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文檔簡介
1、單位及實驗室名稱項 目編號:ASJYK-LAB-C-P-53日期:2015年6月21日版本:第一版,第1次修訂第1頁,共3頁檢驗科HPV-DNA擴增熒光定量檢測標準操作程序1.目的:明確高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測的操作規(guī)程,指導(dǎo)檢驗人員正確進行巨細胞病毒核酸定量的檢測。2.適用范圍:2.1適用于進行高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測的檢驗人員。2.2適合儀器:LightCycler480型核酸擴增熒光檢測儀2.3方法原理:采用PCR方法結(jié)合熒光探針的擴增技術(shù)2.4樣品要求:宮頸脫落細胞3.職責(zé):實驗操作人員應(yīng)嚴格按操作規(guī)程進行實驗。4.試劑來源:潮州凱普生物化學(xué)有限公司高危型人乳頭瘤病毒核酸定
2、量檢測試劑盒。5.質(zhì)控物:陰性、陽性對照及陽性參控品系列均來源于試劑盒6.標準操作:6.1 試劑準備(在試劑準備區(qū)操作)6.1.1將試劑盒及其它所需試劑置室溫解凍(臨用前取出,用后立即放回冰箱,反復(fù)凍融不可超過三次),取出PCR MIX,室溫下避光解凍,上下顛倒混勻后,8000轉(zhuǎn)/分鐘10s從試劑盒中取出DVA聚合酶,8000轉(zhuǎn)/分鐘lOs。6.1.2根據(jù)當(dāng)次實驗標本量,取出相應(yīng)試劑(1管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA聚合酶)總的需求量于一管中(其余隨即放回原溫度保存),如所需要的管數(shù)為n (n=標本數(shù)+1空白管對照+1管陽性對照) 取PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本制備區(qū)。6.2樣
3、本處理(在樣本處理區(qū)進行)6.2.1.取宮頸脫落細胞樣本0. 5ml1ml(如果細胞數(shù)量少可以加大體積到2m1)6.2.2. 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘6.2.3.棄上清,加入0.5m1細胞保存液重懸細胞6.2.4. 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘,盡量棄干凈上清6.2.5.每樣本加入50ul細胞裂解液,充分振蕩重懸細胞,煮沸10分鐘。6.2.6. 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,保留上清備用(上清中為釋放的DNA)。6.2.7取上清2.0ul作為PCR擴增的模板,其余保存于一206.2.8在對應(yīng)的PCR反應(yīng)管中分別加入2ul處理好的樣本DVA,空白對照、陽性對照,蓋緊管蓋,稍做離心(反應(yīng)總體
4、積為2o u 1/人份,每次反應(yīng)需要設(shè)置一個陽性對照以及一個空白對照)。轉(zhuǎn)移到檢測區(qū),放入相應(yīng)的熒光PCR檢測儀內(nèi),記錄樣本擺放順序6.3 PCR擴增(在擴增區(qū)操作)6.3.1打開穩(wěn)壓器電源,再打開計算機電源。6.3.2 打開擴增儀電源,按儀器操作規(guī)程進入擴增循環(huán)條件設(shè)定。6.3.3設(shè)置四種熒光檢測通道的報告熒光、淬滅熒光;Passive Reference選擇none(見表1)ASJYK-LAB-C-P-53 第2頁,共3頁表1: 設(shè)置四種熒光檢測通道Detector NameTargetReporter DyeQuencherFAM12種高危型HPV (31, 33, 35,39, 45,
5、 51, 52, 56, 58, 5966,68)FAMnoneHEMHPV16HEX/JOEnoneROXHPV18ROX/Red 610noneCy5-globinCy5none6.3.4將循環(huán)條件設(shè)定為ProgramCyclesTemperature ()IncubationTime(min:sec)TemperatureTransitionRate(/sec)AcquisitonModeAnalysisMode119510:00min20NoneNone2459515sec20NoneNone6060secSingleQuantification31385sec20NoneNone6.
6、3.5檢查反應(yīng)管是否蓋緊,以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。6.3.6將待反應(yīng)的PCR反應(yīng)管放入擴增儀中,并根據(jù)實際情況和儀器操作規(guī)程在程序中設(shè)定好樣孔位置。6.3.7按儀器操作規(guī)程開始循環(huán)。6.3.8擴增結(jié)束后取出PCR反應(yīng)管,關(guān)閉擴增儀電源,反應(yīng)管直接放入焚燒垃圾桶內(nèi)。ASJYK-LAB-C-P-52 第3頁,共3頁6.3.9分析數(shù)據(jù),在Analysis Notes窗口中注明檢測基線值、試劑批號、陽參批號等相關(guān)信息,進行結(jié)果分析。6.3.10關(guān)閉計算機。6.4檢驗結(jié)果判斷:6.4.1基線,閡值的設(shè)定:基線的確定為:取3-15個循環(huán)的熒光信號:閾值設(shè)定:使閾值線超過正常陰性對照品擴增曲線(無規(guī)則的噪
7、音線)的最高點,且Ct值為Under6.4.2質(zhì)控對照1陰性對照Ct值均應(yīng)顯示為Undet2陽性對照Ct值363內(nèi)對照-globin在Cy5通道Ct值40符合以上三個條件,此反應(yīng)是為有效6.4.3結(jié)果判斷1樣本在FAM、HEX、ROX通道Ct值顯示為Undet,內(nèi)對照-globin在Cy5通道Ct值40,判斷為陰性2樣本在FAM、HEX、ROX通道Ct值40, 內(nèi)對照-globin在Cy5通道Ct值40判斷為陽性 3若樣本在FAM、HEX、ROX通道40Ct值45的樣本建議重做,重做結(jié)果Ct值40者為陽性,否則為陰性7.支持性文件:7.1 高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒(PCR一熒光探針法)說明書(潮州凱普生物化學(xué)有限公司)7.2 檢測結(jié)果報告程序。
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