SDS PAGE電泳ppt課件

1、SDS-page，養(yǎng)病，主要內(nèi)容：一，SDS-page簡(jiǎn)介2，實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備3，實(shí)驗(yàn)階段4，注意事項(xiàng)加入SDS的作用？SDS-PAGE的用途是什么？SDS-page蛋白質(zhì)分離原理？SDS-PAGE的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？豎板傳記電泳裝置，樣品移動(dòng)方向，相加，1。聚丙烯凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲殼雙丙烯酰胺(BIS)在加速劑N，N，N，N四甲酰胺(Bis)中，聚丙烯酰胺凝膠傳記永凍中蛋白質(zhì)的遷移率為它所具有的純?cè)诘鞍踪|(zhì)溶液中加入足夠數(shù)量的SDS，12碳基硫酸根會(huì)帶負(fù)電荷，因此各種蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物會(huì)帶相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量大大超過(guò)蛋白質(zhì)分子的原電荷量，因此，隱藏了不同

2、蛋白質(zhì)之間的原電荷差異，SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后，可以引起構(gòu)象變化，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物形成“雪茄煙”。徐璐不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度相同。SDS消除了蛋白質(zhì)傳記電泳的電荷和分子大小因素，蛋白質(zhì)分子的傳記電泳遷移率主要取決于分子量，但電荷和形狀無(wú)關(guān)。2 .SDS訂閱的作用：3 .SDS-PAGE的用途：主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)是線性關(guān)系。logMW=K-bX式：MW表示分子量，X表示移動(dòng)速率，K，B表示常數(shù)。將分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)數(shù)映射到分子量，就可以得到未知蛋白質(zhì)在相同條件下傳記電泳的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)傳記電泳遷移

3、率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到分子量。分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系，4 .SDS-page蛋白質(zhì)分離原理，分子體效應(yīng)：蛋白質(zhì)分子在SDS-聚丙烯凝膠中傳記游泳時(shí)，傳記游泳遷移率主要取決于分子量，分子量越小，遷移率越快。凝膠由分離膠和濃縮膠組成。上層是濃縮膠，明膠孔徑大，分子篩效果差，其pH值為6.8，由于緩慢離子形成的高壓梯度，跨性別蛋白質(zhì)分子在游泳中壓縮到了很薄的一層，分辨率大大提高。樓下是分離膠，凝膠孔徑小，有分子篩效果，pH為8.8，跨性別蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷幾乎一致，游泳速度主要取決于分子量。蛋白質(zhì)分子遷移規(guī)律：蛋白質(zhì)分子越小，遷移率越快?；旌蠘悠贰⒖啄z、按分子大小分離、傳記電泳方向、傳記電泳、小分

4、子、大分子、5、SDS-page優(yōu)缺點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)：許多蛋白質(zhì)由血紅蛋白、色氨酸等兩個(gè)或多個(gè)肽鏈組成，它們是由變性和強(qiáng)還原劑的作用引起的或單個(gè)肽因此，對(duì)于這些蛋白質(zhì)，SDS-PAGE不是完整蛋白質(zhì)的分子量，而是嬰兒或單個(gè)钚鏈的分子量。，ii。實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備，1 .試劑：(1) 30%丙烯酰胺(2) 10%SDS (3)分離膠緩沖區(qū)：3.0mol/L Tris-HCl pH 8.8 (4)濃縮膠緩沖區(qū)3360.5mol父緩沖區(qū)：Tris實(shí)驗(yàn)器材：垂直板傳記永動(dòng)機(jī)、傳記永動(dòng)機(jī)脫色、搖動(dòng)移動(dòng)槍濾紙大Petri盤(pán)子、垂直板傳記永動(dòng)機(jī)、電動(dòng)永動(dòng)機(jī)(1)、電動(dòng)永動(dòng)機(jī)、推桿(2)、推桿(3)、橡膠墊(4)實(shí)驗(yàn)

5、階段，1 .安裝塑料模具。2.分離膠的制備及添加：按照規(guī)定的比例準(zhǔn)備分離劑。充分混合分離膠后，小心倒入塑料模具，在明膠上復(fù)蓋一層水，水平固定在膠體凝固(聚合時(shí)間因室溫而異)。3.倒入水，用濾紙吸掉剩下的水分。4.濃縮膠的制備及添加：按規(guī)定的比例準(zhǔn)備濃縮膠。倒入混合的濃縮膠(注意不要產(chǎn)生氣泡)，將梳子底部和分離膠的前向距離約1厘米，水平放置，直到膠體變硬。準(zhǔn)備分離膠，準(zhǔn)備濃縮膠，相加：聚合濃縮溶液后，小心地取出樣品梳子，將電極緩沖液填充傳記游泳罐前后凹槽，將試件溶液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(添加量按每個(gè)品種規(guī)定)放入試件孔。7.傳記電泳：垂直板傳記電泳：恒壓傳記電泳，初始電壓為80V，進(jìn)入分離膠時(shí)曹征為1

6、50200V，溴酚藍(lán)移至膠底時(shí)停止傳記電泳。、濃縮pH 6.8、分離打開(kāi)蓋子，取出傳記游泳模塊，打開(kāi)密封夾，取出玻璃板(凝膠)。取出玻璃板放入水中，用明膠(綠色)輕輕撬開(kāi)玻璃板，將凝膠推進(jìn)水中。9.染色：用至少5倍的體積染液浸泡凝膠，在緩慢搖晃的平臺(tái)上室溫1h左右。10.脫色：用水沖洗多次，用脫色液脫色，蛋白質(zhì)帶清晰。4，注意事項(xiàng)，(1)安裝傳記游泳插槽時(shí)，應(yīng)均勻用力，防止玻璃板破裂，防止緩沖液泄漏。(2)應(yīng)用硫酸銨TEMED催化劑后，明膠1520 min可以觀察凝膠的形成，但至少需要40 min牙齒，以確保95個(gè)以上的單鏈聚合生長(zhǎng)短，適當(dāng)?shù)目讖酱笮?。梳子要輕輕地拔出一次。否則，附加插槽的完整性將受到損害。(4)聚合體的最佳溫度為23 25，移植前