組織固定處理與包埋常見問題與對策.ppt

1、組織固定處理及包埋常見問題與對策,馬恒輝 周曉軍 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 病理科,本文就組織固定處理及包埋常見的問題與對策，進(jìn)行分析與討論，旨在與技術(shù)人員一起學(xué)習(xí)交流，以提高組織固定處理及包埋的質(zhì)量，為組織切片和染色以及病理診斷提供有力的保證。,1固定,組織固定的目的在于保存組織。 組織離體后要盡快用固定液浸泡，達(dá)到滲透組織的目的，并使組織具有一定的硬度。,這樣不僅可以防止組織的自溶改變，而且，還可以防止組織中的有效成分，在其后的一系列處理改變性狀。,所以，固定標(biāo)本尤其是大塊或條索狀標(biāo)本時，要盡可能的保持生活時的狀態(tài)，不得扭曲標(biāo)本。,目前，10%中性緩沖福爾馬林是大家普遍公認(rèn)的應(yīng)用范圍最廣的常用固

2、定液之一。 它對大多數(shù)病理標(biāo)本的具有良好的固定作用，穿透速度快，組織硬化小。,既能作為短時間固定標(biāo)本的需要，又能滿足長時間保存標(biāo)本的需要。,組織在10%中性緩沖福爾馬林中，可以保存數(shù)月而不會發(fā)生不良變化，且細(xì)胞核和細(xì)胞漿的微細(xì)部分均保存良好，對大多數(shù)免疫組化反應(yīng)也是適用的。,圖1：結(jié)腸組織呈現(xiàn)保存完好的結(jié)構(gòu),該切片取之于外科手術(shù)病人標(biāo)本，標(biāo)本離體后立即投入固定液。 固定液首先接觸上皮部分，有效地保存了上皮及絨毛結(jié)構(gòu)，并快速有效地阻止了細(xì)胞的自溶和腐敗。,圖2：腺體結(jié)構(gòu)欠完整,該組織切片取之動物實驗的消化道腸黏膜，自溶引起上皮與基底部分脫落和分離， 切片中的這些改變可能是由于腸道細(xì)菌成分腐敗所致

3、。,圖3：肺組織切片，組織結(jié)構(gòu)不良,由于沒有良好的固定，組織正常的結(jié)構(gòu)及相互關(guān)系在組織處理過程中不復(fù)存在。,如果組織固定不好，處理不良，染色也會受到影響。 所以，及時的固定，及充足的固定時間是保證組織處理質(zhì)量優(yōu)良的基本要素。,圖4：肺組織固定良好，組織結(jié)構(gòu)完整,圖5：腸黏膜組織沒有固定好,細(xì)胞成分未被有效保存，染色差，特別是腺體部分的細(xì)胞核與細(xì)胞漿缺乏明顯對比，一片深染。,目前，不少科室在使用自動化儀器設(shè)備時，因為程序設(shè)置不當(dāng)，標(biāo)本沒有足夠的時間在固定液停留，有的甚至用乙醇脫水直接替代了固定步驟。,切記，組織必須在固定液停留足夠的時間，才能獲得良好的固定效果。,在戊二醛、Helly、Zenke

4、r、Bouin中固定的組織，必須及時取出沖洗，保留在適當(dāng)?shù)囊后w中。 如果放置時間過長，可能會導(dǎo)致固定過度，甚至影響染色。,圖6：腸黏膜組織固定良好,腺體結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞清晰，細(xì)胞核與細(xì)胞漿染色對比鮮艷。,2組織處理,組織處理包括三個主要步驟：脫水、透明和浸透； 目的在于從組織標(biāo)本中移去多余的水分，引入一種遇熱融化遇冷凝結(jié)的介質(zhì)（比如石蠟），以利于組織切片。,組織處理的方式通常有二種。 一種是開放式，即標(biāo)本從一個液體槽交換轉(zhuǎn)移到另一個液體槽。 一種是密閉式，即標(biāo)本始終停留在一個固定的處理槽內(nèi)，液體通過真空泵吸進(jìn)吸出產(chǎn)生運動，從而對組織進(jìn)行處理。,開放式存在著一定的安全隱患，而密閉式則相對安全。 密

5、閉式通過控制面板的數(shù)字按鈕，對標(biāo)本進(jìn)行電腦智能化控制，標(biāo)本始終位于一個濕潤的環(huán)境，即標(biāo)本處理室內(nèi)，不會發(fā)生人為的干燥干涸現(xiàn)象。,另外，配備自動報警裝置，減少室內(nèi)有害液體的直接排放。 密閉式的局限性在于，并非所有的液體都能適用于機(jī)器 。 密閉式處理模式能夠提供加溫、加壓及攪拌等多項功能。,不過，雖然加溫加壓及攪拌等功能可以縮短組織標(biāo)本的處理時間，但是在使用時一定要加以小心。 尤其是處理活檢小標(biāo)本時，更應(yīng)如此。,如果把富含脂肪的組織與手術(shù)標(biāo)本和活檢小標(biāo)本放在一起混合處理，效果不會理想。 反之，如果標(biāo)本處理時間太短，也不能得到良好的組織處理效果。除非是小的、固定好的標(biāo)本，才有可能得到良好的組織處理效

6、果。,無論處理模式是開放的還是密閉的，組織處理的過程均應(yīng)保持清潔，使用的液體應(yīng)定時更換，保持工作的液面在指定的高度，不得高于或低于刻度線。,裝有標(biāo)本的包埋盒最好集中整齊放在提籃內(nèi)，不能隨意地放在標(biāo)本處理室內(nèi)，以免影響液體與組織之間的交換。,用于浸蠟的石蠟溫度，最好控制在高于石蠟熔點的24左右，并且要每天檢查測量并記錄溫度。 防止因溫度過高，造成組織處理過度，使組織發(fā)生硬化或破碎等不良改變。,21脫水,脫水不徹底是組織處理最常見的問題之一。 脫水的原理和機(jī)制有二方面。 一是使用親水性的試劑，從組織中吸收水分； 一是使用溶水性的試劑，不斷從組織中溶解組織中的液體。,乙醇是常規(guī)組織制片最常用的脫水劑

7、，如果時間寬裕，可從低濃度開始多換幾道，這樣可防止組織脫水過度造成扭曲。 如果時間緊湊，可從95%乙醇開始，接著行無水乙醇脫水。,通常的方案是從6065%乙醇開始，換二道95%乙醇，二道無水乙醇。 如果使用的乙醇濃度高于70%，中性緩沖福爾馬林中的磷酸鹽，將會在組織中沉積，沉積的結(jié)晶會妨礙組織切片。,所以，組織脫水時應(yīng)盡量避免在高濃度的乙醇如無水乙醇中停留的時間過長，否則會造成組織過硬、扭曲，影響切片。,圖7：浸蠟不好,圖8：浸蠟不好,蠟塊中的淋巴結(jié)組織，沒有充分脫水和透明，所以浸蠟不好。 白色區(qū)域是軟的，表示該區(qū)域石蠟沒有浸透，蠟塊將難以切片。,22透明,著色不均勻，大多數(shù)是因為透明或浸蠟液

8、中混有一定的水分。 組織開放式處理，空氣中濕度較大； 組織密閉式處理，固定液中的水分，或加溫引起的水珠，滴入液中。,這類問題在小標(biāo)本中比較多見，如皮膚、乳頭狀瘤、和胃、腸黏膜活檢等標(biāo)本。 可以改用對水寬容度性大一些的透明劑，如用甲苯替代二甲苯。,圖9：著色不均,圖10：著色不均,腸黏膜活檢小標(biāo)本，深部肌層和腺體有著色不均的現(xiàn)象。 部分區(qū)域組織發(fā)白，可能是因為浸蠟時有水珠滴入，影響浸蠟質(zhì)量，導(dǎo)致切片染色不均。,23浸蠟,真空和加溫是現(xiàn)代化組織處理儀器提供的有利條件和手段，但是應(yīng)該慎用。 不少單位在使用現(xiàn)代化的儀器進(jìn)行組織處理時，因使用的程序不當(dāng)，處理的標(biāo)本不是過度，就是不足。,根據(jù)我科使用的情況

9、，建議推薦使用如下程序，便于大家在設(shè)計使用時參考：,（1）固定程序二道，固定液為10中性緩沖甲醛液，時間為45min ，設(shè)置加溫50，加壓，攪拌。,（2）脫水程序八道，前四道為95乙醇，后四道為100乙醇，時間均為60min ，僅在最后一道的95和100乙醇設(shè)置加壓、攪拌。,（3）透明程序二道，第一道為硬脂酸和石蠟，比例為3:2，第二道為硬脂酸和石蠟，比例為2:3，時間均為60min ，均設(shè)置加溫65，加壓，攪拌。,（4）浸蠟程序二道，均為5658純蠟，時間均為60min ，設(shè)置加溫65，加壓，攪拌。,3包埋和標(biāo)本的定位,組織的切片質(zhì)量好壞、是否利于切片，完全依賴于組織處理的每一個步驟，而每一

10、個步驟的質(zhì)量又緊緊于前一個步驟密切有關(guān)。,雖然良好的組織切片需要合適的組織固定、準(zhǔn)確的組織處理和精致的組織切片保證。,但是，最容易毀壞組織切片的步驟，是不合適的組織包埋，即組織不合適的擺放，組織不合適的排列方向。,因此，組織病理技術(shù)人員，必須熟悉每一個包埋組織標(biāo)本的各項元素，認(rèn)真分析它們的結(jié)構(gòu)，仔細(xì)判斷它們在包埋模中的位置。,多與病理醫(yī)師溝通，了解組織的性質(zhì)，對需要標(biāo)記的組織，可用印度墨水進(jìn)行標(biāo)記，或在塑料包埋模的邊筐上寫上記號，以便包埋操作。,包埋操作時具體的注意事項：先取大小合適的不銹鋼模型，注入蠟液置于熱臺上，液面剛好與模型的上緣平齊，不得低于或高于此限。,取出包埋盒內(nèi)的組織，校對正確后

11、用干凈的熱鑷子將所有組織悉數(shù)放入模型的底部，,待組織與模型內(nèi)的蠟液充分融合后，按要求排列后迅速移動模型至冷臺，至底部石蠟剛開始凝固，用鑷子輕壓組織數(shù)秒，,待組織埋平后，迅速蓋上包埋盒注上蠟液，約過10sec15sec，包埋盒與模型周邊的蠟液凝固后，再次補充注入少許蠟液，以增加包埋盒的穩(wěn)固性，防止切片時因包埋盒松動引起切片震顫。,注意液面高度不得高于包埋盒上緣，加蓋包埋盒時一定要保持與模型底部平面平行，無前后左右傾斜的現(xiàn)象。,用塑料包埋盒包埋組織時，應(yīng)注意待包埋模型底部石蠟開始凝固后，蓋上包埋盒，,待其四周凝固后，進(jìn)行二次加蠟。 這樣的目的是使得包埋盒與組織蠟塊接觸更加穩(wěn)固，減少和防止切片時產(chǎn)生

12、振顫或包埋盒與組織蠟塊脫落。,另外，還需注意的是二次加蠟不于過滿，否則蠟塊不能與切片機(jī)夾具完全吻合，造成切片時松動震顫，影響切片質(zhì)量。,圖11:包埋正確,包埋正確，側(cè)面觀，組織蠟塊與包埋盒平行。,圖12:包埋不正確,因操作時動作太慢，蠟?zāi)毯蠹由w包埋盒，側(cè)面觀，組織蠟塊與包埋盒不平行，不利于切片操作。,圖13:二次加蠟正確,圖14所示：二次加蠟不正確,加的蠟太少，切片時模具夾不緊會產(chǎn)生震顫。,圖15:二次加蠟不正確,加的蠟太多，切片時模具夾不緊亦會產(chǎn)生松動。,在組織定位后石蠟剛開始冷卻時，要輕壓組織，否則，組織切片就不容易切全，造成切片不完整。,硬組織，尤其是脫鈣后的骨組織，包埋方向顯得尤為重

13、要，否則，很難得到一張完整的組織切片。如果沿對角線包埋，情況可能會改善很多。,因為切片刀是一點一點地接觸到組織，而不是象橫過來包埋時，一下子全接觸到骨組織。,包埋時最好養(yǎng)成一個良好習(xí)慣，打開一個包埋盒，包埋一份組織，包好一個再打開下一個。,千萬不要同時打開好幾個包埋盒，同時包埋，這樣容易手忙腳亂，更容易造成組織混淆。 每包埋完一個組織，有條件的話更換一把鑷子，或者用軟布檫拭一下，防止組織尤其是破碎小組織殘留造成混淆污染。,這是一個嚴(yán)重的問題，極易導(dǎo)致錯誤診斷，不容忽視。,石蠟組織包埋后，蠟塊要盡快冷卻，形成蠟塊最小的結(jié)晶體，既減少石蠟的疏松，又增加石蠟的密度。,小的結(jié)晶體有助于使石蠟緊緊包裹被

14、包埋的組織，這將會為良好切片提供有利保證。,因為如果包埋后石蠟與組織分離，留有間隙，切片就難以完整。,建立包埋的質(zhì)控，每天記錄包埋蠟塊總數(shù)，核對每個包埋盒內(nèi)組織塊數(shù)。,總的蠟塊數(shù)與切片數(shù)，在染色結(jié)束后應(yīng)該核對一下，切片與對應(yīng)號碼的蠟塊進(jìn)行比較：,檢查是否一致，有無差錯，是否切全，有無遺漏，標(biāo)簽是否有誤等。 此為檢查最重要的步驟，工作中不可或缺。,組織的定位或方向是包埋的重要步驟，否則，不恰當(dāng)?shù)慕M織定位或排列方向會導(dǎo)致切片時毀壞組織。,許多組織大而平，易于包埋定位，只要將最大最平的組織面朝下置于包埋模即可。,特殊需要的組織面可用墨汁標(biāo)記，以便包埋時準(zhǔn)確定位。,圖16:多塊點狀或碎塊組織,多塊胃黏

15、膜，包埋在同一蠟塊中，正確的包埋模式應(yīng)該以線狀排列為佳。,圖17:多塊點狀或碎塊組織,三枚淋巴結(jié)組織，包埋在同一蠟塊中，正確的包埋模式應(yīng)該以線狀排列為佳。,圖18:多塊點狀或碎塊組織,四枚淋巴結(jié)組織，包埋在同一蠟塊中，正確的包埋模式應(yīng)該以線狀排列為佳。,圖19:多塊點狀或碎塊組織,顯示的是4 枚淋巴結(jié)，沿直線狀分兩行排列。,圖20:多塊前列腺電切碎組織。,不要將組織隨意擺放在蠟塊中，而應(yīng)小心地將它們沿直線狀排列，沿長軸方向平行排列，確保病理醫(yī)生閱片時不遺漏組織。,以下蠟塊顯示的是多塊組織不正確的包埋。 這種類型的包埋使得切片比較困難，不利于將組織同時切全，容易給病理醫(yī)生閱讀切片時造成遺漏或忽略觀察組織的機(jī)會。,圖21:堆擠,圖22:排列分散,圖23：方向凌亂,圓形、橢圓形及方形、四邊形等組織正確的包埋模式。 以組織最大橫徑與蠟塊最大橫徑平行一致為佳。,圖24：圓形,圖25：橢圓形,圖26：正方形,圖27：長方形,圖28：四邊形,圖29：梯形,圓形、橢圓形及方形、四邊形等組織不正確的包埋模式如下。,圖30：堆擠,外院會診的蠟塊，包埋時二塊圓形組織上下堆在一起，組織切片時易擠壓，增加切片技術(shù)的難度。,圖31：堆擠,皮膚痣標(biāo)本，二塊組織上下堆積，增加切片的距離，切片容易破裂。,圖32：豎立,豎立包埋的組織，切片時容易出現(xiàn)擠壓難以展片。,闌尾等腔性組織或囊壁樣組織的正確包埋模式。,圖