植物組織培養(yǎng)無(wú)病毒苗培養(yǎng)ppt課件

1、第六章無(wú)細(xì)小病毒植物的培育，1、教學(xué)目的和要求，(1)了解植物病毒病的危害和無(wú)細(xì)小病毒植物的培育意義。 (2)理解和掌握消除植物病毒病的原理和方法。 (3)分離莖尖及培養(yǎng)方法。 (4)掌握無(wú)毒苗木的鑒定方法。 (5)掌握脫毒苗木的保存和利用方法。 2、第一節(jié)植物病毒病危害和培育無(wú)細(xì)小病毒植物的意義，細(xì)小病毒的原因是消耗細(xì)胞球養(yǎng)分，不能通過(guò)毒素殺死細(xì)胞球，而是利用細(xì)胞球內(nèi)的物質(zhì)繁殖，干擾細(xì)胞球的代謝過(guò)程，在細(xì)胞球內(nèi)產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞正常功能有害的異常物質(zhì)和條件， 植物病毒病病防治比其他植物病害防治困難，給生產(chǎn)帶來(lái)災(zāi)難損失，三、一、植物病毒病危害、植物病毒病已超過(guò)600種，嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。 在果樹、蔬菜

2、、花卉、林木及農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)。 隨著生產(chǎn)栽培時(shí)間的推移，危害越來(lái)越嚴(yán)重，發(fā)現(xiàn)的細(xì)小病毒種類也越來(lái)越多。 4、細(xì)小病毒癥狀、5、6、危害園藝植物的細(xì)小病毒數(shù)，7如感染菊花的細(xì)小病毒和類細(xì)小病毒有19種，如子細(xì)小病毒(CAV )潛在細(xì)小病毒(CLV) B細(xì)小病毒(CVB )輕斑病毒(CVB ) 等4種細(xì)小病毒對(duì)草莓生產(chǎn)有重大影響的：斑細(xì)小病毒(SMoV )草莓黃邊細(xì)小病毒(SMYEV )草莓鑲嵌脈沖細(xì)小病毒(SVBV )草莓可麗餅細(xì)小病毒(SCrV )、9、甘薯多用戶多輸入多輸出根腐病.甘薯多用戶多輸入多輸出葉點(diǎn)病、甘薯枯萎病(特異性強(qiáng)病毒除外) 對(duì)于有性生殖退化只能用無(wú)性繁殖法繁殖的植物，一旦感染

3、就會(huì)無(wú)奈何。 母株患病后，細(xì)小病毒在其細(xì)胞球內(nèi)增殖，通過(guò)插枝、剪穗、種薯、球根、鱗片傳到下一代。 以昆蟲為媒介加速傳播。11、植株脫細(xì)小病毒的意義、植物組織培養(yǎng)脫細(xì)小病毒技術(shù)是植物細(xì)胞工程的重要組成部分，脫毒種苗的生產(chǎn)在提高作物質(zhì)量和產(chǎn)量方面顯示出很大潛力，良種、新品種脫毒組培苗大面積推廣應(yīng)用，有效地解決了細(xì)小病毒引起的品種退化問(wèn)題。 因此，植物組培脫毒技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的科學(xué)化、現(xiàn)代化方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，能夠減少農(nóng)藥的施用，改善生態(tài)環(huán)境條件，防止病害的蔓延和擴(kuò)散，該方法已成為農(nóng)業(yè)應(yīng)用最廣泛的生物技術(shù)。12、脫毒苗、13、細(xì)小病毒活力與溫度的關(guān)系、14、去除第二節(jié)植物病毒病的原理和方

4、法，一、物理學(xué)方法： x射線紫外輻射超短波高溫可使病素鈍化，其中熱處理最常用。 15，1 .熱處理去除植物病毒病的原理，細(xì)小病毒是DNA大分子，細(xì)小病毒進(jìn)入植物細(xì)胞球后與植物細(xì)胞球的DNA一起復(fù)制。 熱處理不能殺死細(xì)小病毒，使細(xì)小病毒活性鈍化，延緩植物體內(nèi)的細(xì)小病毒增殖，使其停止增殖，喪失感染能力。 熱處理是一種物理效應(yīng)，與冷處理一樣，可以加速植物細(xì)胞球的分裂，使植物細(xì)胞球在與細(xì)小病毒繁殖的競(jìng)爭(zhēng)中獲勝。 (16 )、(1)熱水浸漬處理法：將切下的接穗或插秧材料在50左右的溫水中浸漬3-15分鐘到數(shù)小時(shí)。 (2)熱風(fēng)處理法：使盆栽植物在35-40的高溫下生長(zhǎng)發(fā)育，熱處理空氣溫度逐漸上升，然后達(dá)到

5、所需溫度，使云同步保持一定的大氣濕度和光照。 然后，在處理后將新生長(zhǎng)的枝條剪出成穗和砧木，或者熱處理和組織培養(yǎng)結(jié)合更有效。熱處理脫毒，17，2，愈傷組織熱處理脫毒法，方法：從受累株中取出葉(莖片、鱗片、花器均可)進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織的形成，然后將愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，與云同步并用熱處理。 常用處理溫度及處理時(shí)間：溫度： 37-38小時(shí)：處理2周、4周或8周溫度： 50小時(shí)：3-15min。 反復(fù)進(jìn)行傳代兼熱處理，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間(傳代次數(shù)必要試驗(yàn))后，將熱處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)器官分化。 18、果樹作物：桃(無(wú)黃萎病)、蘋果(花葉病)、葡萄(扇葉細(xì)小病毒)、甜橙、香蕉、李子

6、、醋栗、梨、漿果、草莓苔子、草莓等。 蔬菜作物：馬鈴薯、西紅柿、菠菜。 花卉植物：蔓生長(zhǎng)春花、康乃馨、菊花等。 其他植物：曼陀羅等。 19，如煙草愈傷組織兼熱處理鈍化煙草花葉病毒(TMV )和黃瓜花葉細(xì)小病毒(CMV )獲得無(wú)細(xì)小病毒植株效果的方法：a :從患病煙草植株中取出5mm葉片進(jìn)行培養(yǎng)，在MS中添加IAA 2mg/L KT 0.2mg/L的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)治愈b :部分蚊子c :將熱處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS附加IAA 2mg/L KT 2mg/L的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽分化。 d :將d:1cm長(zhǎng)的芽移植到MS附加IAA 2mg/L KT 0.02mg/L發(fā)根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)根分化。 e :獲

7、得完整植株后移植至無(wú)毒土壤栽培，進(jìn)行鑒定。 結(jié)果表明，重復(fù)繼代培養(yǎng)可獲得無(wú)細(xì)小病毒股票。 20，3 .低溫處理去除細(xì)小病毒，處理菊株-5，4-7.5個(gè)月后進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，雖然能夠去除矮化細(xì)小病毒(CSV )和去綠斑駁細(xì)小病毒(CCMV )，但是單獨(dú)的莖尖培養(yǎng)沒(méi)有這個(gè)效果。 二十一、二、使用化學(xué)方法、農(nóng)藥是預(yù)防植物真菌病害的主要方法，理論上也應(yīng)該是預(yù)防細(xì)小病毒的有效方法。 孔雀石綠、硫尿嘧啶、8 -氮雜胍、細(xì)小病毒抑制劑等抑制細(xì)小病毒復(fù)制的化學(xué)物質(zhì)不少。 例如可以舉出Viraz01e (細(xì)小病毒男低音)、蛋白質(zhì)、核酸合成抑制劑等。 由于細(xì)小病毒的復(fù)制與宿主的代謝過(guò)程有著非常密切的關(guān)系，因此很難找到

8、既妨礙細(xì)小病毒復(fù)制又不影響宿主細(xì)胞球正常代謝的藥物。22、不宜用這些個(gè)化合物處理植物整體除細(xì)小病毒效果，培養(yǎng)離體組織、細(xì)胞球、原生質(zhì)體等可能有良好的效果。 在培養(yǎng)基中加入2 -硫尿嘧啶可以去除煙草愈傷組織中的PVY細(xì)小病毒，加入放線菌素d可以抑制原生質(zhì)體中的細(xì)小病毒復(fù)制等。23、植物病毒病鈍化、抑制和清除的一些化合物、24、3、生物學(xué)方法、1、莖尖培養(yǎng)脫毒(1)莖尖培養(yǎng)脫毒的理論基礎(chǔ)a、細(xì)小病毒在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移是通過(guò)維管束系統(tǒng)完成的，在分生組織區(qū)域內(nèi)沒(méi)有維管組織， 細(xì)小病毒是只能通過(guò)細(xì)胞球間絲傳遞的b .在分裂旺盛的分生組織內(nèi)，細(xì)小病毒的復(fù)制會(huì)被旺盛的代謝活動(dòng)所限制的c .植物分生區(qū)域內(nèi)，“細(xì)

9、小病毒鈍化系”的活性比其他部位的活性高d .莖尖分生組織內(nèi)的高濃度植物外源荷爾蒙激素可抑制細(xì)小病毒的增殖。 25、(2)莖尖培養(yǎng)脫毒苗的方法，解剖鏡下剝?nèi)デo尖。 為了提高脫毒效果和成活率，一般以0.20.5mm的莖尖為組織材料進(jìn)行切取培養(yǎng)，植物莖尖對(duì)外來(lái)荷爾蒙激素的反應(yīng)不同。 莖尖大?。哼^(guò)大，接種容易生存，脫毒效果差，過(guò)小，難以生存，脫毒效果高。 優(yōu)選具有12片葉原化學(xué)基，大小優(yōu)選為0.2-0.3mm，超過(guò)0.5mm時(shí)脫毒效果差。 培養(yǎng)基：只要能使莖尖迅速生長(zhǎng)，分化快的培養(yǎng)基就適合脫毒。 一般來(lái)說(shuō)MS好，以一定比例添加分裂素即可。、26、馬鈴薯芽、27、莖尖結(jié)構(gòu)、28、微莖尖、普通莖尖、29、

10、馬鈴薯脫毒苗、30、31、康乃馨不同莖尖培養(yǎng)和康乃馨斑細(xì)小病毒去除情況，32例：煙草花葉細(xì)小病毒(TMV )在以下植物中的熒光反應(yīng)。 煙草： l-4片葉原化學(xué)基未見TMY特異熒光撞擊羽矮牽牛：葉原化學(xué)基未見TMV特異熒光，而葉原莖可見TMV熒光。 番茄：葉原莖1枚未見TMV特異熒光。 因此，在莖尖培養(yǎng)脫毒時(shí)，必須認(rèn)真確定植物莖尖上的細(xì)小病毒分布部位，然后再確定培養(yǎng)莖尖的大小，碰撞羽矮牛：可以提取生長(zhǎng)錐或具有葉原化學(xué)基的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)的煙草：最好在具有4片葉原化學(xué)基的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)。 利用莖尖培養(yǎng)法去除植物病毒病時(shí)，優(yōu)選發(fā)現(xiàn)莖原化學(xué)基中葉原化學(xué)基的數(shù)量與孢子(莖尖)大小的相關(guān)性，便于取材。 34、莖

11、原化學(xué)基0.050.08mm莖原化學(xué)基帶2枚葉原化學(xué)基0.10.2mm莖原化學(xué)基帶4枚葉原化學(xué)基0.30.4mm莖原化學(xué)基帶6枚葉原化學(xué)基0.60.8mm，35、不同細(xì)小病毒種相同，36、甘薯斑點(diǎn)花葉病毒， 縮葉馬賽克細(xì)小病毒：在1.02.0mm以內(nèi)的莖尖分布的中羽毛狀馬賽克細(xì)小病毒：在0.3-1.0mm以內(nèi)的莖尖分布的中馬鈴薯卷葉細(xì)小病毒， y細(xì)小病毒： 1.0-3.0mm以內(nèi)的莖尖分布的x細(xì)小病毒： 0.2-0.5mm以內(nèi)的莖尖g細(xì)小病毒： 0.2-0.3mm以內(nèi)的莖尖s細(xì)小病毒： 0.2mm以下，37，2 .愈傷組織培養(yǎng)脫毒，植物各部位器官和組織培養(yǎng)脫分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，并由愈傷組織再

12、分化產(chǎn)生38、愈傷組織去細(xì)小病毒反應(yīng)歷程、可能的原因是，細(xì)小病毒在植物體內(nèi)不同器官或同一器官的不同組織分布不均一，這些無(wú)細(xì)小病毒細(xì)胞球增殖引起愈傷組織得到脫毒苗的基礎(chǔ)。 在某些愈傷組織細(xì)胞球中，細(xì)小病毒濃度較低，在愈傷組織細(xì)胞球快速分裂的過(guò)程中，細(xì)小病毒復(fù)制能力降低或喪失。 被繼代培養(yǎng)的愈傷組織容易產(chǎn)生抗逆性變異細(xì)胞球，可能出現(xiàn)無(wú)細(xì)小病毒的愈傷組織。 但愈傷組織對(duì)脫毒苗的脫毒途徑易發(fā)生變異，有可能喪失植株本來(lái)的優(yōu)良性狀，當(dāng)然也有可能產(chǎn)生有益的變異，但頻率極低。 39，3 .莖尖微體嫁接脫毒，先對(duì)砧木種子進(jìn)行表面消毒，然后接受1%瓊脂，在MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)芽，以苗齡約2周的幼嫩實(shí)生苗為砧木

13、。 從試管中取出籽生苗，在無(wú)菌條件下切取頂部，上下胚軸部分保留1-1.5cm，去除子葉和腋芽，將根剪短至46cm長(zhǎng)。 從田地和溫室生長(zhǎng)旺盛的成年樹上稍微剪下新的頂端，消毒后，在潔凈臺(tái)上用顯微操作法只取出葉原化學(xué)基13個(gè)莖尖約1mm的大小作為穗使用。 采用倒t字形的水平切口。 嫁接苗在液體濾紙橋培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 成活率為30P%，成功嫁接的植株在移植到土壤前至少需要2片展開的真葉。 40、蘋果微體嫁接莖尖大小和脫毒成功率，41、蘋果不同采訪時(shí)間對(duì)微體嫁接成功率的影響，42、試管微體嫁接在果樹方面發(fā)展最快，(1)嫁接植物不受珠心和有性實(shí)生相關(guān)幼年階段的影響。 (2)由于許多栽培品種通過(guò)嫁接繁殖了許多

14、世代，果樹研究者和栽培者對(duì)這些個(gè)品種自根苗的根冠大小、病蟲害狀況及耐寒性等了解不多。 43、(3)莖尖組織培養(yǎng)繁殖結(jié)合熱處理能產(chǎn)生無(wú)細(xì)小病毒植物，因此許多研究人員認(rèn)為，通常采用嫁接繁殖的果樹應(yīng)該用試管嫁接。(4)試管微體嫁接除培育無(wú)細(xì)小病毒植株外，還能解決難以生根的園藝植物生根問(wèn)題，進(jìn)行嫁接親和性的研究。 44，4 .珠心胚培養(yǎng)脫毒，柑橘類80%以上種類具有多胚性，單胚所占比例小。 柑橘類植物有許多胚品種，一個(gè)種子除一個(gè)合子胚外，還有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)珠心細(xì)胞球無(wú)性胚，稱為珠心胚。 因?yàn)榧?xì)小病毒通常是通過(guò)維管束的麻纖維狀組織進(jìn)行傳播的，而珠心與維管束系統(tǒng)沒(méi)有直接關(guān)系。 珠心組織誘導(dǎo)的植株可以避免細(xì)小

15、病毒的危害。 45、與合子胚不同，由于不是受精的產(chǎn)物，而是從體細(xì)胞球產(chǎn)生的，所以和具有與母體相同遺傳組成的合子胚一樣，由于珠心胚和植株之間沒(méi)有維管組織的連接，即使母體植株感染細(xì)小病毒，珠心胚在無(wú)毒的自然條件下，珠心胚一般不能發(fā)育成熟，而是適時(shí)從種子開始這些個(gè)植株必須是無(wú)細(xì)小病毒的母體無(wú)性系。 珠心胚有3個(gè)特點(diǎn)，46，5 .花藥培養(yǎng)脫毒，花藥培養(yǎng)的首要目的是培育花藥內(nèi)部來(lái)源于花粉粒的單倍體植株，使單倍體倍增，作為育種材料的來(lái)源。 但大量實(shí)驗(yàn)表明，花藥培養(yǎng)所得植株95%以上為開花結(jié)果的多倍體，且生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)于母株。 愈傷組織培養(yǎng)的花藥植株已被證明無(wú)細(xì)小病毒，采用這種方法，不僅可以快速培育大量無(wú)毒植株

16、，而且可省去細(xì)小病毒鑒定工作，在基礎(chǔ)生產(chǎn)中應(yīng)用是一舉兩得的。47、3、分離莖尖培養(yǎng)情況，第一種：生長(zhǎng)停止，接種組織擴(kuò)大，顏色逐漸變化枯死。 這種情況大多是成長(zhǎng)點(diǎn)在分離接種中受傷所致，第二是成長(zhǎng)太慢，莖尖接種后顏色逐漸變成綠色，但沒(méi)有增大，最后變成了綠色的小點(diǎn)。 這是由于生長(zhǎng)素濃度低或培養(yǎng)溫度過(guò)低造成的，可以立即轉(zhuǎn)移到高濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中，或提高培養(yǎng)溫度可以促進(jìn)莖尖的生長(zhǎng)。 48、第三種：生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，接種后莖尖明顯增大，約培養(yǎng)在一起時(shí)莖尖基部會(huì)產(chǎn)生愈傷組織，但未見莖尖延伸，組織顏色也淺。 這是因?yàn)榕囵B(yǎng)莖生長(zhǎng)素濃度高或光弱，溫度高。 因此，必須將培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)素濃度低的培養(yǎng)基中，或者降低溫

17、度，提高光強(qiáng)度來(lái)解決。 否則，時(shí)間延長(zhǎng)愈傷組織顯示生長(zhǎng)分化能力的第四種：生長(zhǎng)正常，營(yíng)養(yǎng)、荷爾蒙激素、溫度、光等各方面條件正常時(shí)，接種的莖尖顏色逐漸變?yōu)榫G色，基部逐漸增大，有時(shí)形成少量愈傷組織，莖尖也逐漸伸長(zhǎng)，培養(yǎng)1個(gè)月左右即可形成無(wú)化學(xué)基素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基莖尖持續(xù)生長(zhǎng)，根系生長(zhǎng)，第49節(jié)無(wú)細(xì)小病毒植株脫毒工藝，一、材料準(zhǔn)備1選擇植物的種類和品種。 以生長(zhǎng)結(jié)實(shí)遺傳性一致的品種為材料，明確了從該品種脫離的細(xì)小病毒在寄主上的位置。 2了解該植物體內(nèi)細(xì)小病毒的種類和危害程度。 根據(jù)植物所具有的細(xì)小病毒的種類，選擇指示植物(敏感植物)。 3決定去除細(xì)小病毒的方法：“莖尖培養(yǎng)”、“熱處理”還是“微體嫁接”。50、2、生長(zhǎng)點(diǎn)的分離和培養(yǎng)(以莖尖培養(yǎng)為例)，1從患病植株上切下頂芽或腋芽。 2決定材料表面的滅菌、滅菌藥劑、濃度、時(shí)間。 3從宿主內(nèi)的細(xì)小病毒分布位置決定切取莖尖的大小。 如果進(jìn)行熱處理，就決定熱處理的溫度、時(shí)間。 4接種成功率與莖的形狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。 例馬鈴薯、百合生長(zhǎng)點(diǎn)呈半圓形，大，易分離。 甘蔗多用戶多輸入多輸出、矮牛、香石竹呈半圓形，比較容易分離。 大麗菊、菊花點(diǎn)平