒(小鵝瘟)、番鴨呼腸孤病毒。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),大頭朝上：蛋殼、殼膜與氣室,2. 雞

25、胚的結(jié)構(gòu),細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),撕開殼膜，露出絨毛尿囊膜,殼膜,尿囊膜,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),9日齡雞胚結(jié)構(gòu)：,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),3.準(zhǔn)備雞胚與毒種,雞胚孵化：3738、相對(duì)濕度為53%57%的條件下孵化，孵育3日后，每日翻蛋12次。 孵至第4日，用照蛋器觀察雞胚發(fā)育情況，未受精卵，只見模糊的卵黃黑影，應(yīng)淘汰?；钆呖煽吹角逦难芎碗u胚的暗影，比較大一些的可以看見胚動(dòng)；隨后每日觀察一次，將胚動(dòng)呆滯或不動(dòng)、血管昏暗模糊者，隨時(shí)淘汰。 生長(zhǎng)良好的雞胚孵育至接種前。,準(zhǔn)備毒種：將病毒毒種用滅菌生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋分離病毒時(shí)，用適量生理鹽水加入病料中研磨、加抗菌素抑菌、離心取上清、經(jīng)無

26、菌檢驗(yàn)后用于接種。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),1）尿囊腔接種：選910日齡雞胚。新城疫病毒、鴨肝炎病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒等。 2）絨毛尿囊膜接種 3）卵黃囊接種 4）羊膜腔接種 5）腦內(nèi)接種 6）胚體接種 7）靜脈接種,4.接種,根據(jù)不同病毒選擇不同途徑：,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),（1）照胚：在氣室中部做記號(hào)，在靠近胚胎一側(cè)、氣室邊緣或偏下處劃出接種部位。,避開大血管,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),（2）消毒接種部位,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),（3）打孔,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),（4）接種,稀釋病毒液 0.10.2ml/胚,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),（

27、5）石蠟封口,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),（6）置37溫箱培養(yǎng) 每日照胚、24小時(shí)內(nèi)死胚棄之，根據(jù)不同病毒培養(yǎng)至合適時(shí)間。,接種后，收獲時(shí)間視不同病毒而異。 一般收集死亡雞胚，有些疫苗也收集存活雞胚。 置冰箱過夜或冰柜0.51 h冷卻使血液凝固，避免某些有血凝活性的病毒與紅細(xì)胞凝集造成病毒滴度下降。 消毒氣室處蛋殼，去除蛋殼和殼膜。 收獲雞胚的何種組織，依不同的病毒而定主要考慮組織的含毒量高低。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),取出尿囊液、胚胎、尿囊膜，制成勻漿，加適量抗菌素。制備鴨瘟弱毒疫苗時(shí)，加入保護(hù)劑制成凍干品；勻漿中加甲醛滅活為雞胚組織滅活苗。,（7）收獲全胚或尿囊液,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù)

28、,用吸管穿過絨毛尿囊膜插入尿囊腔，吸取尿囊液和羊水，加保護(hù)劑凍干即為新城疫弱毒疫苗； 而含新城疫病毒和禽流感病毒的尿囊液用甲醛滅活，加油乳佐劑乳化，即為油苗。,收獲尿囊液：,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),影響病毒增殖的因素： 1）種蛋質(zhì)量：最終影響到疫苗的質(zhì)量，應(yīng)使用SPF雞胚。 蛋傳微生物：白血病病毒、腦脊髓炎、腺病毒、支原體、傳染性貧血因子、沙門氏菌等，既污染生物制品，又影響病毒繁殖。 母源抗體：種雞免疫后、或感染過病原后，種蛋會(huì)含有母源抗體，可影響某些病毒在雞胚中的增殖。,2）孵化技術(shù) 溫度：雞胚孵化適宜溫度為37.838，病毒繁殖的適宜溫度一般為37 。 濕度：雞胚孵化適宜濕度為53%57

29、%，水禽胚可高5% 10%，過干導(dǎo)致胚胎失去水份，發(fā)育不良。 通風(fēng)：孵化機(jī)內(nèi)設(shè)有排風(fēng)扇，保持箱內(nèi)空氣新鮮。 翻蛋：種蛋大頭朝上，定期翻蛋，以改變位置，既可使胚胎受熱均勻，利于發(fā)育，也可避免胚胎與蛋殼粘連，還可強(qiáng)制胚胎定期活動(dòng)，促進(jìn)胚胎發(fā)育。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),3）接種技術(shù) 接種途徑：不同病毒有不同的接種途徑，需選擇合適的接種途徑，以獲得最高的病毒滴度； 使用不同的接種途徑時(shí)，需選擇合適日齡的雞胚，保證獲得最高量的病毒液； 接種時(shí)，不應(yīng)傷及胚體和血管，以免影響發(fā)育，使病毒繁殖速度降低或停止； 操作過程、所用器材，需保持無菌； 需選擇合適的收毒時(shí)間。,克服上述這些影響因素，旨在獲得高滴度的

30、、體積盡可能多的病毒液，即獲得足夠的抗原量，這是影響病毒性疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵因素。 若抗原量不能滿足需要，應(yīng)對(duì)病毒液進(jìn)行濃縮，雖然成本提高，但能保證效果。病毒抗原的濃縮技術(shù)！,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),（三）用動(dòng)物培養(yǎng)病毒,動(dòng)物是繁殖病毒的宿主之一。 1.某些病毒用雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)難以繁殖，必需用易感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或本動(dòng)物進(jìn)行繁殖； 2.即使用雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)能夠繁殖的病毒，在研究和生產(chǎn)中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或本動(dòng)物也是必需的，如： （1）強(qiáng)毒株的篩選； （2）制備同源組織臟器苗或高免血清； （3）疫苗各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)：免疫原性或疫苗效力檢驗(yàn)(免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn))、疫苗的安全性試驗(yàn)、毒力返強(qiáng)試驗(yàn)、免疫后抗體消長(zhǎng)曲線的檢

31、測(cè)等。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),1. 動(dòng)物的選擇標(biāo)準(zhǔn),2. 接種方法 根據(jù)病毒及研究目的的不同，可采用不同途徑進(jìn)行接種：皮下、皮內(nèi)、肌肉、靜脈、腹腔和腦內(nèi)等接種方式。,（1）對(duì)相應(yīng)病毒易感； （2）大動(dòng)物，來自非疫區(qū)、最好未接種過相應(yīng)的疫苗、青壯年、健康； （3）家兔、大鼠和小鼠等，應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)； （4）雞應(yīng)為SPF雞或非免疫雞； （5）犬貓應(yīng)品種明確，且符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)； （6）體重、年齡等要基本一致，個(gè)體差異不宜過大。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),復(fù)習(xí)思考題：,1. 簡(jiǎn)述各類疫苗制造的基本流程。 2. 病毒性疫苗(動(dòng)物組織苗、雞胚苗、細(xì)胞苗)。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),第3節(jié) 病毒

32、效價(jià)（滴度）測(cè)定技術(shù),一、血清學(xué)診斷抗原,1.概念：用已知微生物和寄生蟲及其組分、代謝產(chǎn)物、感染動(dòng)物組織制成，用于檢測(cè)血清中的相應(yīng)抗體。 2.用途：這類制劑可與血清中的相應(yīng)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，形成可見的或可以測(cè)知的復(fù)合物，以確診動(dòng)物是否受微生物感染或是否接觸過某種抗原。 3.分類：根據(jù)檢測(cè)方法的不同，分為凝集反應(yīng)抗原、沉淀反應(yīng)抗原、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),二、凝集反應(yīng) 顆粒性抗原(如病原微生物或紅細(xì)胞等)與特異性抗體結(jié)合時(shí)所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。根據(jù)反應(yīng)中附加因素的不同，可分為下述幾種形式： 直接凝集反應(yīng)： 紅細(xì)胞凝集反應(yīng)：病毒顆粒（如流感病毒）上有血凝素，它與某些脊椎動(dòng)物（豚

33、鼠、雞、猴等）的紅細(xì)胞表面上的受體結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)非特異性的凝集。 這種病毒血凝現(xiàn)象可被特異性抗體抑制，產(chǎn)生血凝抑制反應(yīng)。用這種反應(yīng)鑒定病毒型和株以及測(cè)定特異性抗體。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),間接凝集反應(yīng)：將小分子抗原吸附在無關(guān)顆粒（如紅細(xì)胞、乳膠顆粒、活性炭等）上，再與對(duì)應(yīng)抗體作用而出現(xiàn)的凝集反應(yīng)。反之，若將抗體預(yù)先吸附在無關(guān)顆粒上，再與對(duì)應(yīng)抗原作用出現(xiàn)凝集，這叫做反相間接凝集反應(yīng)。例如： 間接血凝反應(yīng)：將抗原成分吸附或結(jié)合在紅細(xì)胞上，然后加入相應(yīng)的抗體，由于抗體與抗原的特異結(jié)合，而把結(jié)合抗原的紅細(xì)胞間接（被動(dòng)）凝集起來,這時(shí)，紅細(xì)胞起到載體的作用，能使微量可溶性抗原與抗體結(jié)合，成為肉眼可見

34、的血凝現(xiàn)象。間接血凝反應(yīng)是檢測(cè)抗體的敏感方法。例如，可用腦膜炎球菌、沙門氏菌的抗原成分、乙型肝炎表面抗原與紅細(xì)胞結(jié)合以檢測(cè)病人血清中相應(yīng)的抗體。 若將特異性抗體結(jié)合于紅細(xì)胞上，通過血凝反應(yīng)檢測(cè)相應(yīng)的抗原，則稱為反向間接血凝反應(yīng)。這是檢測(cè)微量抗原（如毒素、細(xì)菌成分）和早期快速診斷傳染病的敏感方法，現(xiàn)已用于診斷腦膜炎、布魯斯氏菌病、出血熱、病毒性肝炎等。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),三、沉淀反應(yīng) 在有適量電解質(zhì)的情況下，可溶性抗原與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合，形成沉淀物的反應(yīng)。廣泛被應(yīng)用于鑒定混合系統(tǒng)的蛋白組分，鑒定菌型，診斷疾病以及在法醫(yī)學(xué)上鑒定血跡。 凝膠擴(kuò)散：以瓊脂凝膠或其他類似物質(zhì)為介質(zhì)進(jìn)行的沉淀試驗(yàn)。把

35、抗原和抗體分別放在介質(zhì)中，經(jīng)擴(kuò)散后，抗原與抗體相遇處就形成沉淀線。凝膠擴(kuò)散可用于抗原-抗體系統(tǒng)的定性和定量分析。凝膠擴(kuò)散法分為單向和雙向兩類。 對(duì)流免疫電泳：在電場(chǎng)作用下進(jìn)行的雙向凝膠擴(kuò)散。其原理是：在通電的瓊脂中，抗原和抗體向相反的電極移動(dòng),當(dāng)它們?cè)谧钸m宜的比例處相遇時(shí),可形成白色的沉淀線。實(shí)際上，這是一種加速的雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。試驗(yàn)所需時(shí)間短、敏感性高，但特異性較差。一般用于各類蛋白的定性和半定量測(cè)定。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),四、中和試驗(yàn) 將抗體與毒素或病毒結(jié)合，使毒素失去毒性或使病毒失去傳染力的免疫學(xué)試驗(yàn)?？捎靡暂o助診斷疾病，或鑒定病毒、某些未知病原體和毒素等。能在動(dòng)物、雞胚或組織培

36、養(yǎng)中進(jìn)行。 病毒中和試驗(yàn)：用于檢查患過某些病毒疾病或免疫機(jī)體血清中抗體的增長(zhǎng)情況的方法。也可用于鑒定病毒和研究抗原結(jié)構(gòu)。一般用不同稀釋度血清與定量病毒等量混合，放置一定時(shí)間，然后接種到細(xì)胞培養(yǎng)管中，每天觀察細(xì)胞病變，以能抑制細(xì)胞病變的血清最高稀釋度作為終點(diǎn)效價(jià)。這一試驗(yàn)多采用細(xì)胞培養(yǎng)，比動(dòng)物和雞胚試驗(yàn)經(jīng)濟(jì)而方便。中和抗體特異性高，維持時(shí)間較長(zhǎng)，是流行病學(xué)調(diào)查常用的方法。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),五、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 簡(jiǎn)稱酶標(biāo)法，是20世紀(jì)70年代新開展的一項(xiàng)免疫血清學(xué)技術(shù)。當(dāng)抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面時(shí)，仍能保持自己的免疫活性。把抗原或抗體與酶的結(jié)合物再與相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合，即可根據(jù)加入

37、酶底物的顏色來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)。顏色的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量成正比。酶標(biāo)法和放射免疫技術(shù)同是既特異又敏感的方法。 酶標(biāo)法中最常用的是間接法和雙抗體夾心法。間接法用于測(cè)定抗體。雙抗體夾心法用于測(cè)定抗原。 酶標(biāo)法具有特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，原則上可用于檢測(cè)一切抗原、半抗原和抗體。目前已用酶標(biāo)法測(cè)定血清蛋白質(zhì)、腫瘤抗原、激素、藥物、各種微生物和寄生蟲的抗原，以及上述各種抗原所產(chǎn)生的相應(yīng)抗體。在臨床診斷、疾病普查、法醫(yī)鑒定、獸醫(yī)檢查、植物病害檢驗(yàn)等方面應(yīng)用廣泛。,細(xì)胞培養(yǎng)與常用病毒學(xué)技術(shù),六、TCID50、LD50、EID50,將病毒細(xì)胞培養(yǎng)物在滅菌離心管中作連續(xù)10倍稀釋，即取10