第十六章 色譜法概論

1、1,第16章 色譜分析法概論An Introduction to Chromatography,授講人：黃紅霞辦公室：理工1號樓319室Tel: （0571）88204325 Mail: ,2,Show Time,俄國植物學(xué)家Tsweet,色譜法是一種能夠把不同顏色混合物中的顏色分離出來的方法,3,內(nèi) 容,發(fā)展概況 色譜法及分類 分離機(jī)制 色譜理論,4,1 色譜法發(fā)展概況,一、色譜法歷史 Before 1930s：色素的分離 色譜法(Chromatography ）創(chuàng)始于20世紀(jì)初，俄國植物學(xué)家Tsweet 用于植物色素的分離 。,石油醚流動相 (mobile phase ，eluant, e

2、luent) CaCO3顆粒固定相（stationary phase） 相對運(yùn)動,Chromatography 又稱“層析法”,洗脫液,色素色帶,洗脫液, 廢水,5,1940s: 薄層色譜(TLC)和紙色譜法,紙色譜法,6,1950s: James和Martin發(fā)表了從理論到實(shí)踐比較完整的氣相色譜法(GC) ，獲得諾貝爾化學(xué)獎色譜法從單一的分離功能到分離 分析功能 以島津GC為例,1956年，第一臺GC-1A,2004年，GC-2014,50年35個型號,7,1960s: 高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜，出現(xiàn)了高效液相色譜法（HPLC） 1980s: Jorgenson等集前人經(jīng)驗(yàn)發(fā)展起來

3、的毛細(xì)管電泳(CE),8,優(yōu)點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣”,局限性：,高選擇性 高效能: 分析效率高 高靈敏度: 10-11-10-13g，適合痕量分析 分析速度快: 1-10分鐘分析時間 應(yīng)用范圍廣: 氣體、液體、固體樣品,二、色譜法特點(diǎn),定性、定結(jié)構(gòu)的特異性低，需要與其它的分析方法相結(jié)合（如GC-AAS，LC-MS）,分離和分析,9,三、色譜法現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢,HPLC-MS,GC-IR,增強(qiáng)自動化，建立各種聯(lián)用技術(shù),用于復(fù)雜樣品的分析，如中藥分析或代謝組學(xué),新型固定相和檢測器，如UPLC，ELSD檢測器，電霧式檢測器和熒光檢測器等,10,石油 陸婉珍院士,中山大學(xué) 酶填充,農(nóng)藥、食品和藥

4、物安全,功能化材料,極端條件（航空航天，深海）,大連化物所盧佩章院士 張玉奎院士,南開大學(xué) 納米材料,11,一、色譜法定義 是一種物理化學(xué)分析方法，利用不同溶質(zhì)（樣品）與固定相和流動相之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別，當(dāng)兩相做相對移動時，各溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次平衡，使各溶質(zhì)達(dá)到相互分離。,固定相,固體,液體,流動相,液體,氣體,2 色譜法及分類,12,二、分類,平面色譜法,紙色譜 薄層色譜（TLC） 高分子薄膜色譜,柱色譜法,填充柱色譜 毛細(xì)管柱色譜 開管柱色譜,1、操作形式,*柱色譜法: 固定相裝于柱管內(nèi), 流動相在壓力或重力作用下流動 *平面色譜法：固定相構(gòu)成平面狀層,流動相在

5、毛細(xì)管或重力作用下流動,13,2. 分離機(jī)制 (1) 吸附色譜: 被分離組分對固定相表面吸附中心的吸附能力 (2) 分配色譜 : 在固定相和流動相兩相之間的分配系數(shù)差別 (3) 離子交換色譜:被分離組分離子交換能力 (4) 分子排阻色譜:被分離組分分子的線團(tuán)尺寸或滲透系數(shù)大小,14,3. 兩相分子聚集狀態(tài),15,4. 系統(tǒng)分類,Chromatogr.,GC,LC,Supercritical fluid chromatography (SFC),open tubular column chromatography,packed column chromatography,column chrom

6、atography,planar chromatography,counter-current chromatography,Classic LC,HPLC,TLC,PC,16,色譜的分離過程,如吸收色譜，組分在兩相中的平衡過程： 吸附 解吸 再吸附 再解吸 反復(fù)洗脫 不同的分配系數(shù) 遷移率差 分離,四、基本術(shù)語,17,1. 色譜圖：檢測器輸出的信號強(qiáng)度對洗脫時間作圖所繪制的曲線 2. 色譜峰：組分流經(jīng)檢測器所產(chǎn)生的信號,（一）色譜和色譜峰,3. 基線（baseline）: 在操作條件下，沒有組分流出時的流出曲線. 穩(wěn)定的基線應(yīng)是一條平穩(wěn)直線，反映儀器的噪聲隨時間的變化,基線漂移,18,4.

7、峰形參數(shù)： 對稱因子（fs ）,fs 1.05，拖尾峰,fs 為0.95-1.05稱為對稱峰,W0.05h為0.05倍色譜峰高處的色譜峰寬,色譜峰三種形式：,19,（二）保留值,保留時間（ tR）：進(jìn)樣開始到某組分的色譜峰定點(diǎn)的時間間隔 死時間（t0或tm)：不被固定相吸附或溶解的組分(k=0）的保留時間。根據(jù)t0可求流動相平均流速,20,2. 保留體積, VR: 對稱峰，組分1/2量被洗脫出色譜柱時消耗的流動相體積。與流動相流速無關(guān),死體積,V0:柱中固定相顆粒間間隙的容積,調(diào)整保留體積, ：保留體積扣除死體積后的體積,調(diào)整保留時間， :組分在固定相中滯留的時間，是定性的基本條件,流速,注意

8、：VR是定值，tR與FC成反比,21,3. 相對保留值, r: 兩組分的調(diào)整保留值之比, 也稱分離因子，是色譜系統(tǒng)的分離選擇性指標(biāo),4. 保留指數(shù), I: Kovats 指數(shù)，氣相色譜中的定性參數(shù),注意：r與固定相和柱溫相關(guān)，與柱徑、柱長、流動相流速等無關(guān),z與z+n為正構(gòu)烷烴對的碳原子數(shù) ，Z為6，7，8，I為600，700，800,22,（三） 色譜峰高, h和峰面積, A（定量分析指標(biāo)） （四）色譜峰區(qū)域?qū)挾?衡量柱效的重要參數(shù)之一,三種方法： 1.標(biāo)準(zhǔn)差 (standard deviation ; )：0.607倍峰高處的峰寬之半/半峰寬 2.半峰寬（W1/2）：W1/2=2.355

9、3.峰寬 (peak width; W): W=4 =1.699W1/2,區(qū)域?qū)挾仍叫≈г礁?23,（五）分離度 (resolution，R),又稱分辨率，是總分離效能指標(biāo)，能真實(shí)反映組分在色譜柱中的分離情況 相鄰兩組分色譜峰保留時間之差與兩色譜峰峰寬均值之比,24,當(dāng) R=1.5，兩峰完全分開(99.7%)，又稱基線分離. R1.5 藥物定量分析要求（中國藥典2010版規(guī)定）.,25,四、分配系數(shù)和色譜分離,(一) 分配系數(shù)和保留因子 分配系數(shù),（二）分配系數(shù)和保留因子與保留時間關(guān)系,兩者關(guān)系,保留因子,v=L/tR,u=L/t0,tR=t0(1+ k) tR=t0(1+K ),26,注意

10、： 保留因子表示組分在色譜柱中多停留的時間與死體積的比值,K，tR K=0，組分無保留 K ，組分保留時間長,27,（三）色譜分離的前提,KAKB 或kAkB 是色譜分離的前提。,推導(dǎo)過程：,28,色譜圖的意義： 色譜峰數(shù)樣品中單組分的最少個數(shù)； 色譜保留值定性依據(jù)； 色譜峰高或面積定量依據(jù)； 色譜保留值或區(qū)域?qū)挾壬V柱分離效能評價指標(biāo)； 色譜峰間距固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。 和k是計算分離效能的重要參數(shù)！,29,（一）吸附色譜 （二）分配色譜 （三）離子交換色譜 （四）分子排阻色譜,3 分離機(jī)制,30,（一）吸附色譜,固定相吸附劑（硅膠or Al2O3）吸附活性中心 機(jī)制：見圖 組分

11、分子與流動相分子爭奪吸附中心,吸附系數(shù),吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,Note：Ka 與 組分的性質(zhì)，活性劑的活性和流動相性質(zhì)有關(guān),柱色譜中,吸附色譜法,固定相 多為吸附劑，如硅膠、氧化鋁。 硅膠表面硅醇基為吸附中心。 經(jīng)典液相柱色譜和薄層色譜：一般硅膠 高效液相色譜：球型或無定型全多孔硅膠和堆積硅珠。 氣相色譜：高分子多孔微球等,吸附色譜法,流動相 有機(jī)溶劑（硅膠為吸附劑） 洗脫能力：主要由其極性決定。 強(qiáng)極性流動相占據(jù)吸附中心的能力強(qiáng)，洗脫能力強(qiáng)，使k值小，保留時間短。 Snyder溶劑強(qiáng)度o：吸附自由能，表示洗脫能力。o值越大，固定相對溶劑的吸附能力越強(qiáng)，即洗脫能力越強(qiáng)。,

12、一些溶劑在硅膠上的o值,洗脫順序 ka=KaSa/Vm 在色譜柱（Sa與Vm一定）時，Ka大的組分保留強(qiáng)，后被洗脫，Ka小的組分在吸附劑上保留弱，先被洗脫。 Ka與組分的性質(zhì)（極性、取代基的類型和數(shù)目、構(gòu)型有關(guān)）。,吸附色譜法,35,（二）分配色譜,固定相: 涂漬在惰性載體顆粒上的一薄層液體 流動相: 氣體或液體 機(jī)制：見圖 與萃取類似,分配系數(shù),Note：Ka 與 流動相性質(zhì)，固定相極性和柱溫有關(guān),分配色譜法,固定相 又稱固定液（涂漬在惰性載體顆粒上的一薄層液體；化學(xué)鍵合相（通過化學(xué)反應(yīng)將各種有機(jī)基團(tuán)鍵合到載體上形成的固定相）。,流動相 氣液分配色譜法：氣體，常為氫氣或氮?dú)狻?液液分配色譜法

13、：與固定相不相溶的液體。 正相液液分配色譜：流動相的極性弱于固定相的極性。 反相液液分配色譜：流動相的極性強(qiáng)于固定相的極性。,分配色譜法,洗脫順序 由組分在固定相或流動相中溶解度的相對大小而決定。,正相液液分配色譜：極性強(qiáng)的組分后被洗脫。（庫侖力和氫鍵力）。,反相液液分配色譜：極性強(qiáng)的組分先出柱。,38,（三）離子交換色譜,固定相：離子交換樹脂和化學(xué)鍵合離子交換 流動相: 緩沖溶液 分析: 離子化合物(有機(jī)或無機(jī)離子) 機(jī)制 見圖 離子交換能力差異,陽離子交換樹脂 RSO3-H+ + X+ RSO3-X+ + H+,陰離子交換樹脂 RNR3+OH- + X- NR3+X- + OH-,39,選

14、擇性系數(shù)與分配系數(shù)關(guān)系,離子交換通式,KA/B是離子對樹脂親和能力相對大小的度量，KA/B越大，A的交換能力大，越易保留。 常選擇某種離子（如H+或Cl）作參考。 KA、 KB為A、B的分配系數(shù)。,離子交換色譜法,固定相 離子交換樹脂: 有網(wǎng)狀骨架及可離解、可交換基團(tuán)，如磺酸基 (SO3H) 、羧基 (COOH) 及季胺基 (NR3+OH) 等。性能指標(biāo)常用交聯(lián)度、交換容量和粒度等。 化學(xué)鍵合離子交換劑：鍵合在薄殼型和全多孔微粒硅膠上。用于HPLC中的固定相 流動相一定pH和離子強(qiáng)度的緩沖溶液，有時也加入少量有機(jī)溶劑，如乙醇、四氫呋喃、乙腈等，以提高選擇性。,離子交換色譜法,影響保留行為的因素

15、被分離離子、離子交換劑、流動相的性質(zhì)等 (1) 離子的電荷和水合半徑：價態(tài)高選擇性系數(shù)大。同價陽離子在酸性陽離子交換劑上,水合離子半徑, 選擇性系數(shù)小。 (2)離子交換劑的交聯(lián)度和交換容量:一定的范圍內(nèi)樹脂的交聯(lián)度越大，交換容量越大，則組分保留時間越長。 (3)流動相的組成：交換能力強(qiáng)的離子組成的流動相有較強(qiáng)的洗脫能力。流動相的離子強(qiáng)度高，使組分的保留值降低。,42,（四）分子排阻色譜法,固定相: 多孔性凝膠 流動相: 水（凝膠過濾色譜)；有機(jī)溶劑(凝膠滲透色譜),又稱空間排阻色譜或凝膠色譜法,機(jī)制 見圖 分子大小或滲透系數(shù)大小差異,滲透系數(shù),Note：Kp 與溶質(zhì)分子的大小和凝膠孔徑有關(guān)，與

16、流動相無關(guān),（0Kp1 ）,空間排阻色譜法,流動相 要求：能溶解試樣、潤濕凝膠，粘度要低 水溶性試樣選擇水溶液為流動相(稱為凝膠過濾色譜；GFC)； 非水溶性試樣選擇四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑為流動相 (凝膠滲透色譜；GPC)。,空間排阻色譜法,保留體積與滲透系數(shù)的關(guān)系,VmV0,分子線團(tuán)尺寸（分子量）大的組分，其滲透系數(shù)小，保留體積也小，因而先被洗脫出柱。,45,小結(jié),色譜過程方程式：,分配系數(shù)大的組分保留時間長（保留體積大），晚流出色譜柱。,K在分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜和凝膠色譜中，分別為狹義分配系數(shù)K、吸附系數(shù)Ka、選擇性系數(shù)KA/B和滲透系數(shù)Kp， Vs分別為

17、色譜柱（或薄層板）內(nèi)固定液體積、吸附劑表面積、離子交換劑總交換容量和凝膠孔內(nèi)總?cè)莘e。,46,3 色譜理論,1.熱力學(xué)理論塔板理論 由平衡的觀點(diǎn)來研究分離過程，是一種半經(jīng)驗(yàn)理論 2.動力學(xué)理論速率理論 從動力學(xué)觀點(diǎn)，即速度來研究各種動力學(xué)因素對柱效的影響，以Van Deemter 方程式為代表,47,一、塔板理論,（一）基本假設(shè),在一個塔板高度H內(nèi)，組分可以在兩相中瞬間達(dá)到分配平衡； 流動相非連續(xù)進(jìn)入色譜柱，且每次進(jìn)入一個塔板體積； 忽略樣品沿柱方向的縱向擴(kuò)散； 分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。,（二）二項式分布,色譜過程與逆流萃取是相似的,在各塔板內(nèi)組分符合二項式展開式：,如N=3,(ms+mm)N

18、,轉(zhuǎn)移N次后，第r號塔板中的質(zhì)量Nmr：,例：轉(zhuǎn)移3次后，在第2號塔板內(nèi)的溶質(zhì)分?jǐn)?shù),49,2、兩組分的分離,A(kA=1)和B(kB=0.5)兩組分 （分布圖）,結(jié)果： 組分B: k=0.5, 當(dāng)N=6和7時，柱出口產(chǎn)生B的濃度最大點(diǎn)；組分A：k=1，N=8和9時，柱出口處達(dá)到濃度最大點(diǎn)。 兩組分開始分離，k小的組分B在柱后先出現(xiàn)濃度極大值, 即先出柱。,組分A(kA=1)在n=5的色譜柱內(nèi)和出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.12

19、5 0 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 5 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.032 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 8 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.137 9 0.002 0.018 0.072 0.166 0.247 0.137 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124,52,k=1的組分從n=5色譜柱中的流出曲線圖,N 柱出口 0

20、 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0.032 6 0.079 7 0.118 8 0.137 9 0.137 10 0.124,53,（三）流出曲線方程,討論：,當(dāng)塔板數(shù)很大時（n50），流出曲線趨于正態(tài)分布曲線。,t=tR時，C有極大值：,Cmax即流出曲線的峰高h(yuǎn)。 一定時， 峰高h(yuǎn)取決于C0。 C0一定時， 峰高h(yuǎn)取決于。,流出曲線方程的常用形式：,不論ttR或ttR時，濃度C恒小于Cmax。 C隨時間t向峰兩側(cè)對稱下降。 越小，峰越銳。 是柱效的標(biāo)志。,色譜峰面積,以A代替C0，h代替Cmax，且W1/2=2.355 ，,峰面積:,A = h(2)1/2,A=1.065W1/2

21、h,色譜定量的參數(shù),56,（四）柱效,理論塔板高度（H）和理論板數(shù)（n）,n越大，柱效越高； 如果用 計算理論板數(shù)，所得值為有效理論板數(shù)neff,理論板數(shù)取決于 固定相種類、性質(zhì)、填充狀況和柱長； 流動相及其流速； 被測物性質(zhì)等。,L一定，h與n呈反比，即H越小，柱效越高,Heff 有效板高,色譜柱效參數(shù),57,例題,有效理論塔板數(shù)和有效理論塔板高度,Hef =L/nef,59,塔板理論的局限性,塔板理論在解釋流出曲線的性狀、濃度極大點(diǎn)的位置及評價色譜柱柱效等方面是成功的。但是 1）假設(shè)不現(xiàn)實(shí)，傳質(zhì)和縱向擴(kuò)散被忽略。 2）不能說明影響塔板高度有哪些主要因素，即影響峰擴(kuò)張的原因。 3）不能解釋柱

22、效隨流動相流速改變而不同的原因。 4）不能說明影響柱效有哪些主要因素。,60,二、速率理論,速率理論是把色譜過程看作一個動態(tài)過程，研究過程中的動力理學(xué)因素對峰展寬的影響。 HPLCGiddings方程式 GCVan Deemeter方程式,u為載氣的線速度cm/s； A、B和C是影響峰擴(kuò)張的三項因素。,H = A + B/u + Cu,塔板高度,渦流擴(kuò)散項,縱向擴(kuò)散項,傳質(zhì)阻抗項,61,Relationship between velocity and n,62,(一)影響H 的動力學(xué)因數(shù)1. 渦流擴(kuò)散項,色譜柱填料粒徑大小不等，填充不均勻，使同一個組分的分子經(jīng)過多個不同長度的途徑流出色譜柱,一些分子沿較短路徑運(yùn)行，較快通過色譜柱；而一些分子沿較長的路徑運(yùn)行，發(fā)生之后，結(jié)果色譜峰展寬,63,柱子填料粒子越小，渦流擴(kuò)散系數(shù)越小 dp小， A?。坏玠p 太小， 和柱阻大。,填充柱60100目 開管柱（0.10.5mm），A=0，高柱效 如毛細(xì)管柱,64,(一)影響H 的