血型的鑒定方法及操作課件

1、血型的鑒定方法及操作,紅細胞血型系統(tǒng)及其檢測,血型的鑒定方法及操作,血型的發(fā)現(xiàn),1900年，ABO血型系統(tǒng) 1940年，Rh血型系統(tǒng) Karl Landsteiner,血型的鑒定方法及操作,血型（blood type),狹義地講，存在于紅細胞上的特異性同種抗原。 廣義地講，是人類遺傳多態(tài)性的一種表現(xiàn)，血液中各種成分都有其各自型別。,血型的鑒定方法及操作,紅細胞血型（系統(tǒng)，抗原）,是存在于紅細胞上的化學結構，化學本質是糖和多肽，是紅細胞膜上的跨膜蛋白。 存在于紅細胞膜上（完全抗原），也存在于上皮細胞以及各種體液和分泌液中（半抗原）。,RBC,存在于體液、分泌液中,血型的鑒定方法及操作,紅細胞血型

2、抗體,天然抗體、免疫抗體 規(guī)則抗體、不規(guī)則抗體 完全抗體，不完全抗體 同種抗體，自身抗體,血型的鑒定方法及操作,天然抗體和免疫抗體,天然抗體：ABO血型系統(tǒng)中，A型個體血漿中天然存在抗B，B型個體血漿中存在抗A。多數天然抗體是IgM型，最佳反應溫度為室溫或更低。 免疫抗體：一般通過輸血、妊娠、注射三種方式接受抗原刺激，多數免疫抗體是IgG型，最佳反應溫度是37oC。,血型的鑒定方法及操作,天然抗體和免疫抗體特性比較,血型的鑒定方法及操作,血型的鑒定方法及操作,規(guī)則抗體和不規(guī)則抗體,規(guī)則抗體：ABO系統(tǒng)產生抗、抗是有規(guī)律的。 Landsteiner規(guī)律： 型抗，型抗，型抗，抗 不規(guī)則抗體：除AB

3、O 系統(tǒng)外，其他系統(tǒng)產生的抗體均不符合上述規(guī)律。 正常人血液中一般沒有不規(guī)則抗體，又稱為意外抗體（unexpected antibody）。,血型的鑒定方法及操作,完全抗體和不完全抗體,完全抗體：在鹽水介質中能凝集紅細胞抗體，多為IgM抗體。 不完全抗體：能使紅細胞致敏，但在鹽水質中不能凝集紅細胞，需要通過抗球蛋白法或其他非鹽水介質法進行檢測，多為IgG抗體。,抗IgG,血型的鑒定方法及操作,同種抗體、自身抗體,同種抗體：針對患者缺乏的抗原所產生的抗體即為同種抗體，如Rh陰性者輸血后產生的抗抗體。 自身抗體：針對自身抗原產生的抗體，如引起自身免疫型溶血性貧血。,血型的鑒定方法及操作,紅細胞血型

4、,紅細胞血型分類： ISBT（The International Society of Blood Transfusion) 2002年，29個系統(tǒng)，200多個抗原 目前，30個系統(tǒng)，300多個抗原,血型的鑒定方法及操作,一、ABO血型系統(tǒng)1. ABO血型抗原和抗體特性,血型的鑒定方法及操作,2.ABO血型的遺傳與生化,（1）ABO基因型與表型 A型AA，AO B型BB，BO AB型AB O型O A，B是顯性基因，O是隱性基因 ABO基因不是產生ABO抗原的遺傳密碼,血型的鑒定方法及操作,（2）ABO血型的生化合成,H基因 L-fucocyltransferase，19chr A基因 N-ac

5、etyl-0-galactosaminyltransferase，9chr B基因galactosyltransferase, 9chr O基因無效基因，不產生轉移酶，O型紅細胞含有H物質,基因,酶,合成抗原,血型的鑒定方法及操作,思考：A、B、AB型紅細胞是否存在H物質？,血型的鑒定方法及操作,（3）ABH可溶性抗原形成,分泌型血型物質：ABH抗原存在于紅細胞、內皮細胞、血小板、淋巴細胞、上皮細胞等，也可出現(xiàn)在除腦脊液外的分泌液中，唾液中最豐富。 Se，se基因與體液分泌有關，Se編碼 L-fucocyltransferase，形成分泌液中的H抗原，H也可轉化為A或B抗原，Se不影響紅細胞上

6、ABH形成，Se為分泌型；se為非分泌型；19chr。,血型的鑒定方法及操作,分泌型血型物質的意義：,在RBC抗原弱表達個體中確定ABO血型。 檢測唾液、羊水中的血型物質，輔助鑒定血型和預測胎兒血型。 能中和天然抗體（IgM），有助鑒別Ab性質。,血型的鑒定方法及操作,3.ABO亞型：,亞型：同一血型抗原的結構、性能（質）或抗原位點數（量）存在一定差異。 A亞型：A1，A2，A3，Ax，Ay，Am B亞型：B1，B2，B3，Bx，Bm,血型的鑒定方法及操作,二、Rh血型系統(tǒng),1940年，Landerstein和Wiener用恒河猴（rhesus）RBC免疫家兔或豚鼠，得到一種抗體，可與85%白

7、種人紅細胞發(fā)生反應。 Rh系統(tǒng)有50個抗原，最復雜，重要性僅次于ABO血型。,血型的鑒定方法及操作,1.遺傳與發(fā)育規(guī)律,胎兒早期充分發(fā)育，臍帶血/新生兒紅細胞同成人。 基因位于1chr，分別命名為RHD，RHCE，RHD編碼D抗原，RHCE編碼不同組合的CE抗原，ce，cE，Ce，CE。,血型的鑒定方法及操作,血型的鑒定方法及操作,2.命名和種類,三種命名方式 Fisher-Race、數字命名法、現(xiàn)代命名法,血型的鑒定方法及操作,Fisher-Race命名法（CDE命名法）,血型的鑒定方法及操作,3.Rh血型種類,D、E、C、e、c 抗原的強弱次序 DECce,血型的鑒定方法及操作,5.Rh抗

8、體,Rh抗體產生 天然抗體罕見 主要通過輸血和妊娠免疫產生IgG 初次免疫后36月出現(xiàn)，再次免疫后3周達高峰 Rh抗體種類 抗D，抗E，抗C，抗c，抗e,血型的鑒定方法及操作,ABO和Rh血型系統(tǒng)的臨床意義,安全輸血的主要保證 新生兒溶血病的診斷 器官移植的必要條件 其他：遺傳學研究，法醫(yī)學鑒定,血型的鑒定方法及操作,四、ABO和Rh血型鑒定,常用方法： 鹽水介質法、酶介質法、抗人球蛋白法、聚凝胺法 試管法、玻片法、微柱凝膠法,血型的鑒定方法及操作,1.鹽水介質法（salt medium test）,原理：根據IgM類抗體與紅細胞膜上特異性抗原能發(fā)生凝集反應。 正定型：已知血型抗體試劑 + 紅

9、細胞 反定型：已知標準紅細胞 + 血清,鑒定紅細胞上血型抗原,鑒定血清中抗體,血型的鑒定方法及操作,反應條件：生理鹽水介質，室溫，肉眼可見凝集反應 平板法，試管法，微孔板法，試管離心法最可信賴。 應用：ABO血型定型、RhD抗原定型（IgG+IgM，IgM單克隆抗體），交叉合血,血型的鑒定方法及操作,結果判斷,血型的鑒定方法及操作,注意事項（一）：,標準血清：健康壯年人混合血清，培養(yǎng)細胞株的單克隆抗體 要求： 高效價：抗A、抗B1：128 高親和性：15s內出現(xiàn)凝集，3min后凝集塊 1mm2 單克隆抗體具有檢出A2，A2B的能力 冷凝集素效價 1：4 無菌，病毒滅活,血型的鑒定方法及操作,注

10、意事項（二）：,紅細胞試劑：三個健康者同型新鮮紅細胞混合，用生理鹽水洗滌三次。 紅細胞懸液不能過濃或過淡，5%生理鹽水紅細胞懸液,血型的鑒定方法及操作,注意事項（三）：,所有器材清潔干燥 一般先加血清，后加紅細胞 反應溫度：IgM抗體反應最適溫度為40C，為防止冷凝集素干擾，采用室溫，370C反應減弱 離心時間和速度：3000g,30s 反定型不宜用玻片法 結果核對，避免筆誤 正、反定型結果一致才能報告，否則查找原因,血型的鑒定方法及操作,正反定型不一致的可能原因（一）：,操作技術上的錯誤：主要原因 離心過度或不足 細胞與血清反應比例不適當 陽性反應產生溶血現(xiàn)象而未能識別 漏加試劑、結果判讀錯

11、誤等,血型的鑒定方法及操作,正反定型不一致的可能原因（二）：,出現(xiàn)假陰性的常見原因： 某些白血病患者和難治性貧血等導致ABO抗原減弱； 免疫系統(tǒng)尚未健全的新生兒、4月6月內嬰兒、抗體水平下降的老人； 亞型紅細胞抗原性弱，難以檢出； 低丙種球蛋白血癥患者，血清定型時不凝集或弱凝集。,血型的鑒定方法及操作,正反定型不一致的可能原因（三）,出現(xiàn)假陽性的常見原因： 紅細胞出現(xiàn)多凝集現(xiàn)象； 嚴重腸道革蘭氏陰性桿菌感染，可使紅細胞獲得類B現(xiàn)象； 異常的血漿蛋白升高、白蛋白/球蛋白異常，高濃度纖維蛋白原造成假凝集現(xiàn)象； 待檢血清中有不規(guī)則抗體存在； 右旋糖酐、靜脈注射某些造影劑等引起紅細胞 類似凝集。,血型

12、的鑒定方法及操作,方法學評價,簡單，靈敏度低，只適合IgM抗體 試管法：需時短，離心增強凝集，可發(fā)現(xiàn)亞型和較弱的反應，正、反定型皆適合 玻片法：適合大規(guī)模血型普查，反應時間長，有時漏掉弱反應，反定型不適合。,血型的鑒定方法及操作,2.酶介質法（enzymic medium test）：,原理和方法：主要用于Rh血型鑒定（IgG抗體）,蛋白水解酶,增強IgG抗體的凝集作用,血型的鑒定方法及操作,注意事項：,Rh血型不需作反定型 每次實驗均需作陽性、陰性對照,血型的鑒定方法及操作,方法學評價,簡單經濟 穩(wěn)定性、準確性較差，不能檢出MN、Duffy血型系統(tǒng),血型的鑒定方法及操作,3.抗人球蛋白實驗（

13、Coombs test）,原理和方法,抗IgG,待測紅細胞 + 抗RhD（IgG） + 抗人球蛋白,紅細胞凝集,血型的鑒定方法及操作,應用延伸：,檢測紅細胞同種抗體的經典方法，新生兒溶血、病、溶血性輸血反應、自身免疫性溶血性貧血 直接Coombs（direct antiglobulin test, DAT） 間接Coombs（indirect antiglobulin test, IDAT）,血型的鑒定方法及操作,DAT：檢查紅細胞是否致敏,血型的鑒定方法及操作,IDAT：檢測血清中不完全抗體,血型的鑒定方法及操作,4.聚凝胺介質法（polybrene test）,原理和方法 低離子強度鹽溶液

14、（low ionic strength salt solution, LISS)：降低介質離子強度，增加抗原抗體結合 聚凝胺：中和紅細胞表面負電荷，使紅細胞發(fā)生非特異性凝集。 重懸液（resuspension),血型的鑒定方法及操作,方法學評價,適于各類抗體（IgM，IgG） 快速、靈敏、可靠 對檢測Kell血型系統(tǒng)抗體不理想，不能用肝素抗凝。,血型的鑒定方法及操作,5.微柱凝膠法(gel cards with microtubes),1986年法國人Dr. Yves Lappierre發(fā)明 1994年，獲美國FDA認證,血型的鑒定方法及操作,原理和方法,葡聚糖做成微型凝膠柱，上端為反應室，下

15、端凝膠柱為抗原抗體凝集反應的介質。 抗原與抗體結合后離心，經過凝膠分子篩作用，游離紅細胞在凝膠底部，而與抗體結合凝集的紅細胞位于凝膠上部或懸浮于凝膠中。,反應室,凝膠柱,血型的鑒定方法及操作,結果判讀：,陽性結果：紅細胞凝集塊位于凝膠表面或凝膠中，和（或）出現(xiàn)溶血。,血型的鑒定方法及操作,注意事項：,專用水平離心機 假陽性：鐮型紅細胞、巨幼紅細胞 白細胞過多 纖維蛋白原未完全去除 細菌污染，血漿蛋白異常 假陰性：抗原抗體比例不合適 不適用于直接Coombs陽性的紅細胞標本、酶處理的紅細胞標本,血型的鑒定方法及操作,方法學評價,靈敏度和準確性高，實驗結果重復性好，可長時間保存 自動化程度高，實驗過程標準化，ISO9000/CE認證 成本高,血型的鑒定方法及操作,應用延伸：用于ABO正反定型，交叉配血、其他血型抗原檢測（CcEe）、不規(guī)則抗體檢測、Coombs實驗,凝膠柱,中性膠,抗人球蛋白膠,特異性膠,血型的鑒定方法及