菊花的組織培養(yǎng)

1、課題1 菊花的組織培養(yǎng),菊 花 的 品 種 繁 多,菊花是菊科菊屬的多年生宿根草本植物,是我國的傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一。 長期以來菊花采用分株、扦插等無性繁殖方法進(jìn)行繁殖。但是傳統(tǒng)的繁殖方法易受環(huán)境影響,繁殖周期長,隨著市場需求的急劇增加,已經(jīng)不能滿足市場日益發(fā)展的需要。,植物組織培養(yǎng)屬于無性生殖中營養(yǎng)生殖 營養(yǎng)生殖包括：,扦插,嫁接,壓條,植物組織培養(yǎng)：,當(dāng)植物細(xì)胞脫離了原來所在植物體的器官或組織而處于離體狀態(tài)時(shí)，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素（細(xì)胞分裂素、生長素）和其他外界條件（溫度、pH、光照、無菌等）的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株，這種培育新植株的方法，叫做植物的組織培養(yǎng)。

2、,20世紀(jì)初，曾有人提出能否將植物的薄壁細(xì)胞培養(yǎng)成完整植株？研究者從胡蘿卜根的韌皮部取下一塊組織，并在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其分化出了愈傷組織，從愈傷組織又得到胚狀體，胚狀體轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)后，獲得了完整的胡蘿卜試管植株。經(jīng)過栽培，此植株能夠正常生長并開花結(jié)果，其種子繁衍出來的后代與正常植株的種子所繁衍出的后代別無二致。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)可以得出以下結(jié)論：即不經(jīng)過有性生殖過程也能將植物的薄壁細(xì)胞培養(yǎng)出與母體一樣的完整植株。由于植物的每個(gè)有核細(xì)胞都攜帶著母體的全部基因，故在一定條件下，它們均能發(fā)育成完整植株，這就是所謂的植物細(xì)胞全能性。,植物組織培養(yǎng)發(fā)展簡史,科學(xué)家在植物激素對器官建成，及改進(jìn)培

3、養(yǎng)基配方等方面所取得的成果，極大地推動(dòng)了組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，使這項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)際應(yīng)用于快速繁殖、品種改良等方面。20世紀(jì)50年代初期，法國科學(xué)家利用組織培養(yǎng)技術(shù)成功地脫除了染病大麗花植株所攜帶的病毒，從而為脫毒苗的生產(chǎn)提供了一種可行的途徑?，F(xiàn)在憑借組織培養(yǎng)技術(shù)來脫除植物的病毒已經(jīng)在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)50年代中期，由于細(xì)胞分裂素的發(fā)現(xiàn)，使組織培養(yǎng)狀態(tài)下外植體芽的形態(tài)建成成為可人為調(diào)控的因素，從而使在組織培養(yǎng)狀況下進(jìn)行植株再生成為現(xiàn)實(shí)。進(jìn)入60年代以后，組織培養(yǎng)技術(shù)在基礎(chǔ)理論、實(shí)際操作方面不斷取得進(jìn)展，相繼在植物體細(xì)胞雜交、單倍體育種、種質(zhì)資源保存、快速育苗、人工種子制造、次生代謝物生產(chǎn)等方面

4、有了可喜的成果。時(shí)至今日，組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為基礎(chǔ)堅(jiān)實(shí)、易于掌握、應(yīng)用面廣的一種技術(shù)手段。,（一）植物組織培養(yǎng)的 理論基礎(chǔ),概念：高度分化的植物細(xì)胞，仍然具有發(fā)育成 完整新個(gè)體的潛能。 基礎(chǔ)：生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所 特有全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整 個(gè)體所必需的全部基因。因?yàn)樗鼈兌际?由同一個(gè)受精卵細(xì)胞有絲分裂分化而來。,基礎(chǔ)知識：,細(xì)胞全能性,細(xì)胞全能性的特點(diǎn)： 高度分化的植物細(xì)胞在離體的情況下，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他適宜的外界條件下，才能表現(xiàn)其全能性。 動(dòng)物已分化的體細(xì)胞全能性受限制，但細(xì)胞核仍具有全能性,植物細(xì)胞要表現(xiàn)全能性，步驟： 1.成熟細(xì)胞 分生細(xì)胞 胚狀體 完

5、整植株 2.成熟細(xì)胞 愈傷組織 出根出芽完整植株,需要條件： 1.離體 2.一定的營養(yǎng)物質(zhì) 3.植物激素：主要是生長素和細(xì)胞分裂素 4.適宜溫度和pH,細(xì)胞全能性大小： 受精卵生殖細(xì)胞體細(xì)胞 植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞 分化程度低的細(xì)胞分化程度高的細(xì)胞,植物組織培養(yǎng)過程：,離體的植物器官 組織或細(xì)胞,植物體,脫分化 （細(xì)胞分裂）,愈傷組織,芽,根,細(xì)胞分裂素生長素,細(xì)胞分裂素生長素,再分化,植物組織培養(yǎng),不需要光,需要光,（細(xì)胞分化）,脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫（去）分化 。,離體的植物組織或細(xì)胞，在培養(yǎng)了一段時(shí)間后，會通過細(xì)胞分裂，形成愈傷組織。,方式

6、：有絲分裂,脫分化就是有絲分裂的過程。,愈傷組織：由離體的植物器官、組織或細(xì)胞，通 過細(xì)胞分裂形成的細(xì)胞團(tuán)，叫做愈傷 組織。 特點(diǎn)：細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化；呈 無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。,再分化：由脫分化產(chǎn)生的愈傷組織重新分化形成根或芽等器官的過程，叫做再分化。,再分化就是細(xì)胞分化過程。,細(xì)胞分化,細(xì)胞分化：在植物的個(gè)體發(fā)育過程中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程，叫做細(xì)胞分化。 細(xì)胞分化的特點(diǎn)： 持久性:細(xì)胞分化貫穿于生物體整個(gè)生命進(jìn)程中,在胚胎期達(dá)到最大限度 穩(wěn)定性和不可逆性:一般來說,分化了的細(xì)胞將一直保持分化后的狀態(tài),直到死亡 普遍性:生物界普遍存在,是生物個(gè)體發(fā)

7、育的基礎(chǔ),細(xì)胞分化的實(shí)質(zhì): 在個(gè)體發(fā)育過程中，不同細(xì)胞中遺傳信息的執(zhí)行情況不同，即基因的選擇性表達(dá) 細(xì)胞分化的結(jié)果： 在空間上細(xì)胞之間出現(xiàn)差異，在時(shí)間上同一細(xì)胞和它以前的狀態(tài)有所不同。 最終形成新的個(gè)體,細(xì)胞分化的意義： 生物個(gè)體發(fā)育的基礎(chǔ)；細(xì)胞分化使多細(xì)胞生物體中的細(xì)胞趨向?qū)ｉT化，有利于提高各種生理功能的效率。,（1）不同的植物，培養(yǎng)的難易程度差別很大：,煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易；,枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難；,（2）同一種植物材料的年齡、保存時(shí)間的長 短等也會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝。,（二）影響植物組織培養(yǎng)的因素：,1植物材料的影響：,主

8、要是大量元素和微量元素的影響。,無機(jī)營養(yǎng)的影響：,A大量元素: N、P、 K、 Ca、Mg 、 S等；,B微量元素: B、Mn、Cu、Zn、 Fe、Mo、I、Co等,其中： 、主要影響蛋白質(zhì)、核酸的合成； K、 Ca、Mg、S主要影響酶的活性。,主要是甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖的影響。,3有機(jī)營養(yǎng)的影響：,其中： 蔗糖既是碳源也是調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)； 維生素能促進(jìn)細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)器官分化； 甘氨酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是有機(jī)氮源。,4溫度、光照、pH的影響：,光照： 菊花每日用日光燈照射12h。,溫度： 大多數(shù)植物組織培養(yǎng)控制在2327， 低于15時(shí)植物組織會表現(xiàn)生長停止； 高于35時(shí)對植物

9、生長不利。 菊花的組織培養(yǎng)控制在1822。,pH： 不同植物對培養(yǎng)基最適pH的要求不 同，大多數(shù)控制在56.5。 菊花的組織培養(yǎng)控制在5.8左右。,常用的植物激素： 生長素、細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。 在生長素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈加強(qiáng)的趨勢。 激素的使用順序、使用量及比例影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向。,5植物激素的影響：,生長素、細(xì)胞分裂素和 赤霉素。,生長素類：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。,細(xì)胞分裂素類：,激動(dòng)素（KT）、6芐基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）等。,赤霉素類：,赤霉酸（GA3）

10、等,作用：2，4D有利于愈傷組織的生長； IAA、NAA、IBA有利于器官分化。,作用：促進(jìn)細(xì)胞的分裂與分化，其中KT能 明顯促進(jìn)芽的分化而抑制根的形成。,作用：促進(jìn)不定芽和幼株伸長。,有利于根的分化，抑制芽的形成,有利于芽的分化，抑制根的形成,促進(jìn)愈傷組織的形成,激素的使用順序、使用量及比例影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向：,先使用生長素，后使用細(xì)胞分裂素,有利于細(xì)胞分裂，但不利分化,先使用細(xì)胞分裂素，后使用生長素,同時(shí)使用,細(xì)胞既分裂也分化,分化頻率提高,菊花的組織培養(yǎng)程序：,制備MS固體培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)流程圖：,課外拓展,MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，其特

11、點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營養(yǎng)和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。 基于此，這種培養(yǎng)基就用他們的名字來命名了。,MS培養(yǎng)基主要成分：,大量元素: N、P、 K、 Ca、 S 、 Mg等,微量元素: B、Mn、Cu、Zn、 Fe、Mo、I、Co等,有機(jī)物：甘氨酸、煙酸、肌醇、 維生素、蔗糖等,植物激素：生長素、細(xì)胞分裂素、 赤霉素等,微生物培養(yǎng)基的配方和MS培養(yǎng)基的配方相比，有哪些明顯的不同？,微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同， MS培養(yǎng)基則需提供大量無

12、機(jī)營養(yǎng)，無機(jī)鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。,（一）制備MS固體培養(yǎng)基：,MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實(shí)驗(yàn)室一般使用4保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備。,1配制各種母液：,無機(jī)物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮 100倍，常溫保存。,激素類、維生素類以及用量較小的有機(jī)物一 般可按1mg/mL的質(zhì)量濃度單獨(dú)配制成母液。,用母液配制培養(yǎng)基時(shí)，需要根據(jù)各種母液的 濃縮倍數(shù)，計(jì)算用量。,實(shí)驗(yàn)操作,2配制培養(yǎng)基：,分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50mL或100mL。, 配制培養(yǎng)液：配制1LMS培養(yǎng)基時(shí)，先將稱好的瓊 脂加入800mL蒸餾水，加熱使瓊脂熔化，然后加入 蔗糖30g，取配制好的

13、大量元素、微量元素、有機(jī) 物和植物激素的母液，依次加入，加蒸餾水定容 至1000mL。, 調(diào)pH：,培養(yǎng)基的分裝:,由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因 此不必添加植物激素。,3滅菌：,將分裝好的培養(yǎng)基連同其他 器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。,1選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝。,（二）外植體消毒：,2消毒：, 流水沖洗：,菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右。, 酒精處理：,用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70的酒精中搖動(dòng)23次，持續(xù)67s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗。, 消毒液處理：,取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放

14、入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1的氯化汞溶液中12min，取出后，在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液。,(外植體：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。),（三）接種：,接種前用體積分?jǐn)?shù)為70的酒精將工作臺擦拭一遍，然后點(diǎn)燃酒精燈。因?yàn)槲廴镜闹饕獊碓词强諝庵械募?xì)菌和孢子。,1接種室消毒：,2無菌操作要求：,所有的接種操作都必須在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌。,3材料的切取和接種：,將消過毒的菊花莖段在無菌培養(yǎng)皿中切成0.51cm的小段，用鑷子夾取菊花莖段接種。,4接種注意事項(xiàng)：, 每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分?jǐn)?shù)為 70的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火 焰上燒一遍，冷卻后再接

15、種。, 外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植 體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿 卜34塊，菊花68塊，也不要太少，以 充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件。, 插入時(shí)應(yīng)注意莖段方向，形態(tài)學(xué)上端朝上， 形態(tài)學(xué)下端朝下，不要倒插。莖段、莖尖 基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分。,（四）培養(yǎng)：,接種后的錐形瓶最好放在無菌箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間應(yīng)定期消毒。培養(yǎng)溫度控制在1822。 每日用日光燈光照12h。,（五）移栽：,1打開封口膜： 移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日。一般放置在2025的遮蔭環(huán)境中，適應(yīng)57d。試管苗不萎蔫，有新生長的趨勢，便可移栽。,2清洗轉(zhuǎn)

16、移：,用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時(shí)間。,3移栽：,待幼苗長壯后再移栽到土壤中。,珍珠巖： 珍珠巖是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經(jīng)急劇冷卻而成的玻璃質(zhì)巖石，有弧形或圓形裂隙，如珍珠的結(jié)構(gòu)，所以被命名為珍珠巖 。,蛭石： 是一種天然、無毒的礦物質(zhì)，在高溫作用下會膨脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。,（六）栽培：,將幼苗移栽后，每天觀察記錄幼苗生長情況，適時(shí)澆水、施肥，直至開花。,1、培養(yǎng)基的配置。要根據(jù)不同的材料，不同的物種，選擇合適的培養(yǎng)基，最好有一組實(shí)驗(yàn)取得。做培養(yǎng)基的過程中注意調(diào)劑培養(yǎng)基的PH值，有些高溫分解的激素要過濾滅菌等。 2、培養(yǎng)

17、材料的選擇，需要選擇生長較好材料,植物組織培養(yǎng)的注意事項(xiàng)：,3 嚴(yán)格無菌操作 ，無菌技術(shù)是植物組織培養(yǎng)獲得成功關(guān)鍵。 1）無菌技術(shù)包括對培養(yǎng)基、器械、和植物材料的滅菌消毒。對培養(yǎng)材料進(jìn)行表面消毒時(shí)，一方面要考慮到要藥劑消毒效果，另方面要考慮到植物材料的耐受性。 2）妥善處理被污染培養(yǎng)物。 3）有毒物質(zhì)要妥善處理，以免造成環(huán)境污染。 外植體可以用酒精消毒；操作前手需用酒精消毒；培養(yǎng)基 需用高壓蒸汽滅菌。,4接種時(shí)注意： 1）每接種一塊外植體前，鑷子要放入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中消毒一次，然后再酒精燈火焰上燒灼一遍，冷卻后再接種。 2）外植體在培養(yǎng)基重要分布均勻，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照

18、條件。 3）插入時(shí)應(yīng)注意方向，不要倒插。莖段 莖尖基部插入培養(yǎng)基有利于吸收水分和養(yǎng)分。 4）接種后幾十個(gè)瓶蓋好瓶蓋，做好標(biāo)記，寫明接種材料，接種日期。 5、培養(yǎng)條件的選擇，包括光照、溫度、濕度等。,植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：,1.不受生長季節(jié)限制地繁殖植物。 2.不攜帶病毒。 3.培養(yǎng)周期短。 4.可用組培中的愈傷組織制取特殊的生化制品。 5.可短時(shí)間大量繁殖，用于拯救瀕危植物。 6.可誘導(dǎo)之分化成需要的器官，如根和芽。 7.解決有些植物產(chǎn)種子少或無的難題。如將香蕉進(jìn)行組培得到人工種以方便移種。,植物組織培養(yǎng)的用途：,快速繁殖優(yōu)良植物株系 培育作物新品種 獲得無病植株 保存和運(yùn)輸種質(zhì),CNgeli認(rèn)為在生殖細(xì)胞成分中可區(qū)別為二種，其中在雌雄兩生殖細(xì)胞中等量存在的為遺傳的基本物質(zhì)稱