設(shè)計培養(yǎng)基的制備的實驗方案

1、設(shè)計培養(yǎng)基的制備的實驗方案制藥1302閆敏一、實驗設(shè)計思想金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach) 是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus）。有“嗜肉菌的別稱?？梢鹪S多嚴重感染。細菌按形態(tài)可分為：球菌，桿菌，和螺旋菌。金黃色葡萄球菌就是球菌的一種。它是革蘭氏陽性菌的代表。革蘭氏陽性菌就是可以被結(jié)晶紫初染，碘液媒染，乙醇脫色，沙黃（紅色）復(fù)染后呈現(xiàn)紫紅色的細菌。而革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色。這些差別源于金黃色葡萄球菌具有陰性菌所沒有的細胞壁結(jié)構(gòu)。金黃色葡萄球菌細胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。相反，陰性菌沒有細胞壁結(jié)構(gòu)

2、。1葡萄球菌屬（Staphylococcus）至少包括有20個種。其中金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，引起許多嚴重感染。典型的金黃色葡萄球菌為球形，直徑0.8m左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽孢、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性。是一種不利于人體的細菌。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37，最適生長pH 7.4。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10%-15%NaCl肉湯中生長。可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽性，VP

3、反應(yīng)弱陽性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。在干燥環(huán)境中存活數(shù)月；空氣中存在，但不繁殖。耐熱性強，加熱701h，8030min不被殺死；耐低溫，在冷凍食品中不易死亡；耐高滲，在含有50%-66%蔗糖或15%以上食鹽食品中才可被抑制，能在15%NaCl和40%膽汁中生長。金黃色葡萄球菌具有較強的抵抗力，對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等高度敏感。 金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界，可以引起人和動物的感染。在人體主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股溝、會陰部和新生兒臍帶殘端等部位，偶爾也寄生于口咽部、皮膚、腸道及陰道口等，是醫(yī)院感染常見的病原體之一。在醫(yī)院里，耐甲

4、氧西林和其他抗生素的金黃色葡萄球菌廣泛流行，對萬古霉素不敏感的菌株也有所增加，給臨床治療帶來了很大的困難。金黃色葡萄球菌除了引起感染外，其產(chǎn)生的腸毒素可污染食物而致食物中毒，為人類帶來非常嚴重的公共衛(wèi)生負擔 包括：原因、研究價值或意義等。二、實驗?zāi)康模ㄍC合實驗）2.1學(xué)習(xí)培養(yǎng)基的制作過程和注意事項。2.2學(xué)習(xí)設(shè)計培養(yǎng)基和倒平板。2.3學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌過程和使用方法。2.4學(xué)習(xí)實驗方案設(shè)計。三、實驗基本流程（可畫流程圖）稱藥品溶解調(diào)pH值融化瓊脂過濾分裝包扎標記滅菌擺斜面或倒平板。四、實驗原理4.1微生物的營養(yǎng)類型光能自養(yǎng)型的微生物可在完全無機的環(huán)境中生長，以CO2為碳源，光做能源，無機物為供

5、H體還原CO2合成細胞有機物質(zhì)的微生物?？梢灾苯永霉饽馨褵o機物轉(zhuǎn)化成自身需要的糖類等有機物，比如藍藻?；茏责B(yǎng)型的微生物可以在完全無機的環(huán)境中生長發(fā)育，以無機化合物氧化為時釋放的能量為能源，以CO2或碳鹽為碳源，合成細胞物質(zhì)的微生物。這類細菌包括硫細菌、硝化細菌、鐵細菌等，硫細菌和硝化細菌與生產(chǎn)密切相關(guān)。所以我們的生活是依賴微生物的。 對于異養(yǎng)型微生物： 光能異養(yǎng)型微生物，這類微生物具有光合色素。能利用光做能源，以有機化合物為供H體，還原CO2，合成細胞物質(zhì)的微生物。光能異養(yǎng)微生物能利用CO2，但必須在有機物存在的條件下，才能生長，人工培養(yǎng)還需供給生長因素。目前已用這類微生物，如紅螺菌來凈化

6、高濃度有機廢水，這對處理污水、凈化環(huán)境，很有發(fā)展前途。 化能異養(yǎng)型微生物，這類微生物以有機化合物為碳源，利用有機化合物氧化過程中產(chǎn)生的能量為能源，以有機或無機含氮化合物為氮源，合成細胞物質(zhì)。由于棲息場所和攝取養(yǎng)料不同，可將異養(yǎng)微生物分為腐生型和寄生型兩大類。 腐生型：利用無生命的有機物獲得營養(yǎng)物質(zhì)。 寄生型：從活的寄生體內(nèi)獲取營養(yǎng)物質(zhì)，如病毒。 中間類型（兼性腐生或兼性寄生）如結(jié)核桿菌、痢疾桿菌就是兼性寄生菌 自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的區(qū)別不在能否利用CO2，而 在于是否以CO2為唯一或主要碳源進行生長。自養(yǎng)型微生物以無機碳化物為碳源，但也可能也可以利用有機物進行生長。異養(yǎng)型微生物雖然也可利

7、用CO2，但必須在有機碳存在情況下。有些微生物在不同生4.2營養(yǎng)進入微生物的方式 擴散(diffusion) 原生質(zhì)膜是一種半透性膜，營養(yǎng)物質(zhì)通過原生質(zhì)膜上的小孔，由高濃度的胞外環(huán)境向低濃度的胞內(nèi)進行擴散。是非特異性的營養(yǎng)物質(zhì)吸收方式。 特點:在擴散過程中，營養(yǎng)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化不消耗能量,不能逆濃度運輸運輸,速率與膜內(nèi)外物質(zhì)的濃度差成正比, 細胞膜的特性、膜上含水小孔的大小和形狀對被擴散的營養(yǎng)物質(zhì)分子的種類、大小有一定的選擇性。物質(zhì)跨膜擴散的能力和速率與物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān),分子量小、脂溶性、極性小的物質(zhì)易通過擴散進出細胞擴散并不是微生物細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要方式,水是唯一可以通擴散自由

8、通過原生質(zhì)膜的分子,脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些氣體分子(O2、CO2)及某些氨基酸在一定程度上也可通過擴散進出細胞。促進擴散易化擴散是膜蛋白介導(dǎo)的被動擴散。物質(zhì)通過膜上的特殊蛋白質(zhì)（包括載體、通道）的介導(dǎo)、順電化學(xué)梯度的跨膜轉(zhuǎn)運過程，其轉(zhuǎn)運方式主要有兩種：一是經(jīng)載體介導(dǎo)的易化擴散。二是經(jīng)通道介導(dǎo)的易化擴散。單純擴散與易化擴散都屬于被動轉(zhuǎn)運，被動轉(zhuǎn)運的主要特點是：轉(zhuǎn)運物質(zhì)過程的本身不需要消耗能量易化擴散是膜蛋白介導(dǎo)的被動擴散。物質(zhì)通過膜上的特殊蛋白質(zhì)（包括載體、通道）的介導(dǎo)、順電化學(xué)梯度的跨膜轉(zhuǎn)運過程，其轉(zhuǎn)運方式主要有兩種：一是經(jīng)載體介導(dǎo)的易化擴散。二是經(jīng)通道介導(dǎo)的易化擴散。單純擴散與易化擴散

9、都屬于被動轉(zhuǎn)運，被動轉(zhuǎn)運的主要特點是：轉(zhuǎn)運物質(zhì)過程的本身不需要消耗能量，是在細胞膜上的特殊蛋白的“幫助”下，順著濃度梯度或電位梯度進行的跨膜轉(zhuǎn)運，是一個“被動”的過程。促進擴散同簡單擴散相比，具有以下一些特點： 促進擴散需要膜蛋白的幫助，并且比簡單擴散的速度要快幾個數(shù)量級。 簡單擴散的速率與溶質(zhì)的濃度成正比，而膜蛋白幫助的促進擴散可以達到最大值，當溶質(zhì)的跨膜濃度差達到一定程度時，促進擴散的速度不再提高。 在簡單擴散中，結(jié)構(gòu)上相似的分子以基本相同的速度通過膜，而在促進擴散中，運輸?shù)鞍拙哂懈叨鹊倪x擇性。如運輸?shù)鞍啄軌驇椭咸烟强焖龠\輸，但不幫助與葡萄糖結(jié)構(gòu)類似的糖類運輸。 與簡單擴散不同，運輸?shù)鞍?/p>

10、的促進擴散作用也會受到各種抑制。膜運輸?shù)鞍椎倪\輸作用也會受到類似于酶的競爭性抑制，以及蛋白質(zhì)變性劑的抑制作用。主動運輸是指物質(zhì)逆濃度梯度，在載體的協(xié)助下，在能量的作用下運進或運出細胞的過程。Na+、K+和Ca2+等離子，都不能自由地通過磷脂雙分子層，它們從低濃度一側(cè)運輸?shù)礁邼舛纫粋?cè)，需要載體蛋白的協(xié)助，同時還需要消耗細胞內(nèi)化學(xué)反應(yīng)（主要為呼吸作用）所釋放的能量。鈉鉀泵實際上就是Na+-K+ATP酶，一般認為是由2個大亞基、2個小亞基組成的4聚體。Na+-K+ATP酶通過磷酸化和去磷酸化過程發(fā)生構(gòu)象的變化，導(dǎo)致與Na+、K+的親和力發(fā)生變化。在膜內(nèi)側(cè)Na+與酶結(jié)合，激活A(yù)TP酶活性，使ATP分解

11、，酶被磷酸化，構(gòu)象發(fā)生變化，于是與Na+結(jié)合的部位轉(zhuǎn)向膜外側(cè)；這種磷酸化的酶對Na+的親和力低，對K+的親和力高，因而在膜外側(cè)釋放Na+、而與K+結(jié)合。K+與磷酸化酶結(jié)合后促使酶去磷酸化，酶的構(gòu)象恢復(fù)原狀，于是與K+結(jié)合的部位轉(zhuǎn)向膜內(nèi)側(cè)，K+與酶的親和力降低，使K+在膜內(nèi)被釋放，而又與Na+結(jié)合。其總的結(jié)果是每一循環(huán)消耗一個ATP；轉(zhuǎn)運出三個Na+，轉(zhuǎn)進兩個K+。鈉鉀泵的一個特性是他對離子的轉(zhuǎn)運循環(huán)依賴自磷酸化過程，ATP上的一個磷酸基團轉(zhuǎn)移到鈉鉀泵的一個天冬氨酸殘基上，導(dǎo)致構(gòu)象的變化。通過自磷酸化來轉(zhuǎn)運離子的離子泵就叫做P-type，與之相類似的還有鈣泵和質(zhì)子泵。它們組成了功能與結(jié)構(gòu)相似的一

12、個蛋白質(zhì)家族。Na+-K+泵作用是：維持細胞的滲透性，保持細胞的體積；維持低Na+高K+的細胞內(nèi)環(huán)境，維持細胞的靜息電位，同時也是動作電位的基礎(chǔ)。烏本苷（ouabain）、地高辛（digoxin）等強心劑能抑制心肌細胞Na+-K+泵的活性；從而降低鈉鈣交換器效率，使內(nèi)流鈣離子增多，加強心肌收縮，因而具有強心作用。鈣離子泵鈣離子泵對于細胞是非常重要的，因為鈣離子通常與信號轉(zhuǎn)到有關(guān)，鈣離子濃度的變化會引起細胞內(nèi)信號途徑的反應(yīng)，導(dǎo)致一系列的生理變化。通常細胞內(nèi)鈣離子濃度（10-7M）顯著低于細胞外鈣離子濃度（10-3M），主要是因為質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在鈣離子轉(zhuǎn)運體系，細胞內(nèi)鈣離子泵有兩類：其一是P型

13、離子泵，其原理與鈉鉀泵相似，每分解一個ATP分子，泵出2個Ca2+。另一類叫做鈉鈣交換器（Na+-Ca2+ exchanger），屬于反向協(xié)同運輸體系（antiporter），通過鈉鈣交換來轉(zhuǎn)運鈣離子。位于肌質(zhì)網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum）上的鈣離子泵是了解最多的一類P型離子泵，占肌質(zhì)網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的90%。肌質(zhì)網(wǎng)是一類特化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，形成網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)位于細胞質(zhì)中，具有貯存鈣離子的功能。肌細胞膜去極化后引起肌質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道打開，大量鈣離子進入細胞質(zhì)，引起肌肉收縮之后由鈣離子泵將鈣離子泵回肌質(zhì)網(wǎng)。質(zhì)子泵質(zhì)子泵有三類：P-type、V-type、F-type。1、P-type：載體

14、蛋白利用ATP使自身磷酸化（phosphorylation），發(fā)生構(gòu)象的改變來轉(zhuǎn)移質(zhì)子或其它離子，如植物細胞膜上的H+泵、動物細胞的Na+ -K+泵、Ca2+離子泵，H+ -K+ATP酶（位于胃表皮細胞，分泌胃酸）。2、V-type：位于小泡（vacuole）的膜上，由許多亞基構(gòu)成，水解ATP產(chǎn)生能量，但不發(fā)生自磷酸化，位于溶酶體膜、動物細胞的內(nèi)吞體、高爾基體的囊泡膜、植物液泡膜上。3、F-type：是由許多亞基構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu)，H+沿濃度梯度運動，所釋放的能量與ATP合成耦聯(lián)起來，所以也叫ATP合酶（ATP synthase），F(xiàn)是氧化磷酸化或光合磷酸化偶聯(lián)因子（factor）的縮寫。F型質(zhì)子

15、泵位于細菌質(zhì)膜，線粒體內(nèi)膜和葉綠體的類囊體膜上。F型質(zhì)子泵不僅可以利用質(zhì)子動力勢將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，也可以利用水解ATP釋放的能量轉(zhuǎn)移質(zhì)子。ABC 轉(zhuǎn)運器ABC轉(zhuǎn)運器（ABC transporter）最早發(fā)現(xiàn)于細菌，是細菌質(zhì)膜上的一種運輸ATP酶（transport ATPase），屬于一個龐大而多樣的蛋白家族，每個成員都含有兩個高度保守的ATP結(jié)合區(qū)（ATP binding cassette），故名ABC轉(zhuǎn)運器，他們通過結(jié)合ATP發(fā)生二聚化，ATP水解后解聚，通過構(gòu)象的改變將與之結(jié)合的底物轉(zhuǎn)移至膜的另一側(cè)。在大腸桿菌中78個基因（占全部基因的5%）編碼ABC轉(zhuǎn)運器蛋白，在動物中可能更多。雖

16、然每一種ABC轉(zhuǎn)運器只轉(zhuǎn)運一種或一類底物，但是其蛋白家族中具有能轉(zhuǎn)運離子、氨基酸、核苷酸、多糖、多肽、甚至蛋白質(zhì)的成員。ABC轉(zhuǎn)運器還可催化脂雙層的脂類在兩層之間翻轉(zhuǎn)，這在膜的發(fā)生和功能維護上具有重要的意義。第一個被發(fā)現(xiàn)的真核細胞的ABC轉(zhuǎn)運器是多藥抗性蛋白（multidrug resistance protein, MDR），該基因通常在肝癌患者的癌細胞中過表達，降低了化學(xué)治療的療效。約40%的患者的癌細胞內(nèi)該基因過度表達。ABC轉(zhuǎn)運器還與病原體對藥物的抗性有關(guān)，如臨床常用的抗真菌藥物有氟康唑、酮康唑、伊曲康唑等，真菌對這些藥物產(chǎn)生耐藥性的一個重要機制是通過MDR蛋白降低了細胞內(nèi)的藥物濃度。

17、協(xié)同運輸協(xié)同運輸（cotransport）是一類靠間接提供能量完成的主動運輸方式。物質(zhì)跨膜運動所需要的能量來自膜兩側(cè)離子的電化學(xué)濃度梯度，而維持這種電化學(xué)勢的是鈉鉀泵或質(zhì)子泵。動物細胞中常常利用膜兩側(cè)Na+濃度梯度來驅(qū)動，植物細胞和細菌常利用H+濃度梯度來驅(qū)動。根據(jù)物質(zhì)運輸方向與離子沿濃度梯度的轉(zhuǎn)移方向，協(xié)同運輸又可分為：同向協(xié)同（symport）與反向協(xié)同（antiport）。1、同向協(xié)同同向協(xié)同（symport）指物質(zhì)運輸方向與離子轉(zhuǎn)移方向相同。如動物小腸細胞對葡萄糖的吸收就是伴隨著Na+的進入，細胞內(nèi)的Na+離子又被鈉鉀泵泵出細胞外，細胞內(nèi)始終保持較低的鈉離子濃度，形成電化學(xué)梯度。在某些

18、細菌中，乳糖的吸收伴隨著H+的進入，每轉(zhuǎn)移一個H+吸收一個乳糖分子。2、反向協(xié)同反向協(xié)同（antiport）物質(zhì)跨膜運動的方向與離子轉(zhuǎn)移的方向相反，如動物細胞常通過Na+/H+反向協(xié)同運輸?shù)姆绞絹磙D(zhuǎn)運H+以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的PH值，即Na+的進入胞內(nèi)伴隨者H+的排出。此外質(zhì)子泵可直接利用ATP運輸H+來調(diào)節(jié)細胞PH值。還有一種機制是Na+驅(qū)動的Cl-HCO3-交換，即Na+與HCO3-的進入伴隨著Cl-和H+的外流，如紅細胞膜上的帶3蛋白。功能主動運輸這種物質(zhì)出入細胞的方式，能夠保證活細胞按照生命活動的需要，主動地選擇吸收所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，排出新陳代謝產(chǎn)生的廢物和對細胞有害的物質(zhì)。可見，主動運輸對于

19、活細胞完成各項生命活動有重要作用。維持細胞內(nèi)正常的生命活動,對神經(jīng)沖動的傳遞以及對維持細胞的滲透平衡,恒定細胞的體積都是非常重要的.主動運輸（active transport):質(zhì)膜上的載體蛋白將離子、營養(yǎng)物和代謝物等逆電化學(xué)梯度從低濃度側(cè)向高濃度側(cè)的耗能運輸。所耗能量由具ATP酶活性的膜蛋白分解ATP提供。例如正常生理條件下，人紅細胞內(nèi)K+的濃度相當于血漿中的30倍，但K+仍能從血漿進入紅細胞內(nèi)，Na+濃度比血漿中低很多，但Na+仍由紅細胞向血漿透出,呈現(xiàn)一種逆濃度梯度的“上坡”運輸。差異有三個主要的差異：起始條件不同、運輸方式不同、產(chǎn)生的結(jié)果不同。主動運輸消耗細胞代謝釋放的能量，被動運輸不

20、4.3選擇培養(yǎng)基的原則等。（一）配制培養(yǎng)基的4個原則1.目的明確 培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件；培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同； 例如枯草芽孢桿菌： 一般培養(yǎng)：肉湯培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基； 自然轉(zhuǎn)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基； 觀察芽孢：生孢子培養(yǎng)基； 產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基； 根據(jù)不同的工作目的，微生物不同的營養(yǎng)需要，運用自己豐富的生物化學(xué)和微生物學(xué)知識來配制最佳的培養(yǎng)基。 2.營養(yǎng)協(xié)調(diào) 微生物細胞組成元素的調(diào)查或分析，是設(shè)計培養(yǎng)基時的重要參考依據(jù)。 微生物細胞內(nèi)各種成分間有一較穩(wěn)定的比例。 在大多數(shù)化能異養(yǎng)菌的培養(yǎng)基中，各營養(yǎng)要素間在量上的比例大體符合以下十倍序列的遞減規(guī)

21、律： 要素：H2OC源+能源 N 源 P、SK、Mg生長因子 含量：(10-1) (10-2) (10-3) (10-4) (10-5) (10-6)A.選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì),實驗室的常用培養(yǎng)基： 細菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）； 放線菌：高氏1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)； 酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基； 霉菌：查氏合成培養(yǎng)基； 實驗室一般培養(yǎng)：普通常用培養(yǎng)基； 遺傳研究：成分清楚的合成培養(yǎng)基； 生理、代謝研究：選用相應(yīng)的培養(yǎng)基配方； B.營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適 營養(yǎng)物質(zhì)的濃度適宜, 營養(yǎng)物質(zhì)之間的配比適宜； 高濃度糖類物質(zhì)、無機鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進微生物的生長，反而起 到抑制或殺

22、菌作用。培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和（或）代謝產(chǎn)物的形成和積累，其中碳氮比（CN）的影響較大。真菌需CN比較高的培養(yǎng)基；（素食） 細菌（動物病原菌）需CN比較低的培養(yǎng)基；（葷食） 發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時： 碳氮比為4/1時，菌體大量繁殖，谷氨酸積累少； 碳氮比為3/1時，菌體繁殖受到抑制，谷氨酸產(chǎn)量則大量增加。 NH3 CO(NH2)2 NH4NO3 (NH4)2CO3 (NH4)2SO4 含氮量（82）（46） （35） （29.2） （21） 這說明在同樣重量時，在以上各氮源中含氮量以氨為最高，尿素次之，硝酸銨和碳酸銨更次之，而硫酸銨則最低。 3.理化適宜 指培養(yǎng)

23、基的pH值、滲透壓、水活度和氧化還原電勢等物理化學(xué)條件較為適宜。 包括：pH、滲透壓和水活度、氧化還原電位(1) pH 各大類微生物都有其生長適宜的pH范圍，培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。 通常培養(yǎng)條件：（初始pH ） 細菌： pH 7.0-8.0 藻類： pH 6.0-7.0 酵母菌： pH 3.8-6.0 放線菌：pH 7.5-8.5 霉菌：pH 4.0-5.8 原生動物： pH 6.0-8.0 嗜極菌（extremophiles） 在微生物的生長、代謝過程中會產(chǎn)生引起培養(yǎng)基pH改變的代謝產(chǎn)物，為了維持培養(yǎng)基 pH的相對恒定，通常要進行p

24、H的調(diào)節(jié)。 pH的調(diào)節(jié)包括pH的內(nèi)源調(diào)節(jié)和pH的外源調(diào)節(jié)。 a.pH的內(nèi)源調(diào)節(jié):通過培養(yǎng)基內(nèi)在成分所起的調(diào)節(jié)作用，就是pH的內(nèi)源調(diào)節(jié)。 第一種是采用磷酸緩沖液進行調(diào)節(jié)。 K2HPO4/KH2PO41時，溶液的pH穩(wěn)定在6.8。調(diào)節(jié)K2HPO4和KH2PO4兩者濃度比可獲得pH 6.07.6間的一系列穩(wěn)定的pH。 反應(yīng)原理：K2HPO4HClKH2PO4KCl KH2PO4KOHK2HPO4H2O 第二種以CaCO3作“備用堿”進行調(diào)節(jié)。CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培養(yǎng)基中分布不均勻）、NaHCO3均可用來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。 反應(yīng)是：b.pH的外源調(diào)節(jié): 這是一類按實際需要不斷從外界流加

25、酸或堿液，以調(diào)整培養(yǎng)液的方法。(2) 滲透壓和水活度 滲透壓（osmotic pressure）是某水溶液中一個可用壓力來量度的一個物化指標。 它表示兩種濃度不同的溶液間被一個半透性薄膜隔開時，稀溶液中的水分子會因水勢（water potentiality）的推動而透過隔膜流向濃溶液，直到濃溶液產(chǎn)生的機械壓力足以使兩邊水分子的進出達到平衡為止，這時由濃溶液中的溶質(zhì)所產(chǎn)生的機械壓力，即為它的滲透壓值。 與微生物細胞滲透壓相等的等滲溶液最適宜微生物的生長； 高滲溶液會使細胞發(fā)生質(zhì)壁分離； 低滲溶液則會使細胞吸水膨脹，形成很高的膨壓，這對細胞壁脆弱或喪失的各種缺壁細胞，例如原生質(zhì)體、球狀體或支原體來

26、說，則是致命的。 水活度即aw（wateractivity）是一個比滲透壓更有生理意義的一個物化指標。它表示在天然或人為環(huán)境中，微生物可實際利用的自由水或游離水的含量。各種微生物生長繁殖范圍的aw值在0.9980.6之間：（3）氧化還原電勢（redox potential） 又稱氧化還原電位，是度量某氧化還原系統(tǒng)中還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢的一種指標。 一般以Eh表示，它是指以氫電極為標準時某氧化還原系統(tǒng)的電極電位值，單位是V（伏）或mV（毫伏）。不同類型微生物生長對氧化還原電位的要求不同: 好氧性微生物：+0.1伏以上時可正常生長，以+0.3+0.4伏為宜； 厭氧性微生物：低于+0.

27、1伏條件下生長； 兼性厭氧微生物：+0.1伏以上時進行好氧呼吸，+0.1伏以下時進行發(fā)酵。氧化還原電位與氧分壓和pH有關(guān),也受某些微生物代謝產(chǎn)物的影響: 增加通氣量(如振蕩培養(yǎng)、攪拌)提高培養(yǎng)基的氧分壓，或加入氧化劑，從而增加Eh值在培養(yǎng)基 中加入巰基乙醇、抗壞血酸（Vc，0.1%）、硫化氫(0.025%)、半胱氨酸（0.05%）、谷胱甘肽、鐵 屑、二硫蘇糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等還原性物質(zhì)可降低Eh值。 測定氧化還原電勢除用電位計外，還可在培養(yǎng)基中加入化學(xué)指示劑刃天青（resazurin） 進行間接測定 刃天青在無氧條件下呈無色（Eh-40 mV）；在有氧條件下，其顏色與溶液的pH相關(guān)；（中性

28、紫色；堿性藍色；酸性紅色）；在微量氧時，它呈粉紅色。 4.經(jīng)濟節(jié)約 配制培養(yǎng)基時應(yīng)盡量利用廉價且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成份,特別是在發(fā)酵工業(yè)中,以降低生產(chǎn)成本。 (1)以粗代精：對微生物來說，各種粗原料營養(yǎng)更加完全，效果更好。而且在經(jīng)濟上也節(jié)約。大量的農(nóng)副產(chǎn)品或制品，如麩皮、米糠、玉米漿、酵母浸膏、酒糟、豆餅、花生餅、蛋白胨等都是常用的發(fā)酵工業(yè)原料。 (2)以“野”代“家”： 以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉質(zhì)的野生植物，可以部分取代糧食用于工業(yè)發(fā)酵的碳源。 (3)以廢代好：以工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中易污染環(huán)境的廢棄物作為培養(yǎng)微生物的原料。 例如，糖蜜(制糖工業(yè)中含有蔗糖

29、的廢液)、乳清(乳制品工業(yè)中含有乳糖的廢液)、 豆制品工業(yè)廢液、黑廢液(造紙工業(yè)中含有戊糖和己糖的亞硫酸紙漿)等。 工業(yè)上的甲烷發(fā)酵主要利用廢水、廢渣作原料,在我國農(nóng)村，已推廣利用糞便及禾草為原料發(fā)酵生產(chǎn)甲烷作為燃料。 (4)以簡代繁：某制藥廠改進鏈霉素發(fā)酵液中的原有配方，設(shè)法減去30-50%的黃豆餅粉、25%的葡萄糖和20%硫酸銨，結(jié)果反而提高了產(chǎn)量。 (5)以氮代朊：以大氣氮、銨鹽、硝酸鹽或尿素等一類非蛋白質(zhì)或非氨基酸廉價原料用作發(fā)酵培養(yǎng)基的原料，讓微生物轉(zhuǎn)化成菌體蛋白質(zhì)或含氮的發(fā)酵產(chǎn)物供人們利用。 (6)以纖代糖：開發(fā)利用纖維素這種世界上含量最豐富的可再生資源。將大量的纖維素農(nóng)副產(chǎn)品轉(zhuǎn)變

30、為優(yōu)質(zhì)飼料、工業(yè)發(fā)酵原料、燃料及人類的食品及飲料。 (7)以“國”代“進”： 以國產(chǎn)原料代替進口原料，盡量減少工業(yè)成本。國內(nèi)青霉素發(fā)酵工業(yè)的迅速發(fā)展，依賴于找到了富有中國特色的培養(yǎng)基配方，即用廉價的棉子餅（或花生餅）和白玉米粉代替玉米漿和乳糖。 五、實驗藥品及儀器天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3g 蛋白胨 5g 氯化鈉 10g 瓊脂520g pH 7.0-7.2 水 1000mL

31、 甘露醇瓊脂酵母膏5g 蛋白胨 3g 甘露醇25g 瓊脂15g 蒸餾水 1000ml 7.5%氯化鈉肉湯蛋白胨 10.0g 牛肉浸粉 5.0g 氯化鈉 75.0g pH值7.40.1 25 Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)（鑒別）蛋白胨10.0g 牛肉浸粉5.0g 酵母浸粉1.0g 丙酮酸鈉10.0g 氯化鋰5.0g 瓊脂15.0g pH值7.00.225 甘氨酸12.0g用法稱取本品58.0g,加熱攪拌溶解于950ml蒸餾水中,分裝每瓶95ml,121高壓滅菌15分鐘,臨用前加熱溶化瓊脂,冷至50左右,于每95ml培養(yǎng)基中加入常溫解凍的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5ml搖勻后傾入無菌平皿。使用前在冰箱

32、貯存不得超過48h。質(zhì)量控制和典型特征在361培養(yǎng)45-48h,金黃色葡萄球菌的單個菌落呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤,直徑2-3mm?；液谏梁谏?有光澤,常有淺色（非白色）的邊緣,周圍繞以不透明圈（沉淀）,其外常有一清晰帶。添加劑亞碲酸鹽卵黃增菌液用法稱取本品90.0g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,分裝三角瓶或試管,121高壓滅菌15分鐘,備用。Baird-Parker培養(yǎng)基在含有氮源的基礎(chǔ)上，補充了促進細菌生長的丙酮酸鈉，又含有抑制劑：亞碲酸鉀，故有較好的選擇性。但對于金葡萄球菌沒有抑制，其能將亞碲酸鉀還原為碲在菌落中心呈黑色，易于觀察；加入卵黃，由于卵磷酯酶陽性特征，其菌落周圍可出現(xiàn)

33、明顯的沉淀環(huán)。 利用選擇性培養(yǎng)基進行常見致病菌的分離是致病菌檢測中的重要部分。六、實驗步驟6.1 培養(yǎng)基的制備6.1.1 稱量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準確稱取各種藥品，放入適當大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。6.1.2 溶解 用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補足水分。6.1.3 調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至

34、所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計等。6.1.4 溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補足水分(水需預(yù)熱)。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。6.1.5 過濾分裝 分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞，引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。6.1.6 包扎標記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日

35、期等。6.1.7 滅菌 上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時進行滅菌。普通培養(yǎng)基為12120min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。6.1.8 倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到4550,立刻倒平板。其過程是：在酒精燈火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰，目的是消滅瓶口的雜菌，防止雜菌感染培養(yǎng)基；左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，立刻蓋上皿蓋。待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置，目

36、的是防止培養(yǎng)基冷卻過程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。6.2、滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內(nèi) 蛋白質(zhì)凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。6.2.1 濕熱滅菌 煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸。對于細菌的營養(yǎng)體煮沸約1530min，對于芽孢則需煮沸約12h。高壓蒸汽滅菌法：高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實驗中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2