高效液相色譜培訓ppt課件

1、HPLC的使用與維護,.,基本原理和特點 液相色譜儀器部件 實驗操作與應用 日常維護,.,基本原理和特點,基本原理：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時,由于與 固定相(stationary phase)發(fā)生作用(吸附,分配,離子吸引,排阻,親和)的大小,強 弱不同,在固定相中滯留時間不同,從而先后從固定相中流出. 特點：分離效率高、分析速度快、應用范圍廣、操作自動化。,.,一些商品化儀器,脫氣裝置,四元泵,檢測器,柱溫箱,樣品盤,控溫箱,流動相,.,啟動液相色譜儀器的流程,開啟HPLC系統(tǒng)各個設備的電源 打開泵、自動進樣器、檢測器電源， 待設備通過自檢后，打開計算機啟

2、動 色譜管理軟件 準備流動相 過濾，脫氣 色譜泵排氣 用新配制的流動相灌注泵,.,高效液相色譜儀組成,輸液系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng),.,液相色譜流程圖,.,.,液相色譜的流動相,.,液相柱-保留值與pH的關系,pH變化值 0.1,RS變化值1.6,色譜柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流動相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 溫度： 50 流速： 1.0mL/min.,.,2. 流動相類別,按流動相組成分：單組分和多組分 按極性分：極性、弱極性、非極性 按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫,.,對溶劑的要求,水：

3、去離子水 自動純水儀 純凈水 商品瓶裝水 溶劑: 色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇） 試劑: 分析純,.,不管采用何種途徑，配制流動相應用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間越短。 理想的HPLC用水應為18.2的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。,.,過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。 脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對測定的影響： 1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積 2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形 3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動,過濾與脫氣,.,.,.,流

4、動相的保存,有機溶劑流動相： 室溫下密封，避光保存 緩沖鹽流動相： 當日現(xiàn)配現(xiàn)用： 低溫下密封保存，一般不超過3天 防止微生物生長 有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相： 低溫密封保存 防止有機相的揮發(fā) 選用適宜的容器,.,1梯度洗脫的特點,（1）改善分離, 加快分析速度； （2）改善峰形, 減少拖尾, 有利于痕量組分的檢測； （3）增加峰容量； （4）強烈滯留的組分不容易殘留在柱上, 保持柱性能長期良好； （5）下次分析時, 流動相需要一段平衡時間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異, 可能會引起基線漂移,.,2梯度洗脫的主要條件, A 流動相/弱溶劑組成； B 流動相/強溶劑組成； 梯度時間；

5、梯度曲線：線性、凸型或凹型等。,.,梯度洗脫,.,.,梯度：低壓混合,低壓梯度 用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合 對脫氣要求高 不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積 如設計不當，梯度的準確性受影響 滯后體積（系統(tǒng)體積）設計合理,.,梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響,注意滯后體積包括進樣器、阻尼 器、混合器及其管路,.,梯度滯后大小的影響,滯后體積太大會引起梯度變化的延遲 例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min 實際梯度會比設置值晚 2 分鐘響應，沒有問題 對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min 實際梯度會比設置值晚20 分鐘響應，不能接受 滯后體積的不同會使方法轉換麻煩 滯后體積比文獻大或

6、小都會使方法不能重現(xiàn) 滯后體積的變化會導致梯度重現(xiàn)性不好 普通分析型液相色譜的滯后體積為24ml,.,滯后體積變化的影響,設計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化 滯后體積隨反壓變化的后果： 梯度的準確性不好，造成：方法的適應性不好 用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性,.,液相色譜的色譜柱,.,.,色譜柱的連接,Stop_depth長度不合適造成柱前死體積,.,錐箍錐度不合適造成滲漏,色譜柱的連接,.,除去柱上端固定相變色部分 (約3mm左右)，再補充新的固定相。 色譜柱吸附未被洗脫成分時，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進行洗凈。 采用梯度洗脫時，柱在重復使用前，用泵把幾倍于柱體

7、積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生。,可能提高柱效的方法,.,HPLC檢測器應提供的功能,對樣品有響應并有一個輸出信號 應該提供在檢測器響應值與樣品濃度之間的線性關系；并且所設計的校正技術應該促進這種關系,.,理想的HPLC檢測器,高靈敏度；可忽略的基線噪音 寬的線性范圍 獨立于流動相及操作參數(shù)的響應 對壓力、溫度及流速等變化不敏感 長時間操作的穩(wěn)定性 低死體積 非破壞性 選擇性,.,靈敏度：信噪比,靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N） 檢測限（LOD）：S/N = 24 定量限（LOQ）：S/N = 810 好的信噪比有利于： 更好的色譜峰確認 更好的

8、定量 更好地完成色譜峰純度/均一性,6:1,N,S,.,吸光度（Absorbance UV/Vis）檢測,目前實驗室中最流行的選擇 多數(shù)公司約75%的檢測器是吸光度檢測器（其中50%是多波長，25%是PDA） 測量通過溶液后的紫外或可見光光強度的損失 吸光度與樣品濃度呈線性關系 在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大,.,吸光度檢測器（UV/Vis） 優(yōu)點,這種檢測器簡單、可靠 多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術 可以作梯度實驗并且是非破壞性的 大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度 一般來說靈敏度還可以,.,吸光度檢測器（UV/Vis） 缺點,由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器 對某些化合

9、物的檢測靈敏度不及其他檢測器 樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長 受流動相組成的影響： 用截止波長以上至少510nm作為工作波長 緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響,.,背景吸收對紫外檢測器噪音的影響,UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank,.,溶劑混合的基線噪音,色譜條件 色譜柱： C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C. 流動相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile. 梯度：

10、5 - 40% B in 35 min. 流速： 1.0 mL/min. 樣品： 水（10 L inj. vol.） 檢測： 214 nm,.,為何如此重要？,五個小肽的5ng進樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個峰則消失在基線噪音中。,.,基線噪音對積分的影響,.,維護流程圖,吸濾頭,單向閥,柱塞密封圈,線路過濾器,進樣器,檢測器,.,吸濾頭定期清洗，更換溶劑時 單向閥定期清洗，壓力波動大時 泵自動清洗 在線過濾器壓力大時清洗,.,材料：不銹鋼燒結，孔徑10um 故障：堵塞 表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成 措施：用5稀硝酸，超聲波清洗， 再用蒸餾水清洗,吸濾頭,.,.

11、,.,故障：寶石球或塑料墊片受污導致密封不好 表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大 措施： 打開排液閥，以異丙醇為流動相輸液 拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波清洗,單向閥,.,故障：堵塞 現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力 偏高 措施：5稀硝酸，超聲波清洗 判斷依據(jù)：關閉排液閥，斷開出口管路，設定流速1mL/min，如壓力3kgf/cm2，則堵塞。,線路過濾器,.,泵的保養(yǎng)：,使用流動相盡量要清潔； 進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗； 流動相交換時要防止沉淀； 避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡； 每次分析結束后，要反復沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染；,.,柱的保養(yǎng)：,柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動； 當柱子和色譜儀聯(lián)結時，閥件或管路一定要清洗干凈； 要注意流動相的脫氣； 避免使用高粘度的溶劑作為流動相； 進樣樣品要提純； 嚴格控制進樣量； 每天分析工作結束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品； 每天分析測定結束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗?若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉；,.,色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時間,單次樣品運行時間 = 分析時間 + 色譜柱平衡時間 色譜柱平衡時間 = 10倍柱內(nèi)體積 流速,.,色譜柱清洗保存 反相色譜柱：用20%甲醇溶液清洗10個柱體積，保存在90%的甲醇溶液中。 分